公开/公告号CN101688231A
专利类型发明专利
公开/公告日2010-03-31
原文格式PDF
申请/专利权人 檀国大学校产学协力团;
申请/专利号CN200880000802.5
申请日2008-12-16
分类号C12Q1/00;
代理机构北京银龙知识产权代理有限公司;
代理人钟晶
地址 韩国京畿道
入库时间 2023-12-17 23:52:51
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2014-02-19
授权
授权
2010-05-12
实质审查的生效 IPC(主分类):C12Q1/00 申请日:20081216
实质审查的生效
2010-03-31
公开
公开
技术领域
本发明涉及由茶碱调控其靶特异性核糖核酸的取代活性的变构反式剪接I型核酶。
背景技术
已做出了热切的尝试来开发基因治疗技术作为新的治疗技术来治疗无法治愈的人类疾病,它通过对分子遗传原因以及由于基因突变导致的不可治愈的人类疾病的因素进行研究。然而,在目前的基因治疗技术中存在许多待解决的问题。
已经得到广泛用于治疗遗传疾病的基因治疗是通过将相应于突变基因的正常基因转移到患者的适当的细胞而做出的(摩根,R.A.与安德森,W.F.1993,人类基因治疗.生物化学年评.62:191-217(Morgan,R.A.and Anderson,W.F.1993,Human gene therapy.Annu.Rev.Biochem.62:191-217))。理论上来说为了通过这种基因治疗获得治疗效果,应该在适当的体内调控机制下产生所期望的基因产物。然而,由于在病毒颗粒中的转运子基因的大小的限制,几乎所有的基因治疗都是通过将所期望的基因以cDNA(互补脱氧核糖核酸)的形式进行转移而做出的,这种转移在各种不同的启动子或者在基因片段中基因自身的启动子的调控下进行。因此,病毒颗粒不包括各种遗传成分,这种遗传成分可以调控在病毒颗粒中的和它们自身的转运基因,并且不会使疾病的治疗所期望的效果最大化。
此外,用于基因表达的启动子等可能不符合人们期望地激活其它类型的启动子,并且也可能通过改变染色质结构而增加基因所转移到的细胞的不同基因的表达(例如,原癌基因(protooncogene))。而且,正常基因的转移根本不会影响患者细胞内突变基因产物的减少。当突变基因产物确实具有占主导的负面效果时,通过传统的方法的治疗效果可能不会得到最大化。因此,需要一种新颖的治疗,该治疗诱导正常基因的良好调控的表达,并同时抑制突变基因的表达(兰,N.、赫瑞,R.P.、李,S.W.、史密斯,C.A.和萨伦格,B.A.1998,红细胞前体中的镰刀状b-珠蛋白mRNA的核酶介导的修复.科学280:1593(Lan,N.,Howrey,R.P.,Lee,S.W.,Smith,C.A.,and Sullenger,B.A.1998,Ribozyme-Mediated Repair of Sickle b-Globin mRNAs in Erythrocyte Precursors.Science 280:1593);皮拉克托,L.A.、达拉,C.和伍德,M.J.1998,三核苷酸重复的核酶介导的反式剪接.自然·遗传学18:378-381(Phylactou,L.A.,Darrah,C.,and Wood,M.J.1998,Ribozyme-mediated trans-splicing of a trinucleotide repeat.Nat.Genet.18:378-381);罗杰斯,C.S.、瓦努瓦,C.G.、萨伦格,B.A.和乔治,A.L.Jr.2002,使用反式剪接核酶对突变氯通道的功能性修复,临床研究期刊.110:1783-1789(Rogers,C.S.,Vanoye,C.G.,Sullenger,B.A.,and George,A.L.Jr.2002,Functional repair of a mutant chloride channel using a trans-splicing ribozyme,J.Clin.Invest.110:1783-1789);信,K.S.、萨伦格,B.A.和李,S.W.2004,在人类癌细胞中由于对突变p53RNA的靶向修复造成的并由核酶调控诱导的细胞调亡.分子治疗学.10:365-372(Shin,K.S.,Sullenger,B.A.,and Lee,S.W.2004,Ribozyme-mediated induction of apoptosis in human cancer cells by targeted repairof mutant p53 RNA.Mol Ther.10:365-372);宇,K.J.、金姆,J.H.和李,S.W.2003,在丙型肝炎病毒内部核糖进入位点表达细胞中核酶介导的通过靶向反式剪接的选择性诱导.分子治疗学.7;386-395(Ryu,K.J.,Kim,J.H.,and Lee,S.W.2003,Ribozyme-mediated selective induction of new gene activity in hepatitis C virusinternal ribosome entry site-expressing cells by targeted trans-splicing.Mol.Ther.7;386-395))。
已报导来自嗜热四膜虫的I型内含子核酶通过对细菌细胞和人类细胞内以及在活体外条件下的独立的转录物进行反式剪接来将两种独立的转录物彼此连接(冰,M.和切赫,T.1986,一个结合位点决定了四膜虫rRNA前体自我剪接、反式剪接以及RNA酶活性的序列特异性.细胞47:207-216(Been,M.andCech,T.1986,One binding site determines sequence specificity of Tetrahymenapre-rRNA self-splicing,trans-splicing,and RNA enzyme activity.Cell 47:207-216);萨伦格,B.A.和切赫,T.R.1994,核酶介导的通过靶向反式剪接对缺陷mRNA的修复.自然371:619-622(Sullenger,B.A.and Cech,T.R.1994,Ribozyme-mediated repair of defective mRNA by targeted,trans-splicing.Nature371:619-622);琼斯,J.T.、李,S.W.和萨伦格,B.A.1996,对核酶反应位点进行标记以追踪哺乳动物细胞内的反式剪接.自然·医学.2:643-648(Jones,J.T.,Lee,S.W.,and Sullenger,B.A.1996,Tagging ribozyme reaction sites to followtrans-splicing in mammalian cells.Nat Med.2:643-648))。所以,以I型内含子为基础的反式剪接核酶以疾病相关基因转录本或者某些不在正常细胞中表达、只在感染细胞中特异地表达的某些RNA为靶;并随后通过将不正常的RNA更正为正常RNA或者将与疾病有关的基因转录本取代为新的治疗性基因转录本来诱发细胞重组。因此,反式剪接的核酶对疾病有非常的特异性并且可以用作稳定的基因治疗技术。也就是说,由于RNA的取代仅在靶基因转录本存在情况下进行的,所以期望的基因产物可能只在适当的空间和时间才产生。特别地,由于用RNA取代来靶向细胞内表达的RNA,并随后用期望的基因产物来取代该目标RNA,所以调控待表达基因的量是可能的。而且,由于反式剪接的核酶起到除去疾病特异性RNA的功能并同时诱导所期望的治疗性基因产物的表达,因此反式剪接的核酶能使疗效加倍。
RNA具有合适的化学特性和结构特性以起到人为开关或自然开关的作用(曼达尔,M.、伯泽,B.、巴瑞克,J.E.、温克勒,W.C.以及布瑞克,R.R.2003,核开关调控枯草芽孢杆菌和其他细菌内基础生化途径.细胞113:577-586(Mandal,M.,Boese,B.,Barrick,J.E.,Winkler,W.C.,and Breaker,R.R.2003,Riboswitches control fundamental biochemical pathways in Bacillus subtilis andother bacteria.Cell 113:577-586))。通过利用这些特性,通过对特异性地靶RNA适体结合到核酶上的小分子或者蛋白质的特定结构活序列进行识别而得到的酶被称为适体酶(aptazyme),所述核酶为具有酶活性的RNA(布瑞克,R.R.2002,改造过的变构核酶作为生物传感器的组成.生物技术新见13:31-39(Breaker,R.R.2002,Engineered allosteric ribozymes as biosensor components.Curr.Opin.Biotechnol.13:31-39))。对于适体酶,核酶和适体通过通信模块而连接。所述通信模块具有这样的结构,该结构起到中间体的作用来将在适体中产生的信号转移到核酶中。(科特斯堡,A.和绍库普,G.A.2002,一种用于RNA折叠和催化的多功能通信模块.核酸研究.30:4599-4606(Kertsburg,A.andSoukup,G.A.2002,A versatile communication module for controlling RNA foldingand catalysis.Nucleic Acids Res.30:4599-4606))。
当适体感应到配体时,这些信号通过通信模块转移到核酶以对无活性的核酶进行变构修饰,从而诱发活抑制核酶的活性。也就是说,核酶的活性可以通过某些内源性配体活外源性配体进行调控。
对于目前的用于治疗癌症的方法而言,需要发展一种方法,其中仅能将癌细胞特异性地清楚。通过将RNA适体连接到核酶上来制备变构核酶(适体酶),这种制备利用了这样的事实,RNA到其它的配体等的连接改变了核酶的结构。变构核酶利用小分子作为配体的确切的机理还未被知晓,但是人们认为变构核酶的机理是通过连接到配体上而进行的,以在结构上稳定核酶或破坏核酶的稳定(科特斯堡,A.和绍库普,G.A.2002,一种用于RNA折叠和催化的多功能通信模块.核酸研究.30:4599-4606.(Kertsburg,A.and Soukup,G.A.2002,Aversatile communication module for controlling RNA folding and catalysis.NucleicAcids Res.30:4599-4606);荷西,A.M.、绍库普,G.A.和布瑞克,R.R.2001,效应子通过变构核酶的协同连接.核酸研究.29:1631.1637(Jose,A.M.,Soukup,G.A.,and Breaker,R.R.2001,Cooperaive binding of effectors by an allostericribozyme.Nucleic Acids Res.29:1631.1637);小泉,M.、绍库普,G.A.、科尔,J.N.和布瑞克,R.R.1999,对第二信使cGMP和cAMP应答的核酶的变构选择.自然结构生物学.6:1062.1071(Koizumi,M.,Soukup,G.A.,Kerr,J.N.,and Breaker,R.R.1999,Allosteric selection of ribozymes that respond to the second messengerscGMP and cAMP.Nature Struct.Biol.6:1062.1071)。在较早阶段就研究了适体酶使用小分子作为配体,但是目前对适体酶与蛋白质或寡聚核苷酸的互相作用进行了研究。
人端粒酶反转录酶(Human telomerase reverse transcriptase,hTERT)是用来调控癌细胞的永生和增殖的因素之一。在无限繁殖的生殖细胞、造血细胞和癌细胞中,端粒酶具有80-90%的端粒酶活性,而在癌细胞周围的正常细胞不具有这种活性。(布莱恩,T.M.和切赫,T.R.1999,端粒酶和它对染色体末端的维持.细胞生物学新观点.11;318-324(Bryan,T.M.and Cech,T.R.1999,Telomerase and the maintenance of chromosome ends.Curr.Opin.Cell Biol.11;318-324))。通过利用端粒酶的这些特性,已有热切的研究还开发一种与细胞生长相关的端粒酶抑制剂,以抑制癌细胞的增殖(布莱恩,T.M.、恩格勒祖,A.,Gupta,J.、巴杰蒂,S.,和瑞德尔,R.R.1995,在没有可测到的端粒酶活性的情况下永生人类细胞中端粒的延长.欧洲分子生物学学报.14;4240-4248(Bryan,T.M.,Englezou,A.,Gupta,J.,Bacchetti,S.,and Reddel,R.R.1995,Telomereelongation in immortal human cells without detectable telomerase activity.Embo J.14;4240-4248);阿坦堤,S.E.和狄平候,R.A.2000,没有端粒酶的老鼠:它们所能告诉我们的有关人类癌症.国家医学杂质.6;852-855(Artandi,S.E.andDePinho,R.A.2000,Mice without telomerase:what can they teach us about humancancer Nat.Med.6;852-855))。
本发明的发明人已经发现了各种依赖于茶碱的变构反式剪接核酶,这些核酶通过对癌细胞特异性的人端粒酶反转录酶(hTERT)的特异性RNA识别并将hTERT靶向的反式剪接核酶通过商业化的通信模块连接到适体上而进行制备,其中,所述hTERT靶向的反式剪接核酶具有已经证实的反式剪接能力,并且所述适体具有对茶碱的高度亲和力。
而且,使用体外反式剪接分析、荧光素酶报告分析、RT-PCR和MTT法,本发明已经确认这些核酶仅在茶碱存在于试管和细胞中的条件下选择性地识别并切割hTERT RNA,并且核酶的3’端外显子与靶位点下游区域进行退火
这些变构反式剪接核酶可以用于开发一种系统,该系统能够以某些疾病特异性RNA为靶,并且通过使用外源性因子(例如小分子)激活核酶的功能来人为地调控向治疗性基因RNA的取代。并且,可以通过针对已感染细胞特异性的方式人为地调控表达的治疗性基因的表达来发展一种特异和可逆的基因治疗技术的新概念(图1)。
发明内容
技术问题
为了解决现有技术中的问题而设计了本发明,并且因此,本发明的一个目的是提供一种方法来选择由茶碱调控其活性的变构反式剪接I型核酶。
此外,本发明的另一个目的提供一种由茶碱调控其RNA的取代活性的变构反式剪接I型核酶及其用途,并且该核酶特异性地靶向人端粒酶反转录酶(hTERT)的RNA。
进一步地,本发明的另一目的是提供一种表达载体及其用途,该表达载体对所述变构反式剪接I型核酶进行表达。
技术方案
根据本发明的一个方面,提供了一种方法来选择由茶碱调控其活性的变构反式剪接I型核酶。
根据本发明的另一方面,还提供了一种由茶碱调控其RNA取代活性的变构反式剪接I型核酶及其用途,并且该核酶特异性地靶向人端粒酶反转录酶(hTERT)的RNA。
根据本发明的再另一个方面,还提供了一种表达载体及其用途,该表达载体对所述变构反式剪接I型核酶进行表达。
有益效果
如以上所描述地,根据本发明的一种示例性实施方式的变构反式剪接I型核酶可以用来选择性地诊断仅表达了靶hTERT RNA的癌细胞,或者诱导这些癌细胞的细胞凋亡,这是由于所述变构反式剪接I型核酶的活性依赖于茶碱的调控以通过反式剪接反应对靶hTERT RNA进行更正。
附图说明
图1为表示了通过变构反式剪接核酶向RNA内的取代的调控的示意图。
图2表示了靶向hTERT的T/S核酶。
图3表示了依赖于茶碱的变构T/S核酶。
图4表示了WT P9和Mu-P9的3’端序列。
图5表示了体外反式剪接反应。
图6表示了对体外反式剪接反应产物的实时PCR分析。
图7表示了通过具有延长的基因间区(intergenic spacer,IGS)的T/S核酶进行的体外反式剪接反应。
图8表示了通过变构反式剪接核酶的体外反式剪接反应的相容性。
图9表示了通过变构反式剪接核酶诱导的依赖于茶碱的转基因。
图10表示了通过变构反式剪接核酶诱导的依赖于茶碱的转基因,所述变构反式剪接核酶包括100nt的对靶RNA的反义序列。
图11表示了hTERT细胞内的通过变构反式剪接核酶抑制的转基因。
图12表示了通过变构反式剪接核酶诱导的依赖于茶碱的转基因,所述变构反式剪接核酶包括300nt的对靶RNA的反义序列。
图13表示了细胞内的通过变构核酶的依赖于茶碱的反式剪接反应。
图14表示了表达载体(pAvQ-Theo-Rib21AS-TK)和腺病毒载体(Ad-TheoRib-TK、Ad-Theo-CRT)的基本结构,各个上述载体编码依赖于茶碱的反式剪接核酶进行编码。
图15表示了在hTERT+HT-29细胞内的由变构反式剪接核酶引发的依赖于茶碱的细胞凋亡。
图16表示了在hTERT+HepG2细胞内的由变构反式剪接核酶引发的依赖于茶碱的细胞凋亡。
图17表示了在hTERT+Capan-1细胞内的由变构反式剪接核酶引发的依赖于茶碱的细胞凋亡。
图18表示了在hTERT-IMR90细胞内的变构反式剪接核酶没有引发细胞凋亡。
图19表示了由变构反式剪接核酶引发的HT-29细胞的反式剪接反应。
图20表示了使用实时PCR分析的由变构反式剪接核酶引发的HT-29细胞的反式剪接反应。
具体实施方式
本发明提供了一种方法来选择由茶碱调控其活性的变构反式剪接I型核酶,该方法包括:
制备其中茶碱适体和通信模块结合到反式剪接核酶的P6区和P8区中的任一者或者两者上的适体酶、其中茶碱适体和通信模块结合到P9区被部分地除去的反式剪接核酶的P6区和P8区中的任一者或者两者的适体酶,或者其中茶碱配体和通信模块结合到P9区被部分地修饰的反式剪接核酶的P6区和P8区中的任一者或两者的适体酶;
通过茶碱和咖啡因来确认是否发生依赖于茶碱的反式剪接反应以比较体外制备的适体酶的变构调控;以及
通过哺乳动物细胞内的荧光素酶活性来确定在0.1-1mM的茶碱存在下依赖于茶碱的转基因是否得到表达。
在这种情况下,用来选择根据本发明一种示例性实施方式的变构反式剪接I型核酶的方法可以还包括:在所述制备适体酶的步骤中,制备含有对hTERTRNA的100-300nt的反义片段的适体酶。
此外,本发明的方法提供了一种由茶碱调控RNA的取代活性的变构反式剪接I型核酶,其特征在于,所述变构反式剪接I型核酶特异性地靶向人端粒酶反转录酶(hTERT)RNA,并具在3’外显子处具有得自萤火虫(firefly-derived)的荧光素酶受体基因。
在此情况下,所述变构反式剪接I型核酶可以具有选自由SEQ ID NO:1中描述的AS300ΔP9 8T、SEQ ID NO:2中描述的AS100 Mu-P9 6T8T以及在SEQ ID NO:3中描述的AS300W-P9 6T8T所组成的组中的RNA序列。
而且,本发明提供编码变构反式剪接I型核酶的表达载体。
在这种情况下,所述表达载体可以包括选自由SEQ ID NO:4中描述的pSEAP AS300ΔP98T-Luci、SEQ ID NO:5中描述的pSEAP AS100Mu-P96T8T-Luci和SEQ ID NO:6中描述的pSEAP AS300W-P9 6T8T-Luci所组成的组中的载体。
此外,本发明提供了一种由茶碱调控其RNA的取代活性的变构反式剪接I型核酶,其特征在于,所述变构反式剪接I型核酶特异性地靶向人端粒酶反转录酶(hTERT)RNA,并在3’外显子上具有单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)细胞凋亡基因。
在这种情况下,所述变构反式剪接I型核酶可以具有SEQ ID NO:7中描述的AS300W-P9 6T8T-TK的RNA序列。
此外,本发明提供了一种表达载体,该表达载体表达哺乳动物细胞中的变构反式剪接I型核酶。
在此情况下,所述表达载体可以包括在SEQ ID NO:8中描述的pAvQ-Theo-Rib21AS-TK(KCCM 10935P)。
此外,本发明提供了基因表达诱导物、癌症诊断剂、或包括变构反式剪接的I型核酶和茶碱的基因治疗剂。
进一步地说,本发明提供了一种包括所述表达载体和茶碱的基因表达诱导物、癌症诊断剂或基因治疗剂。
在下文中,将更详细地对本发明的示例性实施方式进行描述。
在下文中,根据本发明的一种示例性实施方式的变构反式剪接I型核酶是指适体酶或依赖于茶碱的适体酶。
本说明书中通篇所使用“茶碱适体酶”的表述表示特异性地与茶碱结合的适体酶。
根据本发明一种示例性实施方式的变构反式剪接I型核酶是一种由于核酶中结构发生了改变可以变构地增强或抑制核酶的反式剪接活性的分子。在此,由于结合到某些配体(例如适体)的区被退火到核酶的底物结合部位和催化核心部位,当适体结合到所述某些配体上并且该配体被感应到以将这些信号通过通信模块转移到核酶时,核酶结构可以被诱导而改变。
本发明的发明人通过通信模块将茶碱适体结合到hTERT靶向的反式剪接核酶上而发现了一种适体酶。在此,hTERT靶向的反式剪接核酶在先已基于I型内含子建立,并且由茶碱调控反式剪接核酶的活性,并且该适体酶还能够仅诱导具有hTERT的癌细胞的反式剪接。
在这种情况下,所制备的为适体酶,其中茶碱适体和通信模块结合到反式剪接核酶的P6区和P8区中的任一者或两者上,或者茶碱适体和通信模块结合到P9区被部分地除去的反式剪接核酶的P6区和P8区中的任一者或两者的适体酶(参见图3)。在此,使用商业程度最高的通信模块作为适体和核酶彼此退火的位点。而且,在PCR克隆过程中获得其中部分的P9于的DNA序列被不同的序列所取代的Mu-P9 6t8t,并且该结构还用于实验中(参见图4)。所有是实验都是通过比较茶碱、咖啡因以及相当量的溶剂(dH2O或PBS)的结果而进行的。在此,与茶碱相比拥有一个不同残基的咖啡因被用来确认对茶碱的实验结果,而溶剂则被用来作为对照。
从适体酶的变构调控的对照和确认的体外结果可以证实,Mu-P9 6t8t和ΔP9 6t通过依赖于茶碱地进行了反式剪接(参见图5)。而且,当Mu-P9 6t8t和ΔP9进行PCR反应时,相比于ΔP9 6t的产量,Mu-P9 6t8t的反式剪接产物以40%或更多的大量而被表达。通过使用实时PCR,已确定当茶碱存在时,在Mu P9 6t8t产生的反式剪接产物是dH2O存在的情况下的12倍(参见图6)。从具有延长的IGS的适体酶的变构调控的对照和确认的体外结果还证实了,虽然核酶具有相同的基本骨架,核酶的活性根据反义序列的存在被不同地表达(参见图7)。
还在哺乳动物细胞中确认了适体酶的变构调控。考虑到适体酶的体外和细胞内的变构调控彼此不同,将适体酶的体外实验结果在体内进行试验。
在进行这些实验之前,将细胞以依赖于浓度的方式进行处理从而确定细胞中最佳的茶碱浓度。因此,确定的茶碱的最佳浓度优选为0.1-1.0mM的范围内,并且更优选为0.7mM(参见图9)。
随后,进行荧光素酶分析从而确定反式剪接产物是否在细胞中表达并且所表达的转基因发挥了作用。
在细胞内实验中,甚至在存在相当量的PBS(溶剂)而不是茶碱或咖啡因时,荧光素酶就能得到全面的表达。这表示存在于反式剪接适体3’外显子的荧光素酶基因在没有反式剪接的情况下很可能被表达。因此,当核酶被转染并在已知没有靶的细胞((SK-LUI)中确认时荧光素酶很可能在不存在靶的情况下的表达被如所期望地确认了。(参见图11)。
增加剂量反义RNA来补充该背景。在反义RNA的增加减少非特异性表达并进一步提高效率的期望下,核酶的反义RNA的用量范围增加100-300,并且荧光素酶的表达在细胞中得到确认。结果这反映了荧光素酶的表达速率得到了全面的增加。结果,在AS-100Mu-P9 6t8t、AS-300W-P9 6t8t和AS-300ΔP98t的例子中,可以观察到在hTERT阳性细胞中荧光素酶活性以依赖于茶碱的形式被有效地诱导(参见图10和图12)。将细胞的全部RNA进行分离以核实细胞中的反式剪接,并且证实了RNA水平的反式剪接产物。如此一来,证实了在模拟条件下在AS300WT中观察到反式剪接产物带,并在存在茶碱时观察到了AS300W-P9 6T8T(参见图13)。
通过用单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)来取代荧光素类而改变3’外显子。也就是说,制备了特异性地靶向hTERT RNA并在3’外显子处具有HSV-TK凋亡基因的变构反式剪接I型核酶,并制备了编码核酶的表达载体(pAvQ-Theo-Rib21AS-TK)。然后,将制备的表达载体转染到随后将在实验中进行使用的腺病毒中。
将hTERT阳性细胞系(HT-29、HepG2和Capan-1)和hTERT阴性细胞系(IMR90)用各种腺病毒进行处理,然后还用更昔洛韦(ganciclovir,GCV)、茶碱和咖啡因分别处理五天,以使用MTT分析观察细胞凋亡。在这种情况下,使用Ad-TK(在CMV启动子的调控下表达HSVtk基因的腺病毒载体)作为hTERT+细胞中的阳性对照,并使用Ad-Rib-TK(对hTERT特异并且以HSVtk标记的腺病毒载体)作为hTERT+细胞中的阳性对照。并且,使用Ad-LacZ(在CMV启动子的调控下对LacZ基因进行表达的腺病毒载体)作为阴性对照。作为结果地,显示了当用GCV处理hTERT+细胞系时,无论是否存在调节复合体时(regulator compound),hTERT+细胞系中的腺病毒载体Ad-TK和Ad-Rib-TK死亡,而Ad-TheoRib-TK仅在茶碱存在时才发生特异性地细胞凋亡(参见图15-17)。还确认了阴性对照Ad-LacZ在每一种情况下都不发生细胞凋亡。
对hTERT-细胞系IMR90进行试验以确定上述特异性的细胞凋亡是否由靶RNA调控。作为结果地,当用GCV处理hTERT-细胞系时,Ad-TK发生细胞凋亡而Ad-Rib-TK、Ad-TheoRib-TK和Ad-LacZ没有发生细胞凋亡。因此,确认了细胞凋亡是由hTERT靶向RNA调控的(参见图18)。
将含有100M.O.I的腺病毒的hTERT+细胞用100μM的化学制品处理以获得全部RNA,并且将少量的得到的全部RNA进行实时PCR分析,所述腺病毒的凋亡在MTT分析中被高度诱导。结果,与用Ad-Rib-TK转染的hTERT+细胞时相比,仅在Ad-Theo-CRT-移入的HT-29细胞中并且在茶碱的存在的情况下确认了反式剪接产物,并且该反式剪接产物以基本相似的浓度进行表达。这反映了当用咖啡因处理hTERT+细胞时,产生了显著的浓度的反式剪接产物,但是与用茶碱处理hTERT+细胞时相比,它的浓度降低了约78%(参见图20)。这说明了咖啡因对茶碱适体的亲和力比茶碱低1000倍,但是对茶碱适体还具有一定程度上的显著的亲和力。从这些结果可以看出,由根据本发明一种示例性实施方式的变构核酶导致的靶特异性细胞凋亡的诱导是依赖于细胞中的茶碱的,并且是通过靶RNA特异的反式剪接反应而启动的。
实施例
下面,将参考附图对本发明的示例性实施方式进行描述,但本发明不特别地局限于此。
参考实施例1:底物(hTERT)RNA的制备
为了制备靶RNA,用SEQ ID NO:9中描述的引物(5’-GGGGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGCAGGCAGCGCTGCGTCCT-3’)和SEQ ID NO:10中描述的引物(5’-CGGGATCCCTGGCGGAAGGAGGGGGCGGCGGG-3’)对含有hTERT的第-1到第+218的DNA序列的pCl-neo载体(外显子1-2)进行PCR扩增,从而制得编码hTERT RNA的DNA片段。将按此制备的DNA片段体外转录到RNA中。加入DNA模板(3μg)、10x的转录缓冲液、10mM的DTT(西格玛公司(sigma))、0.5mM的ATP、GTP、CTP和UTP(罗氏(Roche)),80U的RNA酶抑制剂(可斯克(Kosco))、200U的T7RNA聚合酶(安苄(Ambion)),并加入焦碳酸二乙酯水(DEPC-H2O)至终体积为100μl,然后进行混合。然后将得到的混合物在37℃下反应3小时,并进一步地用5U的DNA酶I(普洛麦格(Promega))在37℃下处理30分钟,以完全除去DNA模板。通过苯酚提取(phenol extraction)(pH 7.0)和乙醇沉淀来提纯RNA,并在6%的变性聚丙烯酰胺凝胶上分离以洗提RNA带。然后,将RNA带提纯并溶解在TE缓冲液中(10mM的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl),pH 7.5以及1mM的EDTA)。
参考实施例2:依赖于茶碱的hTERT靶向反式剪接(T/S)适体酶的克隆
作为用于发展变构核酶的基础反式剪接核酶骨架,使用了I型内含子核酶,所述I型内含子核酶特异性地识别hTERT的+21核苷酸(nt)位点并具有对靶RNA的300nt的反义序列在该处进行退火的P1、P10和延长的IGS,(权,B.S.、荣格,H.S.、宋,M.S.、曹,K.S.、金,S.C.、基姆,K.、郑,J.S.、金,I.H.和李,S.W.2005,通过核酶介导的肿瘤特异性转录物的靶向取代对人类癌细胞的特异性衰退.分子治疗学.12:824-834(Kwon,B.S.,Jung,H.S.,Song,M.S.,Cho,K.S.,Kim,S.C.,Kimm,K.,Jeong,J.S.,Kim,I.H.,and Lee,S.W.2005,Specificregression of human cancer cells by ribozyme-mediated targeted replacement oftumor-specific transcript.Mol.Ther.12:824-834);洪,S.H.、郑,J.S.、李,Y.J.、荣格,H.I.、曹,K.S.、金,C.M.、权,B.S.、萨伦格,B.A.、李,S.W.*和金,I.H.*2008,hTERT通过反式剪接核酶来靶向肿瘤细胞而在活体内的重组.分子治疗学.16:74-80(Hong,S.H.,Jeong,J.S.,Lee,Y.J.,Jung,H.I.,Cho,K.S.,Kim,C.M.,Kwon,B.S.,Sullenger,B.A.,Lee,S.W.*,and Kim,I.H.*2008,In vivo reprogramming ofhTERT by trans-splicing ribozyme to target tumor cells.Mol Ther.16:74-80))。
在靶向hTERT的核酶的P6和P8区中的之一或者二者上通过通信模块的方式克隆茶碱适体。还在ΔP9核酶的例子中,其中P9区从该核酶中缺失,靶向hTERT的核酶的P6和P8区按照上述相同的方式进行修饰。通过使用含有IGS的在SEQ ID NO:11中描述的引物(5’-GGGGAATTCTAATACGACTCACTATAGGCAGGAAAAGTTATCAGGCA-3’)和在SEQ ID NO:12中描述的引物(5’-CGAGTACTCCAAAACTAATCAA-3’),靶向hTERT的反式剪接核酶的基因被扩增、用限制性内切酶Hind III和Nru I进行断裂,并随后克隆到SEAP启动子载体上,所述SEQ ID NO:11中描述的引物能从自我剪接核酶中对hTERT进行靶向,所述自我剪接核酶上茶碱适体通过通信模块进行退火,所述SEQ ID NO:12中描述的引物能对核酶的3’外显子的上游基因进行扩增,所述茶碱适体在所述靶向hTERT的反式剪接核酶进行退火。用在SEQID NO:13中描述的引物(5’-CGATGATCACGAAGACGC-3’)和在SEQ ID NO:14中描述的引物(5’-AAGGAAAAAAGCGGCCGCTTATTACAATTTGGACTTT-3’)对荧光素酶基因进行PCR扩增,用限制性内切酶Nru I和Xba I进行断裂,并随后克隆到核酶的3’末端中。然而,在使用PCR的克隆过程中得到了其P9区被修饰为不期望的序列的结构。除了所述结构之外,两种野生型结构(即,野生型P9 6t和野生型P9 8t)、3种删除的结构(即,ΔP9 6t、ΔP9 8t和ΔP9 6t8t)和突变结构(Mu P9 6t8t)也被制备,并且制备含有ΔP9的无适体的野生型P9和8结构作为对照。
所制备的依赖于茶碱的靶向hTERT的T/S适体酶的DNA序列在全部为10μl的反应混合物中进行扩增,该反应混合物包括3μl的终止子预备(ready)反应混合物(PE应用的生物系统(PE applied Biosystems))、100ng的量化的DNA、和3.2pmol的经过25个循环(96℃ -10秒,50℃ -5秒和60℃ -4秒)后的在SEQ ID NO:15中描述的引物(5’-CGGGATCCCTGGCGGAAGGAGGGGGCGGCGGG-3’)。为了对这种依赖于茶碱的靶向hTERT的T/S适体酶的扩增的基因进行纯化,随后加入40μl的dH2O,并向扩增的反应混合物中加入3M的NaoAC(1/10体积)和100%的EtOH(2体积)。将得到的反应混合物搅拌,在4℃下离心分离30分钟,转速为13,000rpm以获得DNA小球(DNApellet)。将该DNA小球用70%的乙醇(EtOH)(400μl)进行洗涤,并在高速真空干燥器中进行干燥以除去EtOH。将干燥的DNA小球溶解在15μl的模板抑制剂(template suppression reagent)中。接着,将得到的DNA溶液进行搅拌并慢慢减速,并转移到测序管(sequencing tube),在自动序列分析仪(ABI310遗传分析仪(ABI 310Genetic Analyzer))上进行测序。
参考实施例3:依赖于茶碱的靶向hTERT的T/S适体酶的制备
用含有T7聚合酶启动子的SEQ ID NO:16中描述的引物(5’-GGGGAATTCTAATACGACTCACTATAGGCAGGAAAAGTTATCAGGCA-3’)和用核酶的3’外显子的中间位点进行退火的在SEQ ID NO:17中描述的引物(5’-CCCAAGCTTGCG CAACTGCAACTCCGATAA-3’)对参考实施例2中所制备的依赖于茶碱的靶向hTERT的T/S适体的DNA序列进行PCR扩增。在这种情况下,DNA模板(3μg)和NTP(1.5mM)的增加的量用于尽可能地防止自我剪接反应。然后,加入1x的剪接缓冲液(40mM的Tris-HCl,pH7.5、5mM的MgCl2.10mM的二硫苏糖醇(DTT)和4mM的亚精胺)、0.5mM的ATP、GTP、CTP、UTP(Roche))、80U的RNA酶抑制剂(Kosco))、200U的T7RNA聚合酶(安拜昂(Ambion)),并加入DEPC-H2O至终体积为100μl,然后进行混合。然后将得到的混合物在37℃下转录3小时,并进一步地用5U的DNA酶I(普洛麦格(Promega))在37℃下处理30分钟以完全除去DNA模板。通过苯酚提取(pH 7.0)和乙醇沉淀来提纯RNA,并在4%的变性聚丙烯酰胺凝胶上分离以洗提RNA带。然后,将RNA带提纯并溶解在TE缓冲液中(10mM的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl),pH 7.5以及1mM的EDTA)。
参考实施例4:体外反式剪接反应
存在茶碱(500μM)或者具有不同的来自茶碱的残基的咖啡因(500μM),或者相当量的dH2O时,在剪接条件下(50mM的羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES),pH 7.0/150mM的NaCl/5mM的MgCl2/100μM的鸟嘌呤),将核酶(50nM)和10nM的底物RNA、hTERT RNA在37℃反应3小时并将得到的反应产物在RT-PCR反应中进行分析。在这种情况下,用荧光素酶识别位点(5’-CCCAAGCTTGCGCAAC TGCAACTCCGATAA-3’,SEQ ID NO:18)作为反转录(reverse transcription,RT)的引物,并使用识别hTERT RNA的5’末端的位点(5’-GGAATTCGCAGCG CTGCGTCCTGCT-3’,SEQ ID NO:19)和识别荧光素酶基因的位点(5’-CCCAA GCTTTCACTGCATACGACGATT-3’,SEQ ID NO:20)分别作为聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)的5’和3’端引物。
参考实施例5:半定量PCR
在体外反式剪接反应之后,将反式剪接产物进行实时PCT,然后进行半定量PCR。将各个DNA样品测试三次以计算平均值并确定其熔点,然后在琼脂糖胶中观察DNA样品。在这种情况下,用绿色荧光染料(SYBR Green)来检测DNA样品,并将由RT反应量化的标准对照用于半定量地与DNA样品进行比较。为了校准的目的,在RT反应中向各个样品中加入相等量的任何RNA(ras RNA),并将RT引物设计成使得反式剪接产物和内对照ras RNA能够被一种引物反转录。在此,将SEQ ID NO:21中描述的引物(5’-GCCCAACACCGGCATAAAGTTACATAATTACACACTT-3’)制备为RT引物。因此,用来定量比较反转录样品的ras cDNA的浓度来校准反转录样品的浓度。
PCR反应在PCR条件下进行:在96℃下预热10分钟,在96℃下变性5分钟,在60℃下退火15秒,并且在72℃下延伸30秒。在这种情况下,使用hTERT识别位点(5’-CCCGAATTCTGCGTCCTGCTCGA,SEQ ID NO:22)作为5’引物,并使用荧光素酶识别位点(5’-CCCAAGCTTTCACTGCATACACGATT,SEQ ID NO:23)作为3’引物。作为内对照,使用ras cNDA的PCR引物如下:5’引物(5’-ATGACTGAATATAAACTT,SEQ ID NO:24)和3’引物(5’-CCCAAGCTTTACATAATTACACACTT,SEQ ID NO:25)。
参考实施例6:具有提高的特异性的特异性T/S适体酶的制备
用SEQ ID NO:26中描述的引物(5’-AATTCAAGCTTCGTTTTGCGGCAGCAGGAAAAGTTATCAGGCATG-3’)和SEQ ID NO:27中描述的引物(5’-CCTGATAAC TTTTCCTGCCGCAAAACGAAGCTTG-3’)来对朝向被基因间区(IGS)在hTRET上识别的hTRET序列的3’末端的互补的100nt反义链进行PCR扩增,并用SEQ ID NO:28中描述的引物(5’-GGGAAGCTTGGGAAGCCCTGGCCC-3’)和SEQ ID NO:29中描述的引物(5’-GGGAAGCTTAAGGCCAGCACGTTCTT-3’)进行PCR扩增300nt反义链。随后,将扩增的反义链克隆到预先制备的核酶结构上游的Hind III限制酶切位点。
参考实施例7:细胞培养
将hTERT阳性细胞系在5%CO2的恒温箱中在37℃下进行培养,以293(人肾脏/正常)、HT-29(结肠/结肠腺癌)、Capan-1(胰腺/腺癌)和HepG2(肝/肝细胞癌)作为参考,并将hTERT阴性细胞系在5%CO2的培养箱中在37℃下进行培养,以IMR-90(肺/成纤维细胞/正常)和SK-LU1(肺/腺癌)美国典型物保藏中心(ATCC)作为参考。
参考实施例8:对细胞系中反式剪接适体酶的特异性和效率的证实
1)茶碱最佳浓度的试验
在35mm的皿中将293细胞以3×105的浓度进行接种,并生长到大约80%的汇合。在这种情况下,用脂质体LipofectAMINE(英杰(Invitrogen))使生长的293细胞转染1μg的Mu P9 6t8t。将转染的293细胞分别置于递增浓度的茶碱或咖啡因中(0.1mM、0.3mM、0.5mM、0.7mM和1mM)培养18小时,然后进行荧光素酶分析。使用相同量的PBS作为对照。
2)双荧光素酶分析
将转染细胞的培养基从35mm的皿中除去,并用1x PBS进行洗涤。然后,向各个转染细胞中加入200μl的1x被动裂解缓冲液,并使转染细胞在室温下裂解15分钟以获得细胞裂解液。将细胞裂解液以13,000rpm的转速离心分离1分钟,并将得到的上清液分别转移到新管中。向光度计管中放入100μl的LARII(荧光素酶检测试剂II),还加入20μl的细胞裂解液并混合。然后,将得到的混合物用光度计进行读数。再向光度计试管中加入100μl的斯达普和格娄(Stop & Glo)混合试剂(Stop & Glo 20μl+Stop & Glo缓冲液1ml),并进行混合。随后,在将得到的混合物用光度计(TD+20/20)进行读数。将延迟时间设定为3秒,将积分时间设定为12秒,并且将灵敏度设定为45%以适用于各个待测细胞。
对于转染,将细胞用溶解于PBS的茶碱和咖啡因进行处理。此外,当所使用的MEM培养基在细胞感染后用新的MEM培养基更换时,用各种化学制品处理细胞培养物,培养18个小时并随后进行荧光素酶分析。
3)细胞内反式剪接反应
使用4μl的lipofectamine使293细胞短暂地转染1μg的核酶载体。转染之后5个小时,用添加有0.7mM的茶碱或咖啡因的新鲜培养基更换所使用过的培养基,并保持18小时以获得细胞裂解液。然后,从细胞裂解液中提纯全部RNA。在这种情况下,使用补充有20mM的乙二胺四乙酸(EDTA)的鸟嘌呤异氰酸盐细胞裂解溶液来提取RNA,从而最小化体外反式剪接反应的可能。用识别荧光素酶的引物(5’-CCCAAGCTTGCGCAACTGCAACTCCGATAA,SEQ ID NO:30)对所提取的RNA进行反转录,从而获得cDNA。用作为3’引物的巢氏荧光素酶引物(5’-CCCAAGCTTGCCCAACACCGGCATAAAG,SEQ ID NO:31),和作为5’引物的识别hTERT的5’末端的识别位点(5’-AGCGCTGCGTCCTGCT,SEQ ID NO:32)对所述cDNA进行PCR扩增。在PCR条件下进行40循环的PCR反应:在96℃下预热10分钟、在96℃下变性5分钟、在58℃下退火30秒,在72℃下延伸20秒。在这种情况下,所提取的作为对反应产物的反应对照的RNA用寡聚脱氧胸苷酸(oligo dT)进行反转录,并将得到的cDNA用磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)5’引物(5’-TGACATCAAGAAGGTGGTGA,SEQ ID NO:33)和GAPDH 3’引物(5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA,SEQ ID NO:34)进行扩增,以观察到用作内部对照的GAPDH RNA的表达水平。
4)腺病毒的制备,该腺病毒表达依赖于茶碱的靶向hTERT的T/S适体酶
将pAvQ穿梭载体用限制性内切酶BamH I和BstB I断裂,并将DNA片段WT P9-TK和AS300 W-P9 6T8T-TK克隆到该pAvQ穿梭载体内以制备载体,该载体在哺乳动物细胞内在CMV启动子的调控下对核酶进行表达。用限制性内切酶Pme I对所制备的载体进行线性化,并使用电穿孔法与5型腺病毒基因组DNA质粒、AE1/E3pAdeno载体(pAdenovector)(求必精(Qbiogene))一起共转染到BJ5183细菌内。对通过同源重组在细菌细胞内获得的重组腺病毒载体结构进行分离、提纯并通过小量制备进行检查。然后,用限制性内切酶Pac I将重组腺病毒载体结构进行线性化,并转染到包装细胞系(packaging cellline)293细胞中。得到通过病毒增殖(viral proliferation)形成的蚀斑克隆(plaqueclones),并除去细胞残渣以获得病毒上清液。用该病毒上清液对感染的293细胞进行感染,以证实是否发生细胞溶解。
在CMV启动子调控下表达AS300WT P9-TK(原始T/S核酶)和AS300W-P9 6T8T-TK(变构T/S核酶)的腺病毒载体被分别命名为Ad-Rib-TK和Ad-TheoRib-TK。
为了确定重组腺病毒(Ad-Rib-TK和Ad-TheoRib-TK)已经被顺利的制备,用获得自重组病毒基因组DNA转染的293细胞的上清液感染293细胞,并且通过细胞病变效应(CPE)证实重组的腺病毒。此外,通过从病毒上清液获得DNA并在DNA上进行PCR实验(TK和病毒ITR位点)来证实重组的腺病毒,所述病毒上清液获自诱导细胞裂解的蚀斑克隆。
从感染了病毒的细胞的裂解液中提取RNA,并且在该RNA(TK RNA)上进行RT-PCR以证实是否重组病毒构建体被成功地制备,以及来自该病毒的转基因是否被表达。用获得自用各种重组腺病毒克隆感染的293细胞的上清液的重组病毒对293细胞进行数次感染,从而对重组病毒进行扩增。然后,使用(维瓦爱迪乐派克TM(AdenoPACK TM))将重组腺病毒载体分离并提纯。将得到的重组病毒连续稀释,并随后进行半数组织培养感染量分析(TCID50assay)以确定提纯的病毒载体的蚀斑形成单位滴度(PFU titer)。
5)MTT分析
将细胞种在96孔板(TPP)内一天,并随后分别用Ad-TK(在CMV启动子调控下表达TK基因的腺病毒载体)、Ad-Rib-TK、Ad-TheoRib-TK和Ad-LacZ(在CMV启动子调控下表达LacZ基因的腺病毒载体)病毒进行感染。从病毒感染那天起,每两天到五天就用相同的新的培养基来更换使用过的添加有GCV和化学制品(茶碱或咖啡因)的培养基。将HT-29株系以细胞数为3×103/孔进行接种,将HepG2株系以细胞数为3×103/孔进行接种,将Capan-1株系以细胞数为5×103/孔进行接种,并将IMR90株系以细胞数为5×103/孔进行接种。在这些株系接种的5天后,向各个细胞培养基中加入细胞滴度液相唯一溶液型细胞繁殖测定(CellTiterAQueous ONE Solution CellProliferation Assay)(Promega)从而使其达到全部培养基的20%,对96孔用100μl的得到的细胞培养基每孔进行培养,并使用微板读数模型550(Microplate reader model 550)(伯乐(BioRad))在490nm波长下进行测量,以观察细胞的细胞存活率。
6)半定量PCR
用腺病毒感染35mm的皿,并在感染后的24小时用同样的新的培养基替换补充有化学制品(茶碱或咖啡因)的使用的培养基。在培养基更换24小时候后,使用TriZol反应剂(Invitrogen)从培养的细胞中提纯RNA,并进行反转录,并使用实时PCR将其在反式剪接产物上进行半定量PCR。用GAPDHPCR产物的浓度对T/S PCR产品的浓度进行校准。
用寡居核苷酸(dT)对RNA进行反转录,并通过使用实时PCR将得到的cDNA用作为3’引物的TK引物(5’-CCCATGCACGTCTTTATCCTGGAT-3’,SEQ ID NO:35)和作为5’引物的识别hTERT 5’末端的位点(5’-GGAATTCGCAGCGCTGCGTCCTGCT-3’,SEQ ID NO:36)进行扩增。所提取的作为对反应产物的反应对照的RNA用寡聚脱氧胸苷酸(oligo dT)进行反转录,并将得到的cDNA用磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)5’引物(5’-TGACATCAAGAAGGTGGTGA,SEQ ID NO:37)和GAPDH 3’引物(5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA,SEQ ID NO:38)进行扩增,以观察到用作内部对照的GAPDH RNA的表达水平。
实施例1:反式剪接核酶的制备,该核酶具有附着其上的茶碱适体并特异性地靶向hTERT RNA
作为用于发展变构核酶的基础反式剪接核酶骨架,使用了I型内含子核酶,所述I型内含子核酶特异性地识别hTERT的+21nt位点并具有对靶RNA的300nt的反义序列在该处进行退火的P1、P10和延长的IGS(图2)。观察到这种核酶通过在细胞和动物模型(animal model)中特异性地表达hTERT RNA来诱导了表达hTERT的癌细胞特异性的细胞凋亡(Mol.Ther.2005;12:824,Mol Ther.2008;16:74)
为了制备依赖于茶碱的变构核酶,用作为茶碱的受体区的茶碱RNA适体(Science 1994;263:1425)被同时附着到P6或/和P8区中的任一者或二者上,这在用于由本申请的研究小组所研发的hTERT特异性T/S核酶的催化功能的RNA折叠中扮演着重要的角色。而且,通过将茶碱适体连接到P9区被最小化的ΔP9区所取代或被修饰的核酶的P6、P8或P6+P8区而制备了T/S核酶。图3表示了I型内含子的结构和RNA序列,该I型内含子与反式剪接核酶、茶碱适体、和其中茶碱适体与核酶退火的通信模块结构等同源(核酸研究方法.2002;30:4599(Nucleic Acis Res.2002;30:4599))。
所制备的反式剪接核酶结构列出如下:
-hTERT特异性反式剪接核酶(WT)
-其中适体附着到野生型(WT)的P6或P8区的核酶(W-P9 6t,WT-P98t)
-其中适体附着到突变P9的P6和P8区的核酶(Mu-P9 6t8t)
-其中WT核酶的P9区被ΔP9取代的核酶(ΔP9)
-其中适体附着到ΔP9核酶的P6、P8、P6+P8区的核酶(ΔP9 6t、ΔP9 8t、ΔP9 6t8t)
-其中附着有对hTERT的反义的300nt序列的WT核酶(AS-300WT)
-具有P1和P10螺旋结构并含有附着到P6+P8区的适体的WT核酶(IGSW-P96 t8t)
-使反义的300nt序列附着其上的并含有附着到P6+P8区的适体的WT核酶(AS-300W-P9 6t8t)
-使反义的300nt序列附着其上的并含有附着到P6+P8区的适体的MU-P9核酶(AS-300Mu-P9 6t8t)
在制备核酶载体的PCR程序中通知制备了突变P9的结构,并且这反映了在用靶RNA(hTERT RNA)进行体外反式剪接反应时,突变P9的结构不影响核酶的活性。因此,作为一种制备根据本发明的变构核酶的参与者,还制备了基于突变P9的核酶结构,并确定了其功能。图4表示了野生型P9序列和突变P9(Mu-P9)。另一个序列区域用粗体和下划线的字母示出。
实施例2:对具有取代依赖于茶碱的RNA的能力的核酶的定量分析
按此制备的核酶和作为底物RNA的hTERT RNA在37℃的剪接条件下反应3小时,并将得到的剪接产物通过RT-PCR反应进行分析。在剪接反应中,水或0.5mM的咖啡因(茶碱结构类似物、用于变构效应的特异性的阴性对照)或0.5mM的茶碱一起反应以观察反式剪接反应是否以茶碱特异性的方式变构地发生。图5表示了RT-PCR产物的电泳结果。
参见图5,它反映了WT和ΔP9核酶如所预期的总是无关于咖啡因、茶碱和水地诱导反式剪接反应,并且W-P9 6t也无关于这些化合物地诱导反式剪接反应。而且,这还反映了W-P9 8t以茶碱特异性的方式诱导反式剪接反应,并且,在ΔP9 8t和ΔP9 6t8t的情况下反式剪接反应可能被无效地诱导。同时,它还反映了在Mu-P9 6t8t和ΔP9 6t核酶的情况下具有319bp大小的反式剪接产物以茶碱特异性的方式在体外被制备。因此,它反映了根据核酶的P9序列或结构特性,I型内含子的P6或P8区是能够以依赖于茶碱的方式变构地调控核酶活性的主要区。
为了比较并分析由变构核酶产生的依赖于茶碱的反式剪接反应的诱导的调控程度,进行了对反式剪接产物的实时PCR分析(分析设备:扩贝特研究RG6(Corbett Research RG 6))。用hTERT RNA对Mu-P9 6t8t核酶或WT核酶进行剪接,然后进行RT反应,所述Mu-P9 6t8t核酶的酶活性通过茶碱依赖方式的反式剪接反应进行调控,所述WT核酶具有无关于小分子化合物的结构酶活性。对于反转录样品的定量分析,使用ras cDNA的浓度来校准反转录样品的浓度。结果示于图6。参见图6,它反映了在WT核酶的情况下无论是否存在水、茶碱和咖啡因,相同浓度的反式剪接产品在剪接缓冲液中产生。从反应产物的实时定量分析来看,还反映了依赖于茶碱的反式剪接反应不会在ΔP96t核酶中发生。然而,在Mu-P9 6t8t核酶的情况中,反映了当用内部调控来对分别的RT样品中的反式剪接产物的浓度进行校准时,在茶碱的存在下产生的反式剪接产物的浓度比存在咖啡因的情况要高4.3倍,并且比存在相同体积的dH2O时浓度要高12.16倍,所述Mu-P9 6t8t的活性如以上的实验所描述地以依赖于茶碱的形式在体外被调控。因此,这表示了Mu-P9 6t8t核酶为变构核酶,其反式剪接活性可以以依赖于茶碱的方式在体外进行调控。
由于被分析的核酶的基因间区(IGS)仅具有6nt序列,应该将具有延长的IGS组的核酶用于进行细胞内的靶RNA特异性的反式剪接反应(Nat.Biotechnol.1996;15:902,J.Mol.Biol.1999;185:1935,Mol.Ther.2003;7:386,Mol.Ther.2004;10:365;Mol.Ther.2005;12:824)。具有延长的IGS的核酶通过体外转录而被制备,并随后用hTERT RNA进行体外反式剪接反应。在这种情况下,无论反式剪接是否以依赖于茶碱的形式进行,都可以观察到上述现象。所制备的核酶对其上附着有对hTERT的反义300nt序列的WT核酶(AS-300WT);具有P1和P10螺旋结构并含有附着到P6+P8区上的适体的WT核酶(IGSW-P9 6t8t);其上附着有翻译300nt序列的并含有附着到P6+P8区的适体的WT核酶(AS-300W-P9 6t8t);以及其上附着有反义30nt序列并含有附着到P6+P8区上的适体的Mu-P9核酶(AS-300Mu-P9 6t8t)进行诱导,并且它们的反式剪接反应结果(反式剪接产物的RT-PCR产物)示于图7。
在图7中,反映了AS-300WT诱导的剪接反应如所预期地与茶碱无关。同时,还反映了AS300W-P9 6t8t诱导的体外剪接反应与茶碱无关,但是与不含AS-300核酶不同地,AS300Mu-P9 6t8t不能轻易地诱导剪接反应。同时,还反映了不含有反义序列并具有P1和P10螺旋结构的IGS W-P9 6t8t仅在茶碱的存在下才诱导反式剪接反应。这些结果说明了,虽然具有6nt IGS序列的核酶和具有延长的IGS序列的核酶据哟相同的基础骨架结构,它们可能具有结构上的差别,其中,它们根据反义序列的存在而表现出不同的活性。因此,这反应了具有延长的IGS序列的核酶的剪接活性应该在体外和/或体内被观察到。
从以上的结果可以看出,在一些附着有茶碱适体的核酶中,反式剪接活性在体外以依赖于茶碱的方式被变构地调控。为了证实是否反式剪接产物在严格的反式剪接反应中产生,将制备的反式剪接RT-PCR产物克隆到pUC19载体中并进行测序。如图8所示地,从反式剪接反应产物的测序数据可以确定,附着到核酶的3’外显子的萤火虫荧光素酶RNA被严格地退火到作为靶RNA的第+21个nt位点的下游位点。该结果意味着非常精确地发生了变构反式剪接核酶的反式剪接反应。
实施例3:使报告基因附着到3’外显子的变构反式剪接核酶的制备
为了制备依赖于茶碱的变构核酶的表达载体,用作为茶碱的受体区的茶碱RNA适体(Science 1994;263:1425)被同时附着到P6或/和P8区中的任一者或二者上,这在用于由本发明的研究小组所研发的hTERT特异性T/S核酶的催化功能的RNA折叠中扮演着重要的角色(Nucleic Acis Res.2002;30:4599)。而且,通过将茶碱适体连接到P9区被最小化的ΔP9取代所取代或被修饰的核酶的P6、P8或P6+P8区而制备了反式剪接核酶。作为用来诱导核酶表达的转基因,萤火虫荧光素酶基因被嵌入到核酶的3’外显子中,并且使用SV40启动子系统以促进核酶的细胞内表达。所制备的反式剪接核酶结构列举如下。
通过从为了体外剪接反应而制备的变构核酶结构的核酶区域到荧光素酶基因的3’末端的序列进行PCR扩增、将扩增的DNA嵌入到含有SV40启动子的pSEAP载体(克隆科技(Clontech))的Hind III和Xba I限制酶切位点,并将对hTERT RNA的反义序列嵌入到Hind III限制酶切位点而进行载体的构建。在这种情况下,用于扩增核酶的5’引物含有P1和P10螺旋结构和识别hTERTRNA(5’-GGGGAATTCTAATACGACTCACTATAGGCAGGAAAAGTTATCAGGCA-3’,SEQ ID NO:39)的IGS序列。
①含有对hTERT RNA的100nt反义序列的载体;
-hTERT特异性核酶(AS-100WT)的表达载体
-其中适体附着到WT核酶的P6和P8区的核酶(AS-100 W-P9 6t,AS-100WT-P9 8t)的表达载体
-其中适体附着到突变P9的P6+P8区上的核酶(AS-100Mu-P9 6t8t)的表达载体(pSEAP AS100Mu-P9 6T8T-Luci,SEQ ID NO:5)
-其中适体附着到ΔP9核酶的P6、P9和P6+P8区上的核酶(AS-100ΔP96t,AS-100ΔP9 8t,AS-100ΔP9 6t8t)的表达载体
②含有对hTERT RNA的300nt反义序列的载体
-hTERT特异性核酶(AS-300WT)的表达载体
-其中适体附着到WT核酶的P6+P8区上的核酶(AS-300W-P9 6t8t)的表达载体(pSEAP AS300W-P9 6T8T-Luci,SEQ ID NO:6)
-其中适体附着到突变P9的P6+P8区上的核酶(AS-300Mu-P9 6t8t)的表达载体
-其中适体附着到ΔP9核酶的P6区上的核酶(AS-300ΔP9 6t)的表达载体
-其中适体附着到ΔP9核酶的P8区上的核酶(AS-300ΔP9 8t)的表达载体(pSEAP AS300Delta P9 8T-Luci,SEQ ID NO:4)
实施例4:对细胞内核酶的依赖于化合物的hTERT RNA的特异性取代的观察
1)依赖于茶碱的反式剪接转基因的诱导条件的建立
首先,按以上所制备的使荧光素酶基因附着到3’外显子的变构核酶的诱导条件通过确定在什么样的细胞内茶碱浓度下转基因得到最变构化的诱导而建立。
293细胞用Mu-P9 6t8t核酶表达载体进行瞬时转染,所述Mu-P9 6t8t核酶表达载体以依赖于茶碱的方式诱导了反式剪接反应,伴随着脂质体lipofectamine穿过体外反式剪接反应。在这种情况下,为了测量转染效率并对被表达的产物的活性进行标准化,293细胞与在CMV启动子的调控下能够表达海肾荧光素酶(renillar luciferase)的载体被共转染。转染后4个小时,用新鲜培养基更换使用过的培养基。在这种情况下,向新鲜的培养基中加入0.1mM、0.3mM、0.5mM、0.7mM和1mM的咖啡因或茶碱,以证实咖啡因或茶碱的浓度能最大地诱导依赖于茶碱的形式的荧光素酶的活性。更换培养基后18个小时,得到细胞裂解液,并随后用光度计TD-20/20(特纳设计仪器(TurnerDesigns Instrument))测量标准化到海肾荧光素酶活性的萤火虫荧光素酶活性。在此情况下,作为载体(SV40-Luci)转染后而制备的荧光素酶浓度的相对值(%)的所测量的荧光素酶活性如图9所示地,被表示为能够在SV40启动子的调控下表达荧光素酶基因。
参考图9,它反映了在存在0.7mM的茶碱时,相比于存在0.7mM的咖啡因的情况,茶碱特异性荧光素酶活性在细胞中被最大地诱导。因此,以诱导依赖于茶碱的基因从各种核酶表达载体中被表达的最佳的茶碱浓度条件设定为0.7mM,并在该浓度下进行随后的实验。
2)对来自含有100nt的翻译序列的核酶表达载体的依赖于茶碱的基因的表达的诱导
通过荧光素酶分析还观察到通过含有100nt的对hTERT RNA的反义序列并使茶碱适体附着其上的核酶的细胞内转基因活性的诱导。
在这种情况下,所测量的荧光素酶活性通过从PBS处理过的细胞裂解液中观察到的荧光素酶的浓度的相对值(%)来表示。该结果示于图10。
参见图10,它反映了与体外数据一致,AS-100Mu-P9 6t8t核酶最大地诱导了依赖于茶碱形式的荧光素酶活性。然而,反映了AS-100ΔP9 8t核酶以比AS-100ΔP9 6t核酶更具有茶碱特异性的方式诱导了转基因的表达,这与体外数据是不同的。在这种情况下,考虑将上述的结果本身归因于可能由于进一步向IGS上游区域加入100nt的反义序列而导致的核酶中结构的改变,并且还归因于细胞内的环境确实与体外环境不同这一因素。同时,可以考虑到WT核酶、W-P9 6t核酶、W-P9 8t核酶和ΔP9核酶,以及ΔP9 6t8t核酶在细胞中以茶碱特异性的方式诱导了转基因的活性。
3)hTERT阴性细胞中的变构酶活性
为了从上述结果中测定被观察到以依赖于茶碱的方式在细胞中变构地诱导转基因活性的AS-100Mu-P9 6t8t核酶和在细胞中没有表现出变构活性的AS-100ΔP9 6t是否以hTERT靶RNA特异性的方式诱导转基因活性,用德牧依-C(DMRIE-C)将hTERT阴性细胞SK-Lu-1细胞用各种核酶载体进行转染。转染后4小时,用新鲜的添加有茶碱的培养基替换使用过的培养基。在用新鲜的培养基进行替换后的18个小时,获得细胞裂解液,并且随后测量荧光素酶活性。在这种情况下,所测得的作为来自SV40-Luci载体的荧光素酶的表达水平的相对值(%)的荧光素酶活性示于图11中。
参见图11,可以看出,与AS-100WT相似地,当靶RNA不存在于核酶中时,无论是否存在茶碱,AS-100Mu-P9 6t8t核酶和AS-100ΔP9 6t核酶抑制了转基因表达的诱导。也就是说,这反映了依赖于茶碱的变构反式剪接核酶可能以靶RNA特异性的方式诱导转基因表达。
4)来自含有300nt的反义序列的核酶表达载体的依赖于茶碱的转基因表达的诱导
为了观察到反式剪接核酶的变构转基因表达是否可能随着反义序列的长度的增加而被增强,制备含有300nt的对hTERT RNA的反义序列核酶载体,并比较并观察依赖于核酶的荧光素酶活性的诱导。
在该实验中,使用AS-300WT核酶作为依赖于茶碱对照,并将hTERT阳性细胞、293细胞与核酶(AS-300Mu-P9 6t8t)、核酶(AS-300ΔP9 6t)、核酶(AS-300ΔP9 8t)和核酶(AS-300W-P9 6t8t)中的每一种的表达载体进行共转染,所述核酶(AS-300Mu-P9 6t8t)的Mu-P9 6t8t basic基础骨架含有300nt的反义序列的核酶(AS-300Mu-P9 6t8t),当核酶含有AS-100序列时,它以依赖于茶碱的方式诱导了体外的反式剪接反应,并还诱导了细胞内的依赖于茶碱的转基因活性;所述核酶(AS-300ΔP9 6t)的ΔP9 6t基础骨架含有300nt的翻译序列,它以依赖于茶碱的方式诱导了体外反式剪接反应;所述核酶(AS-300ΔP9 8t)的ΔP9 8t基础骨架含有300nt的翻译序列,当核酶含有AS-100序列时,它诱导了细胞内的依赖于茶碱的转基因活性;所述核酶(AS-300W-P9 6t8t)的W-P96t8t基础骨架含有300nt的反义序列,当核酶含有延长的IGS序列(P1+P10螺旋结构),它以依赖于核酶的方式诱导了体外反式剪接反应。然后,对荧光素酶活性进行测量,并且还比较和观察了依赖于茶碱的基因活性的诱导。在这种情况下,所测量的荧光素酶活性作为能在SV40启动子的调控下表达荧光素酶基因的载体(SV40-Luci)的转染后所制得的荧光素酶的浓度的相对值而示于图12。
参见图12,它反映了如所预期地无论是否存在茶碱,AS-300WT核酶有效地诱导了荧光素酶表达。在含有300nt的反义序列的核酶中,可以看出AS-300Mu-P9 6t8t和AS-300ΔP9 6t核酶不诱导依赖于茶碱的转基因活性。同时,可以看出AS-300W-P9 6t8t和AS-300ΔP9 8t核酶以依赖于茶碱的方式有效地诱导了荧光素酶活性,还观察到转基因的表达在其中嵌入了300nt的反义序列的核酶中比在其中嵌入了100nt的反义序列的核酶中被更有效地诱导。
5)通过变构核酶的细胞内反式剪接反应
在上述实验中对能够在细胞内以依赖于茶碱方式来诱导并增强转基因活性的核酶结构进行研究。为了证实依赖于茶碱的转基因的诱导是否被细胞内反式剪接反应的变构效应所诱导,用其上附着有茶碱适体的核酶的表达载体对293细胞进行短时转染,并且在细胞中观察到细胞内反式剪接反应产物。
观察到GAPDH RNA的表达水平,并且用作内部对照。在琼脂糖凝胶上对RT-PCR产物进行分析。并且结果示于图13中。
参见图13,反应了如所预期地(泳道3),在阳性对照WT核酶(AS-300WT)中产生了hTERT特异性反式剪接反应产物。对于附着有茶碱适体的核酶,观察到无论是否存在茶碱、咖啡因和PBS的存在从AS-300Mu-P9 6t8t核酶载体产生了反式剪接产物,这符合荧光素酶活性诱导结果(泳道7-9),但是仅在用茶碱处理过的细胞中产生了311bp的反式剪接产物,这符合荧光素酶活性诱导结果(泳道4)。这些结果与AS-300 W-P9 6t8t核酶的体外反式剪接结果不同,但是考虑到这种差异是源于体外和细胞中的细胞内环境的不同。为了证实反式剪接产物在RNA抽提过程中是由细胞内反式剪接反应而不是由诱导的体外反式剪接反应而产生的,将用AS-300 W-P9 6t8t核酶转染的293细胞和SK-Lu-1细胞(hTERT阴性)混合,并且将RNA从细胞中抽提出来,并进行RT-PCR反应。结果,如图13所示地,由于没有观察到反式剪接产物(泳道10),转染有AS-300 W-P9 6t8t核酶的293细胞中存在茶碱下所测量的反式剪接产物通过依赖于茶碱并且对细胞内靶RNA具有特异性的反式剪接反应而被制备。
如以上所描述地,AS-300 W-P9 6t8t和AS-300ΔP9 8核酶被研发为用于能够在表达hTERT RNA的细胞中特异性地以依赖于核酶的方式调控变构核酶的参与者,也就是说,能够在细胞中以依赖于茶碱的方式人为地调控RNA取代反应。此外,IGS W-P9 6t8t被开发为能够最有效地在体外产生反式剪接产物变构核酶。
实施例5:对由腺病毒载体来调控表达hTERT癌症细胞特异性的细胞凋亡的功能的观察
1)在HT-29细胞(hTERT+)中依赖于茶碱的细胞凋亡的诱导
通过向所制备的变构核酶(AS300 W-P9 6T8T-TK)的3’外显子和重组的腺病毒载体嵌入细胞凋亡基因、HSV胸腺激酶来制备能够在哺乳动物细胞内的CMV启动子的调控下表达核酶的载体(pAvQ-Theo-Rib21AS-TK,SEQ IDNO:8)(图14)。
用2008年3月21日在韩国微生物培养中心(Korean Culture Center ofMicroorganisms,KCCM)的登记号:KCCM10935P来保藏pAvQ-Theo-Rib21AS-TK。
为了观察到是否腺病毒载体(Ad-TheoRib-TK)含有HSVtk基因作为3’外显子并且表达依赖于茶碱的变构核酶诱导的以靶特异性和依赖于茶碱的方式的转基因表达,结肠癌细胞HT-29细胞用该腺病毒载体进行处理,用GCV和调节复合体进行处理,并随后进行MTT分析以观察HT-29细胞的细胞存活率。在这种情况下,使用Ad-TK(在CMV启动子的调控下对HSVtk基因近习惯表达的腺病毒载体)作为hTERT+细胞中的阳性对照,并使用Ad-Rib-TK(对hTERT特异并且以HSVtk标记的腺病毒载体)作为hTERT+细胞中的阳性对照。使用Ad-LacZ(在CMV启动子的调控下对LacZ基因进行表达的腺病毒载体)作为阴性对照。当用Ad-TheoRib-TK处理HT-29细胞时,将用茶碱或咖啡因处理后的HT-29细胞的细胞存活率与用Ad-TheoRib-TK处理的HT-29细胞的细胞存活率进行比较。结果示于图15中。
参见图15,观察到当用Ad-TK和Ad-Rib-TK处理HT-29细胞时,细胞存活率随着GCV浓度和腺病毒浓度的增加而降低,但是,细胞存活率不受到化学物质浓度的影响。同时,观察到Ad-LacZ完全不影响细胞存活率。注意到,在HT-29感染有变构核酶Ad-TheoRib-TK的情况下,当用咖啡因处理HT-29细胞时,细胞存活率不受到GCV、病毒和化学物的浓度则增加的影响,但是当该HT-29细胞用茶碱处理时,如在阳性对照中地,细胞存活率与病毒和GCV浓度成比例地降低。而且,观察到当茶碱的浓度增加时,细胞存活率也随着茶碱浓度的增加而降低。这说明了由于核酶活性被茶碱变构地调控,并且转基因表达仅当用茶碱处理时才被诱导,Ad-TheoRib-TK诱导了癌症细胞的细胞凋亡。其中基因表达被变构地诱导的最佳条件为将HT-29细胞用100moi的腺病毒、100μM的茶碱和100μM的GCV处理。
2)在HepG2细胞中依赖于茶碱的细胞凋亡的诱导(hTERT+)
为了观察是否Ad-TheoRib-TK以靶特异性和依赖于茶碱的方式诱导了转基因表达,将肝癌细胞HepG2细胞用腺病毒载体进行处理,用GCV和调节复合体进行处理,随后进行MTT分析以观察在HepG2细胞中的细胞存活率。在这种情况下,使用Ad-TK作为阳性对照,并使用Ad-Rib-TK作为hTERT+细胞中的阳性对照。并将Ad-LacZ用作阴性对照。当用Ad-TheoRib-TK处理HepG2细胞时,将用茶碱或咖啡因处理后的HepG2细胞的细胞存活率与用Ad-TheoRib-TK处理的HepG2细胞进行比较。结果示于图16中。
参见图16,观察到当用Ad-TK和Ad-Rib-TK处理HepG2细胞时,如在HT-29细胞中所观察到地,细胞存活率随着GCV和腺病毒浓度的增加而降低,但是化学制品的浓度不会影响细胞存活率。同时,观察到Ad-LacZ完全不影响细胞存活率。注意到,在HepG2细胞感染有变构核酶Ad-TheoRib-TK的情况下,当用咖啡因处理HepG2细胞时,细胞存活率不会由于GCV、病毒和化学品的浓度的增加而受到影响,但是如在阳性对照中当用茶碱处理HepG2细胞时,所述细胞存活率会与病毒和GCV的浓度成比例的降低。还观察到,当茶碱的浓度增加,细胞存活率也会随着茶碱的浓度增加而降低。这说明了除hTERT+HT-29细胞之外,Ad-TheoRib-TK诱导了HepG2细胞中的癌细胞的细胞凋亡,这是因为核酶活性被茶碱变构地调控,并且转基因仅当用茶碱进行处理时被诱导。其中基因表达被变构地诱导的最佳条件为将HepG2细胞用10moi的腺病毒、10μM的茶碱和100μM的GCV处理。
3)在Capan-1细胞(hTERT+)中依赖于茶碱的细胞凋亡的诱导
为了观察是否Ad-TheoRib-TK以靶特异性和依赖于茶碱的方式诱导了转基因表达,将结肠癌细胞(Capan-1细胞)用腺病毒载体进行处理,用GCV和调节复合体进行处理,随后进行MTT分析以观察在Capan-1细胞中的细胞存活率。结果示于图17中。
参见图17,观察到当用Ad-TK和Ad-Rib-TK处理Capan-1细胞时,如在HT-29和HepG2细胞中所观察到,细胞存活率随着GCV和腺病毒浓度的增加而降低,但是化学制品的浓度不会影响细胞存活率。同时,观察到Ad-LacZ完全不影响细胞存活率。注意到,在Capan-1细胞感染有变构核酶Ad-TheoRib-TK的情况下,当用咖啡因处理Capan-1细胞时,细胞存活率不会由于GCV、病毒和化学品的浓度的增加而受到影响,但是如在阳性对照中当用茶碱处理Capan-1细胞时,所述细胞存活率会与病毒和GCV的浓度成比例的降低。还观察到,当茶碱的浓度增加,细胞存活率也会随着茶碱的浓度增加而降低。这说明了除hTERT+HT-29和HepG2细胞之外,Ad-TheoRib-TK诱导了Capan-1细胞中的癌细胞的细胞凋亡,这是因为核酶活性被茶碱变构地调控,并且转基因仅当用茶碱进行处理时被诱导。其中基因表达被变构地诱导的最佳条件为将Capan-1细胞用100moi的腺病毒、500μM的茶碱和50μM的GCV处理
4)对在IMR90细胞(hTERT-)中依赖于茶碱的细胞凋亡的诱导的观察
为了观察在hTERT+细胞中的Ad-TheoRib-TK活性的依赖于茶碱的调控是否对靶RNA特异,将hTERT-的IMR90细胞用腺病毒载体感染,然后观察hTERT-的IMR90细胞中的细胞存活率。结果示于图18中。
参见图18,观察到当用Ad-TK处理hTERT-的IMR90细胞时,细胞存活率无关于腺病毒和GCV的浓度而降低。这说明了该结果与化学物浓度无关。然而,甚至在Ad-Rib-TK和变构Ad-TheoRib-TK的浓度增加时,对核酶进行表达的Ad-Rib-TK和变构Ad-TheoRib-TK可以无关于病毒、GCV和化学品的浓度而不影响细胞存活率。这说明了Ad-TheoRib-TK可以在存在外源性化合物的情况下人为地调控核酶的活性,并且也以高度的靶特异性的方式诱导了转基因。
实施例6:对通过表达变构核酶的腺病毒载体的依赖于茶碱的细胞内反式剪接反应的调控
为了证实依赖于茶碱的转基因的诱导是否被细胞内反式剪接反应的变构效应所诱导,将HT-29细胞用对附着茶碱适体的核酶进行表达的腺病毒载体(100moi)感染,并然后用0.1mM的茶碱或相同浓度的咖啡因进行处理,这是在该实验中所建立的用来观察是否细胞内反式剪接反应产物在细胞内厂商的最佳条件。观察到GAPDH RNA的表达水平,并且用作内部对照。在琼脂糖凝胶上对RT-PCR产物进行分析。并且结果示于图19中
参见图19,观察到如所预期地,在阴性对照Ad-LacZ的情况中无论用小分子化合物进行处理,不产生任何反式剪接产物。同时,当将Ad-TheoRib-TK(Ad-Theo-Rib2AS-TK)引入表达hTERT的癌细胞HT-29细胞中时,并用咖啡因进行处理,基本上不产生反式剪接产物,但是当用0.1mM的茶碱处理HT-29细胞时,产生预期的429nt反式剪接产物,这与在MTT分析中观察到的结果一致。当将对反式剪接产物进行克隆和测序时,观察到hTER的第+21个位点在反式剪接产物中被剪接。同时,在如上描述的相同条件下不表达hTERT的IMR90细胞中不产生反式剪接产物,这说明了根据本发明的核酶仅在靶RNA的存在下才表现出其反式剪接的功能。为了证实依赖于茶碱的反式剪接产物不是在RNA抽提过程中诱导的体外反式剪接反应而是细胞内反式剪接反应,将模拟感染的HT-29细胞和用Ad-TheoRib-TK转染并用茶碱进行处理的IMR90细胞(hTERT阴性)进行混合,并且随后从细胞混合物中抽提RNA,并进行RT0PCR反应(混合)。结果,在细胞混合物中没有发现预期的反式剪接产品,这说明了反式剪接产物和测量的仅茶碱存在下在Ad-TheoRib-TK诱导的HT-29细胞中细胞凋亡是由依赖于茶碱和靶RNA特异性反式剪接反应所诱导的。
为了比较在HT-29细胞中的反式剪接反应产物的相对浓度,将变构反式剪接核酶进行反转录,随后进行实时PCR。用GAPDH PCR产物的浓度对T/S PCR产物的浓度进行校准,并在描绘于图中(图20)。
参见图20,观察到,在阴性对照Ad-LacZ的情况中无论用小分子化合物进行处理,不产生任何反式剪接产物。同时,当将Ad-TheoRib-TK引入细胞中时,并随后用PBS进行处理,基本上不产生反式剪接产物,并且,当用咖啡因处理Ad-TheoRib-TK时,反应产物的浓度比当用PBS处理Ad-TheoRib-TK时的浓度要稍微地增加,但是比当用茶碱处理Ad-TheoRib-TK时的浓度要显著地降低了78%。同时,当将Ad-TheoRib-TK引入细胞中时,并随后用茶碱进行处理,反式剪接反应被有效地诱导至与由Ad-Rib-TK所产生的反式剪接产物一样多的浓度。该结果说明了由变构核酶诱导的依赖于茶碱且靶特异性的细胞凋亡的诱导是由于茶碱造成的靶特异性反式剪接反应的激活所产生的。
工业实用性
如以上所描述地,本发明基于在非常特异的基因治疗与反式剪接核酶的结合,所述反式剪接核酶能以疾病特异性RNA为靶,并通过建立、作为模型系统的其活性能由茶碱进行调控的反式剪接核酶和可以由反式剪接核酶和外源性因素来调控基因表达的可逆基因技术来诱导基因表达。根据本发明的一种示例性实施方式的别构反式剪接I型核酶可以用作普通的基因治疗治剂来治疗各种不可治愈的疾病,还可以用作开发诊断剂的工具,或者作为探寻核酶活性机理的机制。
序列表
<110>檀国大学校产学协力团
<120>由茶碱调控其靶特异性核糖核酸的取代活性的变构反式剪接I型核酶
<130>PIKR0910396JH
<150>10-2008-0028483
<151>2008-03-27
<160>39
<170>KopatentIn 1.71
<210>1
<211>2347
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>变构反式剪接I型核酶AS300ΔP9 8T
<400>1
aaggccagca cguucuucgc gccgcgcucg cacagccucu gcagcacucg ggccaccagc 60
uccuucaggc aggacaccug gcggaaggag ggggcggcgg ggggcggccg ugcgucccag 120
ggcacgcaca ccaggcacug ggccaccagc gcgcggaaag ccgccggguc cccgcgcugc 180
accagccgcc agcccugggg ccccaggcgc cgcacgaacg uggccagcgg cagcaccucg 240
cgguaguggc ugcgcagcag ggagcgcacg gcuaggcagc ggggagcgcg cggcaucgcg 300
gggguggccg gggccagggc uucccaagcu ucguuuugcg gcaggaaaag uuaucaggca 360
ugcaccuggu agcuagucuu uaaaccaaua gauugcaucg guuuaaaagg caagaccguc 420
aaauugcggg aaagggguca acagccguuc aguaccaagu cucaggggaa acuuugagau 480
ggccuugcaa aggguauggu aauaagcuga cggacauggu ccuaaccacg cagccaaguc 540
cuaagucaac agcaugcacu guugauaugg augcaguuca cagacuaaau gucggucggg 600
gaugauacca gccgaaaggc ccuuggcagc aaucauaaga uauagucgga ccucucccga 660
aagggaguug gaaguacucg cgaaaacgcc caccauggaa gacgccaaaa acauaaagaa 720
aggcccggcg ccauucuauc cucuagagga uggaaccgcu ggagagcaac ugcauaaggc 780
uaugaagaga uacgcccugg uuccuggaac aauugcuuuu acagaugcac auaucgaggu 840
gaacaucacg uacgcggaau acuucgaaau guccguucgg uuggcagaag cuaugaaacg 900
auaugggcug aauacaaauc acagaaucgu cguaugcagu gaaaacucuc uucaauucuu 960
uaugccggug uugggcgcgu uauuuaucgg aguugcaguu gcgcccgcga acgacauuua 1020
uaaugaacgu gaauugcuca acaguaugaa cauuucgcag ccuaccguag uguuuguuuc 1080
caaaaagggg uugcaaaaaa uuuugaacgu gcaaaaaaaa uuaccaauaa uccagaaaau 1140
uauuaucaug gauucuaaaa cggauuacca gggauuucag ucgauguaca cguucgucac 1200
aucucaucua ccucccgguu uuaaugaaua cgauuuugua ccagaguccu uugaucguga 1260
caaaacaauu gcacugauaa ugaauuccuc uggaucuacu ggguuaccua aggguguggc 1320
ccuuccgcau agaacugccu gcgucagauu cucgcaugcc agagauccua uuuuuggcaa 1380
ucaaaucauu ccggauacug cgauuuuaag uguuguucca uuccaucacg guuuuggaau 1440
guuuacuaca cucggauauu ugauaugugg auuucgaguc gucuuaaugu auagauuuga 1500
agaagagcug uuuuuacgau cccuucagga uuacaaaauu caaagugcgu ugcuaguacc 1560
aacccuauuu ucauucuucg ccaaaagcac ucugauugac aaauacgauu uaucuaauuu 1620
acacgaaauu gcuucugggg gcgcaccucu uucgaaagaa gucggggaag cgguugcaaa 1680
acgcuuccau cuuccaggga uacgacaagg auaugggcuc acugagacua caucagcuau 1740
ucugauuaca cccgaggggg augauaaacc gggcgcgguc gguaaaguug uuccauuuuu 1800
ugaagcgaag guuguggauc uggauaccgg gaaaacgcug ggcguuaauc agagaggcga 1860
auuauguguc agaggaccua ugauuauguc cgguuaugua aacaauccgg aagcgaccaa 1920
cgccuugauu gacaaggaug gauggcuaca uucuggagac auagcuuacu gggacgaaga 1980
cgaacacuuc uucauaguug accgcuugaa gucuuuaauu aaauacaaag gauaucaggu 2040
ggcccccgcu gaauuggaau cgauauuguu acaacacccc aacaucuucg acgcgggcgu 2100
ggcaggucuu cccgacgaug acgccgguga acuucccgcc gccguuguug uuuuggagca 2160
cggaaagacg augacggaaa aagagaucgu ggauuacgug gccagucaag uaacaaccgc 2220
gaaaaaguug cgcggaggag uuguguuugu ggacgaagua ccgaaagguc uuaccggaaa 2280
acucgacgca agaaaaauca gagagauccu cauaaaggcc aagaagggcg gaaaguccaa 2340
auuguaa 2347
<210>2
<211>2360
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>变构反式剪接I型核酶AS100 Mu-P9 6T8T
<400>2
aaggccagca cguucuucgc gccgcgcucg cacagccucu gcagcacucg ggccaccagc 60
uccuucaggc aggacaccug gcggaaggag ggggcggcgg ggggcggccg ugcgucccag 120
ggcacgcaca ccaggcacug ggccaccagc gcgcggaaag ccgccggguc cccgcgcugc 180
accagccgcc agcccugggg ccccaggcgc cgcacgaacg uggccagcgg cagcaccucg 240
cgguaguggc ugcgcagcag ggagcgcacg gcuaggcagc ggggagcgcg cggcaucgcg 300
gggguggccg gggccagggc uucccaagcu ucguuuugcg gcaggaaaag uuaucaggca 360
ugcaccuggu agcuagucuu uaaaccaaua gauugcaucg guuuaaaagg caagaccguc 420
aaauugcggg aaagggguca acagccguuc aguaccaagu cucaggggaa acuuugagau 480
ggccuugcaa aggguauggu aauaagcuga cggacauggu ccuaaccacg cagccaaguc 540
cuaagggaug auaccagccg aaaggcccuu ggcagcaauu auggaugcag uucacagacu 600
aaaugucggu cggggaugau accagccgaa aggcccuugg cagcaaucau aagauauagu 660
cggaccucuc ccgaaaggga guuggaguac ucgcgaaaac gcccaccaug gaagacgcca 720
aaaacauaaa gaaaggcccg gcgccauucu auccucuaga ggauggaacc gcuggagagc 780
aacugcauaa ggcuaugaag agauacgccc ugguuccugg aacaauugcu uuuacagaug 840
cacauaucga ggugaacauc acguacgcgg aauacuucga aauguccguu cgguuggcag 900
aagcuaugaa acgauauggg cugaauacaa aucacagaau cgucguaugc agugaaaacu 960
cucuucaauu cuuuaugccg guguugggcg cguuauuuau cggaguugca guugcgcccg 1020
cgaacgacau uuauaaugaa cgugaauugc ucaacaguau gaacauuucg cagccuaccg 1080
uaguguuugu uuccaaaaag ggguugcaaa aaauuuugaa cgugcaaaaa aaauuaccaa 1140
uaauccagaa aauuauuauc auggauucua aaacggauua ccagggauuu cagucgaugu 1200
acacguucgu cacaucucau cuaccucccg guuuuaauga auacgauuuu guaccagagu 1260
ccuuugaucg ugacaaaaca auugcacuga uaaugaauuc cucuggaucu acuggguuac 1320
cuaagggugu ggcccuuccg cauagaacug ccugcgucag auucucgcau gccagagauc 1380
cuauuuuugg caaucaaauc auuccggaua cugcgauuuu aaguguuguu ccauuccauc 1440
acgguuuugg aauguuuacu acacucggau auuugauaug uggauuucga gucgucuuaa 1500
uguauagauu ugaagaagag cuguuuuuac gaucccuuca ggauuacaaa auucaaagug 1560
cguugcuagu accaacccua uuuucauucu ucgccaaaag cacucugauu gacaaauacg 1620
auuuaucuaa uuuacacgaa auugcuucug ggggcgcacc ucuuucgaaa gaagucgggg 1680
aagcgguugc aaaacgcuuc caucuuccag ggauacgaca aggauauggg cucacugaga 1740
cuacaucagc uauucugauu acacccgagg gggaugauaa accgggcgcg gucgguaaag 1800
uuguuccauu uuuugaagcg aagguugugg aucuggauac cgggaaaacg cugggcguua 1860
aucagagagg cgaauuaugu gucagaggac cuaugauuau guccgguuau guaaacaauc 1920
cggaagcgac caacgccuug auugacaagg auggauggcu acauucugga gacauagcuu 1980
acugggacga agacgaacac uucuucauag uugaccgcuu gaagucuuua auuaaauaca 2040
aaggauauca gguggccccc gcugaauugg aaucgauauu guuacaacac cccaacaucu 2100
ucgacgcggg cguggcaggu cuucccgacg augacgccgg ugaacuuccc gccgccguug 2160
uuguuuugga gcacggaaag acgaugacgg aaaaagagau cguggauuac guggccaguc 2220
aaguaacaac cgcgaaaaag uugcgcggag gaguuguguu uguggacgaa guaccgaaag 2280
gucuuaccgg aaaacucgac gcaagaaaaa ucagagagau ccucauaaag gccaagaagg 2340
gcggaaaguc caaauuguaa 2360
<210>3
<211>2437
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>变构反式剪接I型核酶AS300 W-P9 6T8T
<400>3
aagccgaagg ccagcacguu cuucgcgccg cgcucgcaca gccucugcag cacucgggcc 60
accagcuccu ucaggcagga caccuggcgg aaggaggggg cggcgggggg cggccgugcg 120
ucccagggca cgcacaccag gcacugggcc accagcgcgc ggaaagccgc cggguccccg 180
cgcugcacca gccgccagcc cuggggcccc aggcgccgca cgaacguggc cagcggcagc 240
accucgcggu aguggcugcg cagcagggag cgcacggcua ggcagcgggg agcgcgcggc 300
aucgcggggg uggccggggc cagggcuucc caagcuucgu uuugcggcag gaaaaguuau 360
caggcaugca ccugguagcu agucuuuaaa ccaauagauu gcaucgguuu aaaaggcaag 420
accgucaaau ugcgggaaag gggucaacag ccguucagua ccaagucuca ggggaaacuu 480
ugagauggcc uugcaaaggg uaugguaaua agcugacgga caugguccua accacgcagc 540
caaguccuaa gggaugauac cagccgaaag gcccuuggca gcaauuaugg augcaguuca 600
cagacuaaau gucggucggg gaugauacca gccgaaaggc ccuuggcagc aaucauaaga 660
uauagucgga ccucuccuua augggagcua gcggaugaag ugaugcaaca cuggagccgc 720
ugggaacuaa uuuguaugcg aaaguauauu gauuaguuuu ggaguacucg cgaaaacgcc 780
caccauggaa gacgccaaaa acauaaagaa aggcccggcg ccauucuauc cucuagagga 840
uggaaccgcu ggagagcaac ugcauaaggc uaugaagaga uacgcccugg uuccuggaac 900
aauugcuuuu acagaugcac auaucgaggu gaacaucacg uacgcggaau acuucgaaau 960
guccguucgg uuggcagaag cuaugaaacg auaugggcug aauacaaauc acagaaucgu 1020
cguaugcagu gaaaacucuc uucaauucuu uaugccggug uugggcgcgu uauuuaucgg 1080
aguugcaguu gcgcccgcga acgacauuua uaaugaacgu gaauugcuca acaguaugaa 1140
cauuucgcag ccuaccguag uguuuguuuc caaaaagggg uugcaaaaaa uuuugaacgu 1200
gcaaaaaaaa uuaccaauaa uccagaaaau uauuaucaug gauucuaaaa cggauuacca 1260
gggauuucag ucgauguaca cguucgucac aucucaucua ccucccgguu uuaaugaaua 1320
cgauuuugua ccagaguccu uugaucguga caaaacaauu gcacugauaa ugaauuccuc 1380
uggaucuacu ggguuaccua aggguguggc ccuuccgcau agaacugccu gcgucagauu 1440
cucgcaugcc agagauccua uuuuuggcaa ucaaaucauu ccggauacug cgauuuuaag 1500
uguuguucca uuccaucacg guuuuggaau guuuacuaca cucggauauu ugauaugugg 1560
auuucgaguc gucuuaaugu auagauuuga agaagagcug uuuuuacgau cccuucagga 1620
uuacaaaauu caaagugcgu ugcuaguacc aacccuauuu ucauucuucg ccaaaagcac 1680
ucugauugac aaauacgauu uaucuaauuu acacgaaauu gcuucugggg gcgcaccucu 1740
uucgaaagaa gucggggaag cgguugcaaa acgcuuccau cuuccaggga uacgacaagg 1800
auaugggcuc acugagacua caucagcuau ucugauuaca cccgaggggg augauaaacc 1860
gggcgcgguc gguaaaguug uuccauuuuu ugaagcgaag guuguggauc uggauaccgg 1920
gaaaacgcug ggcguuaauc agagaggcga auuauguguc agaggaccua ugauuauguc 1980
cgguuaugua aacaauccgg aagcgaccaa cgccuugauu gacaaggaug gauggcuaca 2040
uucuggagac auagcuuacu gggacgaaga cgaacacuuc uucauaguug accgcuugaa 2100
gucuuuaauu aaauacaaag gauaucaggu ggcccccgcu gaauuggaau cgauauuguu 2160
acaacacccc aacaucuucg acgcgggcgu ggcaggucuu cccgacgaug acgccgguga 2220
acuucccgcc gccguuguug uuuuggagca cggaaagacg augacggaaa aagagaucgu 2280
ggauuacgug gccagucaag uaacaaccgc gaaaaaguug cgcggaggag uuguguuugu 2340
ggacgaagua ccgaaagguc uuaccggaaa acucgacgca agaaaaauca gagagauccu 2400
cauaaaggcc aagaagggcg gaaaguccaa auuguaa 2437
<210>4
<211>5674
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>AS300ΔP9 8T表达载体(pSEAP AS300ΔP9 8T-Luci)
<400>4
ggtaccgagc tcttacgcgt gctagcccgg gctcgagatc tgcgatctgc atctcaatta 60
gtcagcaacc atagtcccgc ccctaactcc gcccatcccg cccctaactc cgcccagttc 120
cgcccattct ccgccccatc gctgactaat tttttttatt tatgcagagg ccgaggccgc 180
ctcggcctct gagctattcc agaagtagtg aggaggcttt tttggaggcc taggcttttg 240
caaaaagctt aaggccagca cgttcttcgc gccgcgctcg cacagcctct gcagcactcg 300
ggccaccagc tccttcaggc aggacacctg gcggaaggag ggggcggcgg ggggcggccg 360
tgcgtcccag ggcacgcaca ccaggcactg ggccaccagc gcgcggaaag ccgccgggtc 420
cccgcgctgc accagccgcc agccctgggg ccccaggcgc cgcacgaacg tggccagcgg 480
cagcacctcg cggtagtggc tgcgcagcag ggagcgcacg gctaggcagc ggggagcgcg 540
cggcatcgcg ggggtggccg gggccagggc ttcccaagct tcgttttgcg gcaggaaaag 600
ttatcaggca tgcacctggt agctagtctt taaaccaata gattgcatcg gtttaaaagg 660
caagaccgtc aaattgcggg aaaggggtca acagccgttc agtaccaagt ctcaggggaa 720
actttgagat ggccttgcaa agggtatggt aataagctga cggacatggt cctaaccacg 780
cagccaagtc ctaagtcaac agcatgcact gttgatatgg atgcagttca cagactaaat 840
gtcggtcggg gatgatacca gccgaaaggc ccttggcagc aatcataaga tatagtcgga 900
cctctcccga aagggagttg gaagtactcg cgaaaacgcc caccatggaa gacgccaaaa 960
acataaagaa aggcccggcg ccattctatc ctctagagga tggaaccgct ggagagcaac 1020
tgcataaggc tatgaagaga tacgccctgg ttcctggaac aattgctttt acagatgcac 1080
atatcgaggt gaacatcacg tacgcggaat acttcgaaat gtccgttcgg ttggcagaag 1140
ctatgaaacg atatgggctg aatacaaatc acagaatcgt cgtatgcagt gaaaactctc 1200
ttcaattctt tatgccggtg ttgggcgcgt tatttatcgg agttgcagtt gcgcccgcga 1260
acgacattta taatgaacgt gaattgctca acagtatgaa catttcgcag cctaccgtag 1320
tgtttgtttc caaaaagggg ttgcaaaaaa ttttgaacgt gcaaaaaaaa ttaccaataa 1380
tccagaaaat tattatcatg gattctaaaa cggattacca gggatttcag tcgatgtaca 1440
cgttcgtcac atctcatcta cctcccggtt ttaatgaata cgattttgta ccagagtcct 1500
ttgatcgtga caaaacaatt gcactgataa tgaattcctc tggatctact gggttaccta 1560
agggtgtggc ccttccgcat agaactgcct gcgtcagatt ctcgcatgcc agagatccta 1620
tttttggcaa tcaaatcatt ccggatactg cgattttaag tgttgttcca ttccatcacg 1680
gttttggaat gtttactaca ctcggatatt tgatatgtgg atttcgagtc gtcttaatgt 1740
atagatttga agaagagctg tttttacgat cccttcagga ttacaaaatt caaagtgcgt 1800
tgctagtacc aaccctattt tcattcttcg ccaaaagcac tctgattgac aaatacgatt 1860
tatctaattt acacgaaatt gcttctgggg gcgcacctct ttcgaaagaa gtcggggaag 1920
cggttgcaaa acgcttccat cttccaggga tacgacaagg atatgggctc actgagacta 1980
catcagctat tctgattaca cccgaggggg atgataaacc gggcgcggtc ggtaaagttg 2040
ttccattttt tgaagcgaag gttgtggatc tggataccgg gaaaacgctg ggcgttaatc 2100
agagaggcga attatgtgtc agaggaccta tgattatgtc cggttatgta aacaatccgg 2160
aagcgaccaa cgccttgatt gacaaggatg gatggctaca ttctggagac atagcttact 2220
gggacgaaga cgaacacttc ttcatagttg accgcttgaa gtctttaatt aaatacaaag 2280
gatatcaggt ggcccccgct gaattggaat cgatattgtt acaacacccc aacatcttcg 2340
acgcgggcgt ggcaggtctt cccgacgatg acgccggtga acttcccgcc gccgttgttg 2400
ttttggagca cggaaagacg atgacggaaa aagagatcgt ggattacgtg gccagtcaag 2460
taacaaccgc gaaaaagttg cgcggaggag ttgtgtttgt ggacgaagta ccgaaaggtc 2520
ttaccggaaa actcgacgca agaaaaatca gagagatcct cataaaggcc aagaagggcg 2580
gaaagtccaa attgtaagct agagtcgggg cggccggccg cttcgagcag acatgataag 2640
atacattgat gagtttggac aaaccacaac tagaatgcag tgaaaaaaat gctttatttg 2700
tgaaatttgt gatgctattg ctttatttgt aaccattata agctgcaata aacaagttaa 2760
caacaacaat tgcattcatt ttatgtttca ggttcagggg gaggtgtggg aggtttttta 2820
aagcaagtaa aacctctaca aatgtggtaa aatcgataag gatccgtcga ccgatgccct 2880
tgagagcctt caacccagtc agctccttcc ggtgggcgcg gggcatgact atcgtcgccg 2940
cacttatgac tgtcttcttt atcatgcaac tcgtaggaca ggtgccggca gcgctcttcc 3000
gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct 3060
cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg 3120
tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc 3180
cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga 3240
aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct 3300
cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg 3360
gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag 3420
ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat 3480
cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac 3540
aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac 3600
tacggctaca ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc 3660
ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt 3720
tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc 3780
ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg 3840
agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca 3900
atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca 3960
cctatctcag cgatctgtct atttcgttca tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag 4020
ataactacga tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac 4080
ccacgctcac cggctccaga tttatcagca ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc 4140
agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct 4200
agagtaagta gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc 4260
gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct ccggttccca acgatcaagg 4320
cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc 4380
gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc actgcataat 4440
tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag 4500
tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat 4560
aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg 4620
cgaaaactct caaggatctt accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca 4680
cccaactgat cttcagcatc ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga 4740
aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat actcatactc 4800
ttcctttttc aatattattg aagcatttat cagggttatt gtctcatgag cggatacata 4860
tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg 4920
ccacctgacg cgccctgtag cggcgcatta agcgcggcgg gtgtggtggt tacgcgcagc 4980
gtgaccgcta cacttgccag cgccctagcg cccgctcctt tcgctttctt cccttccttt 5040
ctcgccacgt tcgccggctt tccccgtcaa gctctaaatc gggggctccc tttagggttc 5100
cgatttagtg ctttacggca cctcgacccc aaaaaacttg attagggtga tggttcacgt 5160
agtgggccat cgccctgata gacggttttt cgccctttga cgttggagtc cacgttcttt 5220
aatagtggac tcttgttcca aactggaaca acactcaacc ctatctcggt ctattctttt 5280
gatttataag ggattttgcc gatttcggcc tattggttaa aaaatgagct gatttaacaa 5340
aaatttaacg cgaattttaa caaaatatta acgtttacaa tttcccattc gccattcagg 5400
ctgcgcaact gttgggaagg gcgatcggtg cgggcctctt cgctattacg ccagcccaag 5460
ctaccatgat aagtaagtaa tattaaggta cgggaggtac ttggagcggc cgcaataaaa 5520
tatctttatt ttcattacat ctgtgtgttg gttttttgtg tgaatcgata gtactaacat 5580
acgctctcca tcaaaacaaa acgaaacaaa acaaactagc aaaataggct gtccccagtg 5640
caagtgcagg tgccagaaca tttctctatc gata 5674
<210>5
<211>5687
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>AS100Mu-P9 6T8T表达载体(pSEAP AS100Mu-P9 6T8T-Luci)
<400>5
ggtaccgagc tcttacgcgt gctagcccgg gctcgagatc tgcgatctgc atctcaatta 60
gtcagcaacc atagtcccgc ccctaactcc gcccatcccg cccctaactc cgcccagttc 120
cgcccattct ccgccccatc gctgactaat tttttttatt tatgcagagg ccgaggccgc 180
ctcggcctct gagctattcc agaagtagtg aggaggcttt tttggaggcc taggcttttg 240
caaaaagctt aaggccagca cgttcttcgc gccgcgctcg cacagcctct gcagcactcg 300
ggccaccagc tccttcaggc aggacacctg gcggaaggag ggggcggcgg ggggcggccg 360
tgcgtcccag ggcacgcaca ccaggcactg ggccaccagc gcgcggaaag ccgccgggtc 420
cccgcgctgc accagccgcc agccctgggg ccccaggcgc cgcacgaacg tggccagcgg 480
cagcacctcg cggtagtggc tgcgcagcag ggagcgcacg gctaggcagc ggggagcgcg 540
cggcatcgcg ggggtggccg gggccagggc ttcccaagct tcgttttgcg gcaggaaaag 600
ttatcaggca tgcacctggt agctagtctt taaaccaata gattgcatcg gtttaaaagg 660
caagaccgtc aaattgcggg aaaggggtca acagccgttc agtaccaagt ctcaggggaa 720
actttgagat ggccttgcaa agggtatggt aataagctga cggacatggt cctaaccacg 780
cagccaagtc ctaagggatg ataccagccg aaaggccctt ggcagcaatt atggatgcag 840
ttcacagact aaatgtcggt cggggatgat accagccgaa aggcccttgg cagcaatcat 900
aagatatagt cggacctctc ccgaaaggga gttggagtac tcgcgaaaac gcccaccatg 960
gaagacgcca aaaacataaa gaaaggcccg gcgccattct atcctctaga ggatggaacc 1020
gctggagagc aactgcataa ggctatgaag agatacgccc tggttcctgg aacaattgct 1080
tttacagatg cacatatcga ggtgaacatc acgtacgcgg aatacttcga aatgtccgtt 1140
cggttggcag aagctatgaa acgatatggg ctgaatacaa atcacagaat cgtcgtatgc 1200
agtgaaaact ctcttcaatt ctttatgccg gtgttgggcg cgttatttat cggagttgca 1260
gttgcgcccg cgaacgacat ttataatgaa cgtgaattgc tcaacagtat gaacatttcg 1320
cagcctaccg tagtgtttgt ttccaaaaag gggttgcaaa aaattttgaa cgtgcaaaaa 1380
aaattaccaa taatccagaa aattattatc atggattcta aaacggatta ccagggattt 1440
cagtcgatgt acacgttcgt cacatctcat ctacctcccg gttttaatga atacgatttt 1500
gtaccagagt cctttgatcg tgacaaaaca attgcactga taatgaattc ctctggatct 1560
actgggttac ctaagggtgt ggcccttccg catagaactg cctgcgtcag attctcgcat 1620
gccagagatc ctatttttgg caatcaaatc attccggata ctgcgatttt aagtgttgtt 1680
ccattccatc acggttttgg aatgtttact acactcggat atttgatatg tggatttcga 1740
gtcgtcttaa tgtatagatt tgaagaagag ctgtttttac gatcccttca ggattacaaa 1800
attcaaagtg cgttgctagt accaacccta ttttcattct tcgccaaaag cactctgatt 1860
gacaaatacg atttatctaa tttacacgaa attgcttctg ggggcgcacc tctttcgaaa 1920
gaagtcgggg aagcggttgc aaaacgcttc catcttccag ggatacgaca aggatatggg 1980
ctcactgaga ctacatcagc tattctgatt acacccgagg gggatgataa accgggcgcg 2040
gtcggtaaag ttgttccatt ttttgaagcg aaggttgtgg atctggatac cgggaaaacg 2100
ctgggcgtta atcagagagg cgaattatgt gtcagaggac ctatgattat gtccggttat 2160
gtaaacaatc cggaagcgac caacgccttg attgacaagg atggatggct acattctgga 2220
gacatagctt actgggacga agacgaacac ttcttcatag ttgaccgctt gaagtcttta 2280
attaaataca aaggatatca ggtggccccc gctgaattgg aatcgatatt gttacaacac 2340
cccaacatct tcgacgcggg cgtggcaggt cttcccgacg atgacgccgg tgaacttccc 2400
gccgccgttg ttgttttgga gcacggaaag acgatgacgg aaaaagagat cgtggattac 2460
gtggccagtc aagtaacaac cgcgaaaaag ttgcgcggag gagttgtgtt tgtggacgaa 2520
gtaccgaaag gtcttaccgg aaaactcgac gcaagaaaaa tcagagagat cctcataaag 2580
gccaagaagg gcggaaagtc caaattgtaa gctagagtcg gggcggccgg ccgcttcgag 2640
cagacatgat aagatacatt gatgagtttg gacaaaccac aactagaatg cagtgaaaaa 2700
aatgctttat ttgtgaaatt tgtgatgcta ttgctttatt tgtaaccatt ataagctgca 2760
ataaacaagt taacaacaac aattgcattc attttatgtt tcaggttcag ggggaggtgt 2820
gggaggtttt ttaaagcaag taaaacctct acaaatgtgg taaaatcgat aaggatccgt 2880
cgaccgatgc ccttgagagc cttcaaccca gtcagctcct tccggtgggc gcggggcatg 2940
actatcgtcg ccgcacttat gactgtcttc tttatcatgc aactcgtagg acaggtgccg 3000
gcagcgctct tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg 3060
agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc 3120
aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt 3180
gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag 3240
tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc 3300
cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc 3360
ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt 3420
cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt 3480
atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc 3540
agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa 3600
gtggtggcct aactacggct acactagaag gacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa 3660
gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg 3720
tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga 3780
agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg 3840
gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg 3900
aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt 3960
aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact 4020
ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat 4080
gataccgcga gacccacgct caccggctcc agatttatca gcaataaacc agccagccgg 4140
aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt ctattaattg 4200
ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat 4260
tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca gctccggttc 4320
ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt 4380
cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc 4440
agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga 4500
gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc 4560
gtcaatacgg gataataccg cgccacatag cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa 4620
acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta 4680
acccactcgt gcacccaact gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg 4740
agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg 4800
aatactcata ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat 4860
gagcggatac atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt 4920
tccccgaaaa gtgccacctg acgcgccctg tagcggcgca ttaagcgcgg cgggtgtggt 4980
ggttacgcgc agcgtgaccg ctacacttgc cagcgcccta gcgcccgctc ctttcgcttt 5040
cttcccttcc tttctcgcca cgttcgccgg ctttccccgt caagctctaa atcgggggct 5100
ccctttaggg ttccgattta gtgctttacg gcacctcgac cccaaaaaac ttgattaggg 5160
tgatggttca cgtagtgggc catcgccctg atagacggtt tttcgccctt tgacgttgga 5220
gtccacgttc tttaatagtg gactcttgtt ccaaactgga acaacactca accctatctc 5280
ggtctattct tttgatttat aagggatttt gccgatttcg gcctattggt taaaaaatga 5340
gctgatttaa caaaaattta acgcgaattt taacaaaata ttaacgttta caatttccca 5400
ttcgccattc aggctgcgca actgttggga agggcgatcg gtgcgggcct cttcgctatt 5460
acgccagccc aagctaccat gataagtaag taatattaag gtacgggagg tacttggagc 5520
ggccgcaata aaatatcttt attttcatta catctgtgtg ttggtttttt gtgtgaatcg 5580
atagtactaa catacgctct ccatcaaaac aaaacgaaac aaaacaaact agcaaaatag 5640
gctgtcccca gtgcaagtgc aggtgccaga acatttctct atcgata 5687
<210>6
<211>5764
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>AS300W-P9 6T8T表达载体(pSEAP AS300W-P9 6T8T-Luci)
<400>6
ggtaccgagc tcttacgcgt gctagcccgg gctcgagatc tgcgatctgc atctcaatta 60
gtcagcaacc atagtcccgc ccctaactcc gcccatcccg cccctaactc cgcccagttc 120
cgcccattct ccgccccatc gctgactaat tttttttatt tatgcagagg ccgaggccgc 180
ctcggcctct gagctattcc agaagtagtg aggaggcttt tttggaggcc taggcttttg 240
caaaaagctt aagccgaagg ccagcacgtt cttcgcgccg cgctcgcaca gcctctgcag 300
cactcgggcc accagctcct tcaggcagga cacctggcgg aaggaggggg cggcgggggg 360
cggccgtgcg tcccagggca cgcacaccag gcactgggcc accagcgcgc ggaaagccgc 420
cgggtccccg cgctgcacca gccgccagcc ctggggcccc aggcgccgca cgaacgtggc 480
cagcggcagc acctcgcggt agtggctgcg cagcagggag cgcacggcta ggcagcgggg 540
agcgcgcggc atcgcggggg tggccggggc cagggcttcc caagcttcgt tttgcggcag 600
gaaaagttat caggcatgca cctggtagct agtctttaaa ccaatagatt gcatcggttt 660
aaaaggcaag accgtcaaat tgcgggaaag gggtcaacag ccgttcagta ccaagtctca 720
ggggaaactt tgagatggcc ttgcaaaggg tatggtaata agctgacgga catggtccta 780
accacgcagc caagtcctaa gggatgatac cagccgaaag gcccttggca gcaattatgg 840
atgcagttca cagactaaat gtcggtcggg gatgatacca gccgaaaggc ccttggcagc 900
aatcataaga tatagtcgga cctctcctta atgggagcta gcggatgaag tgatgcaaca 960
ctggagccgc tgggaactaa tttgtatgcg aaagtatatt gattagtttt ggagtactcg 1020
cgaaaacgcc caccatggaa gacgccaaaa acataaagaa aggcccggcg ccattctatc 1080
ctctagagga tggaaccgct ggagagcaac tgcataaggc tatgaagaga tacgccctgg 1140
ttcctggaac aattgctttt acagatgcac atatcgaggt gaacatcacg tacgcggaat 1200
acttcgaaat gtccgttcgg ttggcagaag ctatgaaacg atatgggctg aatacaaatc 1260
acagaatcgt cgtatgcagt gaaaactctc ttcaattctt tatgccggtg ttgggcgcgt 1320
tatttatcgg agttgcagtt gcgcccgcga acgacattta taatgaacgt gaattgctca 1380
acagtatgaa catttcgcag cctaccgtag tgtttgtttc caaaaagggg ttgcaaaaaa 1440
ttttgaacgt gcaaaaaaaa ttaccaataa tccagaaaat tattatcatg gattctaaaa 1500
cggattacca gggatttcag tcgatgtaca cgttcgtcac atctcatcta cctcccggtt 1560
ttaatgaata cgattttgta ccagagtcct ttgatcgtga caaaacaatt gcactgataa 1620
tgaattcctc tggatctact gggttaccta agggtgtggc ccttccgcat agaactgcct 1680
gcgtcagatt ctcgcatgcc agagatccta tttttggcaa tcaaatcatt ccggatactg 1740
cgattttaag tgttgttcca ttccatcacg gttttggaat gtttactaca ctcggatatt 1800
tgatatgtgg atttcgagtc gtcttaatgt atagatttga agaagagctg tttttacgat 1860
cccttcagga ttacaaaatt caaagtgcgt tgctagtacc aaccctattt tcattcttcg 1920
ccaaaagcac tctgattgac aaatacgatt tatctaattt acacgaaatt gcttctgggg 1980
gcgcacctct ttcgaaagaa gtcggggaag cggttgcaaa acgcttccat cttccaggga 2040
tacgacaagg atatgggctc actgagacta catcagctat tctgattaca cccgaggggg 2100
atgataaacc gggcgcggtc ggtaaagttg ttccattttt tgaagcgaag gttgtggatc 2160
tggataccgg gaaaacgctg ggcgttaatc agagaggcga attatgtgtc agaggaccta 2220
tgattatgtc cggttatgta aacaatccgg aagcgaccaa cgccttgatt gacaaggatg 2280
gatggctaca ttctggagac atagcttact gggacgaaga cgaacacttc ttcatagttg 2340
accgcttgaa gtctttaatt aaatacaaag gatatcaggt ggcccccgct gaattggaat 2400
cgatattgtt acaacacccc aacatcttcg acgcgggcgt ggcaggtctt cccgacgatg 2460
acgccggtga acttcccgcc gccgttgttg ttttggagca cggaaagacg atgacggaaa 2520
aagagatcgt ggattacgtg gccagtcaag taacaaccgc gaaaaagttg cgcggaggag 2580
ttgtgtttgt ggacgaagta ccgaaaggtc ttaccggaaa actcgacgca agaaaaatca 2640
gagagatcct cataaaggcc aagaagggcg gaaagtccaa attgtaagct agagtcgggg 2700
cggccggccg cttcgagcag acatgataag atacattgat gagtttggac aaaccacaac 2760
tagaatgcag tgaaaaaaat gctttatttg tgaaatttgt gatgctattg ctttatttgt 2820
aaccattata agctgcaata aacaagttaa caacaacaat tgcattcatt ttatgtttca 2880
ggttcagggg gaggtgtggg aggtttttta aagcaagtaa aacctctaca aatgtggtaa 2940
aatcgataag gatccgtcga ccgatgccct tgagagcctt caacccagtc agctccttcc 3000
ggtgggcgcg gggcatgact atcgtcgccg cacttatgac tgtcttcttt atcatgcaac 3060
tcgtaggaca ggtgccggca gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg 3120
gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca 3180
gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac 3240
cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac 3300
aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg 3360
tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac 3420
ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat 3480
ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag 3540
cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac 3600
ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt 3660
gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac agtatttggt 3720
atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc 3780
aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga 3840
aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac 3900
gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt cacctagatc 3960
cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta tatatgagta aacttggtct 4020
gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct atttcgttca 4080
tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg cttaccatct 4140
ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac ccacgctcac cggctccaga tttatcagca 4200
ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc 4260
atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt taatagtttg 4320
cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct 4380
tcattcagct ccggttccca acgatcaagg cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa 4440
aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta 4500
tcactcatgg ttatggcagc actgcataat tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc 4560
ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg 4620
agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa 4680
gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt accgctgttg 4740
agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc ttttactttc 4800
accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg 4860
gcgacacgga aatgttgaat actcatactc ttcctttttc aatattattg aagcatttat 4920
cagggttatt gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata 4980
ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg cgccctgtag cggcgcatta 5040
agcgcggcgg gtgtggtggt tacgcgcagc gtgaccgcta cacttgccag cgccctagcg 5100
cccgctcctt tcgctttctt cccttccttt ctcgccacgt tcgccggctt tccccgtcaa 5160
gctctaaatc gggggctccc tttagggttc cgatttagtg ctttacggca cctcgacccc 5220
aaaaaacttg attagggtga tggttcacgt agtgggccat cgccctgata gacggttttt 5280
cgccctttga cgttggagtc cacgttcttt aatagtggac tcttgttcca aactggaaca 5340
acactcaacc ctatctcggt ctattctttt gatttataag ggattttgcc gatttcggcc 5400
tattggttaa aaaatgagct gatttaacaa aaatttaacg cgaattttaa caaaatatta 5460
acgtttacaa tttcccattc gccattcagg ctgcgcaact gttgggaagg gcgatcggtg 5520
cgggcctctt cgctattacg ccagcccaag ctaccatgat aagtaagtaa tattaaggta 5580
cgggaggtac ttggagcggc cgcaataaaa tatctttatt ttcattacat ctgtgtgttg 5640
gttttttgtg tgaatcgata gtactaacat acgctctcca tcaaaacaaa acgaaacaaa 5700
acaaactagc aaaataggct gtccccagtg caagtgcagg tgccagaaca tttctctatc 5760
gata 5764
<210>7
<211>1910
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>变构反式剪接I型核酶AS300 W-P9 6T8T-TK
<400>7
aaggccagca cguucuucgc gccgcgcucg cacagccucu gcagcacucg ggccaccagc 60
uccuucaggc aggacaccug gcggaaggag ggggcggcgg ggggcggccg ugcgucccag 120
ggcacgcaca ccaggcacug ggccaccagc gcgcggaaag ccgccggguc cccgcgcugc 180
accagccgcc agcccugggg ccccaggcgc cgcacgaacg uggccagcgg cagcaccucg 240
cgguaguggc ugcgcagcag ggagcgcacg gcuaggcagc ggggagcgcg cggcaucgcg 300
gggguggccg gggccagggc uucccaagcu ucguuuugcg gcaggaaaag uuaucaggca 360
ugcaccuggu agcuagucuu uaaaccaaua gauugcaucg guuuaaaagg caagaccguc 420
aaauugcggg aaagggguca acagccguuc aguaccaagu cucaggggaa acuuugagau 480
ggccuugcaa aggguauggu aauaagcuga cggacauggu ccuaaccacg cagccaaguc 540
cuaagggaug auaccagccg aaaggcccuu ggcagcaauu auggaugcag uucacagacu 600
aaaugucggu cggggaugau accagccgaa aggcccuugg cagcaaucau aagauauagu 660
cggaccucuc cuuaauggga gcuagcggau gaagugaugc aacacuggag ccgcugggaa 720
cuaauuugua ugcgaaagua uauugauuag uuuuggagua cucgaaaacg cccaccaugg 780
cuucguaccc cugccaucaa cacgcgucug cguucgacca ggcugcgcgu ucucgcggcc 840
auagcaaccg acguacggcg uugcgcccuc gccggcagca agaagccacg gaaguccgcc 900
uggagcagaa aaugcccacg cuacugcggg uuuauauaga cgguccucac gggaugggga 960
aaaccaccac cacgcaacug cugguggccc uggguucgcg cgacgauauc gucuacguac 1020
ccgagccgau gacuuacugg caggugcugg gggcuuccga gacaaucgcg aacaucuaca 1080
ccacacaaca ccgccucgac cagggugaga uaucggccgg ggacgcggcg gugguaauga 1140
caagcgccca gauaacaaug ggcaugccuu augccgugac cgacgccguu cuggcuccuc 1200
augucggggg ggaggcuggg aguucacaug ccccgccccc ggcccucacc cucaucuucg 1260
accgccaucc caucgccgcc cuccugugcu acccggccgc gcgauaccuu augggcagca 1320
ugacccccca ggccgugcug gcguucgugg cccucauccc gccgaccuug cccggcacaa 1380
acaucguguu gggggcccuu ccggaggaca gacacaucga ccgccuggcc aaacgccagc 1440
gccccggcga gcggcuugac cuggcuaugc uggccgcgau ucgccgcguu uacgggcugc 1500
uugccaauac ggugcgguau cugcagggcg gcgggucgug gugggaggau uggggacagc 1560
uuucggggac ggccgugccg ccccagggug ccgagcccca gagcaacgcg ggcccacgac 1620
cccauaucgg ggacacguua uuuacccugu uucgggcccc cgaguugcug gcccccaacg 1680
gcgaccugua uaacguguuu gccugggccu uggacgucuu ggccaaacgc cuccguccca 1740
ugcacgucuu uauccuggau uacgaccaau cgcccgccgg cugccgggac gcccugcugc 1800
aacuuaccuc cgggaugguc cagacccacg ucaccacccc aggcuccaua ccgacgaucu 1860
gcgaccuggc gcgcacguuu gcccgggaga ugggggaggc uaacugauua 1910
<210>8
<211>9996
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>AS300 W-P9 6T8T-TK表达载体(pAvQ-Theo-Rib21AS-TK)
<400>8
taacatcatc aataatatac cttattttgg attgaagcca atatgataat gagggggtgg 60
agtttgtgac gtggcgcggg gcgtgggaac ggggcgggtg acgtagtagt gtggcggaag 120
tgtgatgttg caagtgtggc ggaacacatg taagcgacgg atgtggcaaa agtgacgttt 180
ttggtgtgcg ccggtgtaca caggaagtga caattttcgc gcggttttag gcggatgttg 240
tagtaaattt gggcgtaacc gagtaagatt tggccatttt cgcgggaaaa ctgaataaga 300
ggaagtgaaa tctgaataat tttgtgttac tcatagcgcg taatactgcg atctatacat 360
tgaatcaata ttggcaatta gccatattag tcattggtta tatagcataa atcaatattg 420
gctattggcc attgcatacg ttgtatctat atcataatat gtacatttat attggctcat 480
gtccaatatg accgccatgt tgacattgat tattgactag ttattaatag taatcaatta 540
cggggtcatt agttcatagc ccatatatgg agttccgcgt tacataactt acggtaaatg 600
gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc 660
ccatagtaac gccaataggg actttccatt gacgtcaatg ggtggagtat ttacggtaaa 720
ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc atatgccaag tccgccccct attgacgtca 780
atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg cccagtacat gaccttacgg gactttccta 840
cttggcagta catctacgta ttagtcatcg ctattaccat ggtgatgcgg ttttggcagt 900
acaccaatgg gcgtggatag cggtttgact cacggggatt tccaagtctc caccccattg 960
acgtcaatgg gagtttgttt tggcaccaaa atcaacggga ctttccaaaa tgtcgtaata 1020
accccgcccc gttgacgcaa atgggcggta ggcgtgtacg gtgggaggtc tatataagca 1080
gagctcgttt agtgaaccgt cagatcctca ctctcttccg catcgctgtc tgcgagggcc 1140
agctgttggg ctcgcggttg aggacaaact cttcgcggtc tttccagtac tcttggatcg 1200
gaaacccgtc ggcctccgaa cggtactccg ccaccgaggg acctgagcca gtccgcatcg 1260
accggatcgg aaaacctctc gagaaaggcg tctaaccagt cacagtcgca aggtaggctg 1320
agcaccgtgg cgggcggcag cgggtggcgg tcggggttgt ttctggcgga ggtgctgctg 1380
atgatgtaat taaagtaggc ggtcttgagc cggcggatgg tcgaggtgag gtgtggcagg 1440
cttgagatcc agctgttggg gtgagtactc cctctcaaaa gcgggcatga cttctgcgct 1500
aagattgtca gtttccaaaa acgaggagga tttgatattc acctggcccg atctggccat 1560
acacttgagt gacaatgaca tccactttgc ctttctctcc acaggtgtcc actcccaggt 1620
ccaagtttgg aagatccaag gccagcacgt tcttcgcgcc gcgctcgcac agcctctgca 1680
gcactcgggc caccagctcc ttcaggcagg acacctggcg gaaggagggg gcggcggggg 1740
gcggccgtgc gtcccagggc acgcacacca ggcactgggc caccagcgcg cggaaagccg 1800
ccgggtcccc gcgctgcacc agccgccagc cctggggccc caggcgccgc acgaacgtgg 1860
ccagcggcag cacctcgcgg tagtggctgc gcagcaggga gcgcacggct aggcagcggg 1920
gagcgcgcgg catcgcgggg gtggccgggg ccagggcttc ccaagcttcg ttttgcggca 1980
ggaaaagtta tcaggcatgc acctggtagc tagtctttaa accaatagat tgcatcggtt 2040
taaaaggcaa gaccgtcaaa ttgcgggaaa ggggtcaaca gccgttcagt accaagtctc 2100
aggggaaact ttgagatggc cttgcaaagg gtatggtaat aagctgacgg acatggtcct 2160
aaccacgcag ccaagtccta agggatgata ccagccgaaa ggcccttggc agcaattatg 2220
gatgcagttc acagactaaa tgtcggtcgg ggatgatacc agccgaaagg cccttggcag 2280
caatcataag atatagtcgg acctctcctt aatgggagct agcggatgaa gtgatgcaac 2340
actggagccg ctgggaacta atttgtatgc gaaagtatat tgattagttt tggagtactc 2400
gaaaacgccc accatggctt cgtacccctg ccatcaacac gcgtctgcgt tcgaccaggc 2460
tgcgcgttct cgcggccata gcaaccgacg tacggcgttg cgccctcgcc ggcagcaaga 2520
agccacggaa gtccgcctgg agcagaaaat gcccacgcta ctgcgggttt atatagacgg 2580
tcctcacggg atggggaaaa ccaccaccac gcaactgctg gtggccctgg gttcgcgcga 2640
cgatatcgtc tacgtacccg agccgatgac ttactggcag gtgctggggg cttccgagac 2700
aatcgcgaac atctacacca cacaacaccg cctcgaccag ggtgagatat cggccgggga 2760
cgcggcggtg gtaatgacaa gcgcccagat aacaatgggc atgccttatg ccgtgaccga 2820
cgccgttctg gctcctcatg tcggggggga ggctgggagt tcacatgccc cgcccccggc 2880
cctcaccctc atcttcgacc gccatcccat cgccgccctc ctgtgctacc cggccgcgcg 2940
ataccttatg ggcagcatga ccccccaggc cgtgctggcg ttcgtggccc tcatcccgcc 3000
gaccttgccc ggcacaaaca tcgtgttggg ggcccttccg gaggacagac acatcgaccg 3060
cctggccaaa cgccagcgcc ccggcgagcg gcttgacctg gctatgctgg ccgcgattcg 3120
ccgcgtttac gggctgcttg ccaatacggt gcggtatctg cagggcggcg ggtcgtggtg 3180
ggaggattgg ggacagcttt cggggacggc cgtgccgccc cagggtgccg agccccagag 3240
caacgcgggc ccacgacccc atatcgggga cacgttattt accctgtttc gggcccccga 3300
gttgctggcc cccaacggcg acctgtataa cgtgtttgcc tgggccttgg acgtcttggc 3360
caaacgcctc cgtcccatgc acgtctttat cctggattac gaccaatcgc ccgccggctg 3420
ccgggacgcc ctgctgcaac ttacctccgg gatggtccag acccacgtca ccaccccagg 3480
ctccataccg acgatctgcg acctggcgcg cacgtttgcc cgggagatgg gggaggctaa 3540
ctgattcgaa agatcccaac gaaaagagag accacatggt ccttcttgag tttgtaacag 3600
ctgctgggat tacacatggc atggatgaac tgtacaactg aggatccccc gacctcgacc 3660
tctggctaat aaaggaaatt tattttcatt gcaatagtgt gttggaattt tttgtgtctc 3720
tcactcggaa ggacatatgg gagggcaaat catttggtcg agatccctcg gagatcggat 3780
ctgggcgtgg ttaagggtgg gaaagaatat ataaggtggg ggtcttatgt agttttgtat 3840
ctgttttgca gcagccgccg ccgccatgag caccaactcg tttgatggaa gcattgtgag 3900
ctcatatttg acaacgcgca tgcccccatg ggccggggtg cgtcagaatg tgatgggctc 3960
cagcattgat ggtcgccccg tcctgcccgc aaactctact accttgacct acgagaccgt 4020
gtctggaacg ccgttggaga ctgcagcctc cgccgccgct tcagccgctg cagccaccgc 4080
ccgcgggatt gtgactgact ttgctttcct gagcccgctt gcaagcagtg cagcttcccg 4140
ttcatccgcc cgcgatgaca agttgacggc tcttttggca caattggatt ctttgacccg 4200
ggaacttaat gtcgtttctc agcagctgtt ggatctgcgc cagcaggttt ctgccctgaa 4260
ggcttcctcc cctcccaatg cggtttaaaa cataaataaa aaaccagact ctgtttggat 4320
ttggatcaag caagtgtctt gctgtcttta tttaggggtt ttgcgcgcgc ggtaggcccg 4380
ggaccagcgg tctcggtcgt tgagggtcct gtgtattttt tccaggacgt ggtaaaggtg 4440
actctggatg ttcagataca tgggcataag cccgtctctg gggtggaggt agcaccactg 4500
cagagcttca tgctgcgggg tggtgttgta gatgatccag tcgtagcagg agcgctgggc 4560
gtggtgccta aaaatgtctt tcagtagcaa gctgattgcc aggggcaggc ccttggtgta 4620
agtgtttaca aagcggttaa gctgggatgg gtgcatacgt ggggatatga gatgcatctt 4680
ggactgtatt tttaggttgg ctatgttccc agccatatcc ctccggggat tcatgttgtg 4740
cagaaccacc agcacagtgt atccggtgca cttgggaaat ttgtcatgta gcttagaagg 4800
aaatgcgtgg aagaacttgg agacgccctt gtgacctcca agattttcca tgcattcgtc 4860
cataatgatg gcaatgggcc cacgggcggc ggcctgggcg aagatatttc tgggatcact 4920
aacgtcatag ttgtgttcca ggatgagatc gtcataggcc atttttacaa agcgcgggcg 4980
gagggtgcca gactgcggta taatggttcc atccggccca ggggcgtagt taccctcaca 5040
gatttgcatt tcccacgctt tgagttcaga tggggggatc atgtctacct gcggggcgat 5100
gaagaaaacg gtttccgggg taggggagat cagctgggaa gaaagcaggt tcctgagcag 5160
ctgcgactta ccgcagccgg tgggcccgta aatcacacct attaccgggt gcaactggta 5220
gttaagagag ctgcagctgc cgtcatccct gagcaggggg gccacttcgt taagcatgtc 5280
cctgactcgc atgttttccc tgaccaaatc cgccagaagg cgctcgccgc ccagcgatag 5340
cagttcttgc aaggaagcaa agtttttcaa cggtttgaga ccgtccgccg taggcatgct 5400
tttgagcgtt tgaccaagca gttccaggcg gtcccacagc tcggtcacct gctctacggc 5460
atctcgatcc agcatatctc ctcgtttcgc gggttggggc ggctttcgct gtacggcagt 5520
agtcggtgct cgtccagacg ggccagggtc atgtctttcc acgggcgcag ggtcctcgtc 5580
agcgtagtct gggtcacggt gaaggggtgc gctccgggct gcgcgctggc cagggtgcgc 5640
ttgaggctgg tcctgctggt gctgaagcgc tgccggtctt cgccctgcgc gtcggccagg 5700
tagcatttga ccatggtgtc atagtccagc ccctccgcgg cgtggccctt ggcgcgcagc 5760
ttgcccttgg aggaggcgcc gcacgagggg cagtgcagac ttttgagggc gtagagcttg 5820
ggcgcgagaa ataccgattc cggggagtag gcatccgcgc cgcaggcccc gcagacggtc 5880
tcgcattcca cgagccaggt gagctctggc cgttcggggt caaaaaccag gtttccccca 5940
tgctttttga tgcgtttctt acctctggtt tccatgagcc ggtgtccacg ctcggtgacg 6000
aaaaggctgt ccgtgtcccc gtatacagac ttgagaggga gtttaaacga attcaatagc 6060
ttgttgcatg ggcggcgata taaaatgcaa ggtgctgctc aaaaaatcag gcaaagcctc 6120
gcgcaaaaaa gaaagcacat cgtagtcatg ctcatgcaga taaaggcagg taagctccgg 6180
aaccaccaca gaaaaagaca ccatttttct ctcaaacatg tctgcgggtt tctgcataaa 6240
cacaaaataa aataacaaaa aaacatttaa acattagaag cctgtcttac aacaggaaaa 6300
acaaccctta taagcataag acggactacg gccatgccgg cgtgaccgta aaaaaactgg 6360
tcaccgtgat taaaaagcac caccgacagc tcctcggtca tgtccggagt cataatgtaa 6420
gactcggtaa acacatcagg ttgattcatc ggtcagtgct aaaaagcgac cgaaatagcc 6480
cgggggaata catacccgca ggcgtagaga caacattaca gcccccatag gaggtataac 6540
aaaattaata ggagagaaaa acacataaac acctgaaaaa ccctcctgcc taggcaaaat 6600
agcaccctcc cgctccagaa caacatacag cgcttcacag cggcagccta acagtcagcc 6660
ttaccagtaa aaaagaaaac ctattaaaaa aacaccactc gacacggcac cagctcaatc 6720
agtcacagtg taaaaaaggg ccaagtgcag agcgagtata tataggacta aaaaatgacg 6780
taacggttaa agtccacaaa aaacacccag aaaaccgcac gcgaacctac gcccagaaac 6840
gaaagccaaa aaacccacaa cttcctcaaa tcgtcacttc cgttttccca cgttacgtaa 6900
cttcccattt taagaaaact acaattccca acacatacaa gttactccgc cctaaaacct 6960
acgtcacccg ccccgttccc acgccccgcg ccacgtcaca aactccaccc cctcattatc 7020
atattggctt caatccaaaa taaggtatat tattgatgat gttaattaac atgcatggat 7080
ccatatgcgg tgtgaaatac cgcacagatg cgtaaggaga aaataccgca tcaggcgctc 7140
ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc 7200
agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa 7260
catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt 7320
tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg 7380
gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg 7440
ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag 7500
cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc 7560
caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa 7620
ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg 7680
taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc 7740
taactacggc tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac 7800
cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg 7860
tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt 7920
gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt 7980
catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa 8040
atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct taatcagtga 8100
ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt 8160
gtagataact acgatacggg agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg 8220
agacccacgc tcaccggctc cagatttatc agcaataaac cagccagccg gaagggccga 8280
gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag tctattaatt gttgccggga 8340
agctagagta agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca ttgctgcagc 8400
catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatccttttc acgtagaaag ccagtccgca 8460
gaaacggtgc tgaccccgga tgaatgtcag ctactgggct atctggacaa gggaaaacgc 8520
aagcgcaaag agaaagcagg tagcttgcag tgggcttaca tggcgatagc tagactgggc 8580
ggttttatgg acagcaagcg aaccggaatt gccagctggg gcgccctctg gtaaggttgg 8640
gaagccctgc aaagtaaact ggatggcttt ctcgccgcca aggatctgat ggcgcagggg 8700
atcaagctct gatcaagaga caggatgagg atcgtttcgc atgattgaac aagatggatt 8760
gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga gaggctattc ggctatgact gggcacaaca 8820
gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca gcgcaggggc gcccggttct 8880
ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct gaatgaactg caagacgagg cagcgcggct 8940
atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg cgcagctgtg ctcgacgttg tcactgaagc 9000
gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag gatctcctgt catctcacct 9060
tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg cggcggctgc atacgcttga 9120
tccggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc atcgagcgag cacgtactcg 9180
gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa gagcatcagg ggctcgcgcc 9240
agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgag catgcccgac ggcgaggatc tcgtcgtgac 9300
ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat ggccgctttt ctggattcat 9360
cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac atagcgttgg ctacccgtga 9420
tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc ctcgtgcttt acggtatcgc 9480
cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt gacgagttct tctgaatttt 9540
gttaaaattt ttgttaaatc agctcatttt ttaaccaata ggccgaaatc ggcaacatcc 9600
cttataaatc aaaagaatag accgcgatag ggttgagtgt tgttccagtt tggaacaaga 9660
gtccactatt aaagaacgtg gactccaacg tcaaagggcg aaaaaccgtc tatcagggcg 9720
atggcccact acgtgaacca tcacccaaat caagtttttt gcggtcgagg tgccgtaaag 9780
ctctaaatcg gaaccctaaa gggagccccc gatttagagc ttgacgggga aagccggcga 9840
acgtggcgag aaaggaaggg aagaaagcga aaggagcggg cgctagggcg ctggcaagtg 9900
tagcggtcac gctgcgcgta accaccacac ccgcgcgctt aatgcgccgc tacagggcgc 9960
gtccattcgc cattcaggat cgaattaatt cttaat 9996
<210>9
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>9
ggggaattct aatacgactc actatagggc aggcagcgct gcgtcct 47
<210>10
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>10
cgggatccct ggcggaagga gggggcggcg gg 32
<210>11
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>11
ggggaattct aatacgactc actataggca ggaaaagtta tcaggca 47
<210>12
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>12
cgagtactcc aaaactaatc aa 22
<210>13
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>13
cgatgatcac gaagacgc 18
<210>14
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>14
aaggaaaaaa gcggccgctt attacaattt ggacttt 37
<210>15
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>15
cgggatccct ggcggaagga gggggcggcg gg 32
<210>16
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>16
ggggaattct aatacgactc actataggca ggaaaagtta tcaggca 47
<210>17
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>17
cccaagcttg cgcaactgca actccgataa 30
<210>18
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>18
cccaagcttg cgcaactgca actccgataa 30
<210>19
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>19
ggaattcgca gcgctgcgtc ctgct 25
<210>20
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>20
cccaagcttt cactgcatac gacgatt 27
<210>21
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>21
gcccaacacc ggcataaagt tacataatta cacactt 37
<210>22
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>22
cccgaattct gcgtcctgct cga 23
<210>23
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>23
cccaagcttt cactgcatac acgatt 26
<210>24
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>24
atgactgaat ataaactt 18
<210>25
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>25
cccaagcttt acataattac acactt 26
<210>26
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>26
aattcaagct tcgttttgcg gcagcaggaa aagttatcag gcatg 45
<210>27
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>27
cctgataact tttcctgccg caaaacgaag cttg 34
<210>28
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>28
gggaagcttg ggaagccctg gccc 24
<210>29
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>29
gggaagctta aggccagcac gttctt 26
<210>30
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>30
cccaagcttg cgcaactgca actccgataa 30
<210>31
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>31
cccaagcttg cccaacaccg gcataaag 28
<210>32
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>32
agcgctgcgt cctgct 16
<210>33
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>33
tgacatcaag aaggtggtga 20
<210>34
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>34
tccaccaccc tgttgctgta 20
<210>35
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>35
cccatgcacg tctttatcct ggat 24
<210>36
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>36
ggaattcgca gcgctgcgtc ctgct 25
<210>37
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>37
tgacatcaag aaggtggtga 20
<210>38
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>38
tccaccaccc tgttgctgta 20
<210>39
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>39
ggggaattct aatacgactc actataggca ggaaaagtta tcaggca 47
机译: 变构反转录I类核酶,其靶特异性RNA替代活性受茶碱调节
机译: 变构转拼I组核酶,其靶特异性RNA替代的活性受茶碱控制
机译: 变构反转录I类核酶,其靶特异性RNA替代活性受茶碱调节