使用CXCL9和抗CXCL9抗体促进骨髓保护和再生的方法

摘要

若在用化疗药(诸如5－FU)或放疗治疗受试者前施用CXCL9，则其促进骨髓再生、增加外周白血球、并提高存活。化疗或放疗后施用抗CXCL9抗体得到类似效果。本发明提供了用于治疗癌症和骨髓疾病的组合物和方法。

说明书

发明领域

本发明涉及使用CXCL9和抗CXCL9抗体促进骨髓保护和再生的方法。

发明背景

CXCL9，也称为CXCL9(由IFN-γ诱导的单核因子)，1990年最初从小鼠巨噬细胞系RAW 264.7中发现[1]。它是趋化因子CXC亚族的一员，其特征在于其头两个半胱氨酸被单个氨基酸隔开。在体内，CXCL9由巨噬细胞应答IFN-γ产生，但不应答其它巨噬细胞活化物，包括IFN-α、IFN-β和LPS。已知CXCL9是针对活化的T淋巴细胞[2]、肿瘤浸润淋巴细胞[3]以及NK细胞和TH1淋巴细胞[4]的趋化物。已有人主要调查它在自身免疫性疾病[6]、同种异体移植物排斥[7]和癌症治疗[8]中的作用。

除了上文提到的在免疫系统中的作用外，CXCL9还有两项其它已知的功能。第一，CXCL9是一种血管抑制剂(angiostatic agent)[10，11]。Zhang等根据CXCL9在肿瘤中的抗血管发生效应设计了一种基因治疗方法[8]。他们将pORF-CXCL9与低剂量的顺铂组合来治疗肿瘤，而且该组合显示了显著的抗肿瘤活性。第二，CXCL9在体外抑制由多种生长因子刺激的髓样祖细胞增殖[5，9]。许多CXC趋化因子，例如PF4(血小板因子)，具有骨髓抑制活性[5]。此外，在受因子(诸如G-CSF)刺激的造血细胞中，CXCR3表达上调[12]。

骨髓抑制是癌症化疗或放疗的致命副作用的主要原因。已经开发了许多药物应对骨髓抑制。迄今为止，已使用两种办法来保护骨髓免于化疗或放疗的毒性。在一种办法中，在治疗前施用正调节物以刺激重要的干细胞、祖细胞、或末期造血细胞增殖。这些正调节物，包括IL-6[13]和CSF[14，15]，能在化疗前使得造血细胞增加，从而允许更迅速的恢复。另一种办法是在化疗或放疗后施用这些调节物以增强造血细胞增殖，同样得到更好的恢复。

仍然需要开发新的组合物和方法来预防或降低骨髓抑制，以及改善由化疗、放疗、和其它骨髓毒剂引起的骨髓抑制的恢复。

发明概述

本发明提供了使用CXCL9和抗CXCL9抗体来保护造血细胞和其它骨髓细胞免于化疗或放疗有害效应的方法。本发明还提供了癌症和各种骨髓病症的治疗方法。一方面，所述方法是基于CXCL9的骨髓抑制作用，而另一方面，是基于抗CXCL9抗体抵消此类骨髓抑制效应的能力。本发明提供了增强受抑制的造血系统恢复的新途径，作为化疗或放疗方案的一部分，特别是在癌症治疗中。

本发明的方法有能力保护造血细胞(特别是干细胞和祖细胞)免于化疗、放疗或两者组合的破坏效应。有人发现了CXCL9在体外抑制造血细胞增殖。在对小鼠施用化疗剂前施用CXCL9作为试剂或治疗剂，使得动物中骨髓和循环白细胞更加迅速地恢复，而且存活率更高。抗CXCL9抗体作为试剂或治疗剂使得外周白血球计数恢复更好，存活率更高。CXCL9和抗CXCL9抗体还可以作为包含药学可接受载体的组合物施用。此外，CXCL9和抗CXCL9抗体还可以作为治疗方案的一部分施用，其能在化疗或放疗之前和之后提供治疗。

在一个方面，本发明提供了在化疗和放疗期间预防骨髓细胞损害的方法。该方法包括在受试者接受化疗或放疗前对受试者施用有效量(例如治疗有效量)的CXCL9。化疗或放疗后，所述受试者的骨髓细胞密度与未接受CXCL9的受试者所发生的情况相比升高。也就是说，通过用CXCL9进行的预处理，化疗或放疗后通常伴随的骨髓细胞密度降低得以部分或全部逆转。

本发明的另一个方面是在化疗或放疗后提高外周白血球水平的方法。该方法包括在对受试者施用化疗或放疗前对受试者施用有效量的CXCL9。通过用CXCL9进行的预处理，化疗或放疗后通常伴随的外周白细胞减少得以部分或全部逆转。

本发明的又一个方面是治疗癌症的方法。根据此方法，对患有癌症的受试者施用CXCL9，然后对该受试者施用化疗或放疗。

在本发明的一个方面，提供了预防由化疗或放疗引起的骨髓细胞损害的方法。该方法可包括在对受试者施用化疗或放疗前对所述受试者施用有效量的CXCL9或CXCR3激动剂。优选地，在化疗或放疗后，所述受试者的骨髓细胞密度与未接受CXCL9或CXCR3激动剂的对照受试者相比升高。

在另一个方面，本发明提供了在化疗或放疗后提高外周白血球水平的方法。例如，该方法包括在对受试者施用化疗或放疗前对所述受试者施用有效量的CXCL9或CXCR3激动剂。化疗或放疗后，所述受试者的外周白血球水平与未接受CXCL9或CXCR3激动剂的对照受试者相比优选升高。

在本发明的一个方面，提供了治疗癌症的方法，其包括对患有癌症的受试者施用有效量的CXCL9或CXCR3激动剂。该方法还可包括在施用CXCL9或CXCR3激动剂后对所述受试者施用化疗或放疗。

在本发明的另一个方面，提供了预防由化疗或放疗引起的骨髓细胞损害的方法。该方法包括在对受试者施用化疗或放疗前对所述受试者施用有效量的CXCL9或CXCR3激动剂。该方法还可包括在施用CXCL9或CXCR3激动剂后对所述受试者施用化疗或放疗。此外，本发明的方法可进一步包括对所述受试者施用有效量的选自下组的试剂(例如治疗剂)：抗CXCL9抗体、CXCL9siRNA、CXCL9反义核酸、CXCR3抗体、CXCR3siRNA、CXCR3反义核酸和CXCR3拮抗剂以及其组合。优选地，在化疗或放疗后，所述受试者的骨髓细胞密度与未接受所述试剂的对照受试者相比升高。本发明的试剂或治疗剂也可以作为包含治疗有效量的试剂及药学可接受载体的组合物来施用。

在一个方面，提供了在化疗或放疗后提高外周白血球水平的方法。例如，该方法可包括对受试者施用有效量的CXCL9或CXCR3的激动剂。该方法可进一步包括在施用CXCL9或CXCR3激动剂后对所述受试者施用化疗或放疗。在另一个方面，该方法可包括对所述受试者施用有效量(例如治疗有效量)的选自下组的试剂：抗CXCL9抗体、CXCL9siRNA、CXCL9反义核酸、CXCR3抗体、CXCR3siRNA、CXCR3反义核酸和CXCR3拮抗剂以及其组合，使得在化疗或放疗后，所述受试者的外周白血球水平与未接受所述试剂的对照受试者相比升高。

在另一个方面，提供了治疗癌症的方法。该方法包括对患有癌症的受试者施用有效量的CXCL9或CXCR3激动剂。优选地，该方法还包括在施用CXCL9或CXCR3激动剂后对所述受试者施用化疗或放疗。该方法还可包括对所述受试者施用有效量的选自下组的试剂：抗CXCL9抗体、CXCL9siRNA、CXCL9反义核酸、CXCR3抗体、CXCR3siRNA、CXCR3反义核酸、CXCR3拮抗剂及其组合。

在本发明的一个方面，提供了预防由化疗或放疗引起的骨髓细胞损害的方法。该方法包括对受试者施用化疗或放疗。该方法还包括对所述受试者施用有效量的选自下组的试剂：抗CXCL9抗体、CXCL9siRNA、CXCL9反义核酸、CXCR3抗体、CXCR3siRNA、CXCR3反义核酸和CXCR3拮抗剂以及其组合。优选地，在化疗或放疗后，所述受试者的骨髓细胞密度与未接受所述试剂的对照受试者相比升高。

在一个方面，本发明的方法包括在化疗或放疗后提高外周白血球水平。该方法可包括对所述受试者施用化疗或放疗。此外，该方法可包括对所述受试者施用有效量的选自下组的试剂：抗CXCL9抗体、CXCL9siRNA、CXCL9反义核酸、CXCR3抗体、CXCR3siRNA、CXCR3反义核酸、和CXCR3拮抗剂，使得在化疗或放疗后，所述受试者的外周白血球水平与未接受所述试剂的对照受试者相比升高。

在本发明的另一个方面，提供了治疗癌症的方法。该方法包括对患有癌症的受试者施用化疗或放疗。该方法还包括对所述受试者施用有效量的选自下组的试剂：抗CXCL9抗体、CXCL9siRNA、CXCL9反义核酸、CXCR3抗体、CXCR3siRNA、CXCR3反义核酸和CXCR3拮抗剂。

本发明的方法还可以用细胞周期特异性的化疗(例如化疗方案或制度)来实施。例如，本发明方法的化疗可包括施用选自下组的试剂：5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、阿糖胞苷(Ara-C)、长春碱(vinblastine)、甲氨蝶呤(methotrexate)及其组合。在一个方面，本发明的方法可以用细胞周期非特异性的化疗来实施。例如，本发明方法的化疗可包括施用选自下组的试剂：环磷酰胺(cyclophosphamide)、多柔比星(doxorubicin)、顺铂(cisplatin)、白消安(busulfan)及其组合。

在一个方面，本发明的方法可包括放疗，其牵涉施用外线束辐射(externalbeam radiation)或放射性药剂(radiopharmaceutical agent)。本发明的方法还可包括在施用所述化疗或所述放疗前以日剂量施用CXCL9两天或更多天(但不限于两天或更多天)。例如，可以施用CXCL95天或更多天。在本发明方法的另一个方面，可经由真核表达载体来施用CXCL9。本发明方法的一种例示性表达载体为pcDNA3.1(-)。

对于本发明的方法，表达载体可通过骨骼肌的电穿孔来施用。或者，可在体外对来自受试者的骨髓细胞施用表达载体。在一个方面，本发明的方法可包括以偶联形式或CXCL9融合蛋白来施用CXCL9。例示性的CXCL9融合蛋白可以是清蛋白-CXCL9融合蛋白。优选地，清蛋白可以是血清清蛋白，更优选地，是人血清清蛋白(HSA)。偶联形式的CXCL9或CXCL9融合蛋白可改变CXCL9的半衰期(例如治疗半衰期)，这对于某些化疗或放疗治疗方案会是有利的。

在一个方面，本发明的方法可包括施用选自下组的试剂：抗CXCL9抗体、CXCL9siRNA、CXCL9反义核酸、CXCR3抗体、CXCR3反义核酸、CXCR3siRNA及其组合。例如，可在施用化疗或所述放疗后以日剂量施用所述试剂两天或更多天(但不限于两天或更多天)。优选地，可在施用化疗或放疗后施用所述试剂至少10天。在本发明的另一个方面，抗CXCL9抗体或CXCR3抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。抗CXCL9抗体或CXCR3抗体还可以是Fab片段、scFv抗体或单域抗体。抗CXCL9抗体或CXCR3抗体还可以是嵌合抗体、人源化抗体(任选包括回复突变)或人抗体。

本发明的抗CXCL9抗体或CXCR3抗体还可以作为偶联形式提供。在一个方面，本发明的方法包括施用CXCL9siRNA。例如，CXCL9siRNA可包含与SEQ ID NO：10的18-30个连续核苷酸互补的序列，或者CXCR3siRNA可包含与SEQ ID NO：11的18-30个连续核苷酸互补的序列。在本发明的另一个方面，提供了治疗患有特征在于骨髓细胞减少的骨髓病症的受试者的方法。该方法包括对所述受试者施用有效量的选自下组的试剂：抗CXCL9抗体、CXCL9siRNA、CXCL9反义核酸、CXCR3抗体、CXCR3反义核酸、CXCR3siRNA及其组合。优选地，有效量的试剂提高受试者的骨髓细胞密度。

对于本发明的方法，要治疗的骨髓病症选自下组：全血细胞减少症(pancytopenia)、再生障碍性贫血(aplastic anemia)、血小板减少症(thrombocytopenia)、白细胞减少症(leucopenia)、中性粒细胞减少症(neutropenia)、和骨髓纤维化(myelofibrosis)。依照本发明的方法施用的试剂可以以日剂量施用两天或更多天(但不限于两天或更多天)。类似的，该方法可包括施用所述试剂至少10天。在一个方面，抗CXCL9抗体或CXCR3抗体是多克隆抗体或单克隆抗体。如本文中所描述的，抗CXCL9抗体或CXCR3抗体可以是Fab片段、scFv抗体或单域抗体。

本发明还提供了CXCL9或CXCR3激动剂在制备用于预防骨髓细胞损害的药剂中的用途。在一个方面，本发明提供了CXCL9或CXCR3激动剂在制备用于提高外周白血球水平的药剂中的用途。在另一个方面，本发明提供了在制备用于治疗癌症的药剂中的用途CXCL9或CXCR3激动剂。在又一个方面，本发明提供了抗CXCL9抗体、CXCL9siRNA、CXCL9反义核酸、CXCR3抗体、CXCR3siRNA、CXCR3反义核酸、CXCR3拮抗剂或其组合在制备用于预防骨髓细胞损害的药剂中的用途。本发明进一步提供了抗CXCL9抗体、CXCL9siRNA、CXCL9反义核酸、CXCR3抗体、CXCR3siRNA、CXCR3反义核酸、或CXCR3拮抗剂在制备用于提高外周白血球水平的药剂中的用途。

在一个方面，本发明提供了抗CXCL9抗体、CXCL9siRNA、CXCL9反义核酸、CXCR3抗体、CXCR3siRNA、CXCR3反义核酸、或CXCR3拮抗剂在制备用于治疗癌症的药剂中的用途。在另一个方面，本发明提供了抗CXCL9抗体、CXCL9siRNA、CXCL9反义核酸、CXCR3抗体、CXCR3siRNA、CXCR3反义核酸、或CXCR3拮抗剂在制备用于治疗骨髓病症的药剂中的用途。本发明还提供了包含治疗有效量的CXCL9及药学可接受载体的组合物。该组合物可包含以有效预防由化疗或放疗引起的骨髓细胞损害的量存在的CXCL9。

在一个方面，本发明的组合物包含以有效提高化疗或放疗后外周白血球水平的量存在的CXCL9。在另一个方面，本发明的组合物包含以有效治疗癌症的量存在的CXCL9。本发明还提供了包含治疗有效量的CXCR3激动剂及药学可接受载体的组合物。例如，CXCR3激动剂可以以有效预防由化疗或放疗引起的骨髓细胞损害的量存在。

本发明还提供了一种组合物，其包含以有效提高化疗或放疗后外周白血球水平的量存在的CXCR3激动剂。在一个方面，该组合物包含以有效治疗癌症的量存在的CXCR3激动剂。在又一个方面，该组合物可包含治疗有效量的抗CXCL9抗体及药学可接受载体。优选地，抗CXCL9抗体可以以有效预防由化疗或放疗引起的骨髓细胞损害的量存在。本发明的例示性组合物可包含以有效提高化疗或放疗后外周白血球水平的量存在的抗CXCL9抗体。

本发明还提供了一种组合物，其中抗CXCL9抗体可以以有效治疗癌症的量存在。在一个方面，本发明的组合物包含治疗有效量的CXCL9siRNA及药学可接受载体。例如，本发明组合物的CXCL9siRNA可以以有效预防由化疗或放疗引起的骨髓细胞损害的量存在。此外，本发明提供了一种组合物，其中所述CXCL9siRNA可以以有效提高化疗或放疗后外周白血球水平的量存在。优选地，该组合物可包含以有效治疗癌症的量存在的CXCL9siRNA。在另一个方面，本发明的组合物可包含治疗有效量的CXCR3抗体及药学可接受载体。

在一个方面，所述CXCR3抗体的组合物可以以有效预防由化疗或放疗引起的骨髓细胞损害的量存在。本发明的组合物可包含以有效提高化疗或放疗后外周白血球水平的量存在的CXCR3抗体。本发明的例示性组合物可包含以有效治疗癌症的量存在的所述CXCR3抗体。本发明还提供了包含治疗有效量的CXCR3siRNA及药学可接受载体的组合物。

在另一个方面，本发明的组合物可包含以有效预防由化疗或放疗引起的骨髓细胞损害的量存在的CXCR3siRNA。本发明还提供了以有效提高化疗或放疗后外周白血球水平的量存在的CXCR3siRNA。在又一个方面，本发明提供了一种组合物，其中CXCR3siRNA以有效治疗癌症的量存在。本发明进一步提供了包含治疗有效量的CXCR3拮抗剂及药学可接受载体的组合物。

在一个方面，本发明的组合物包含以有效预防由化疗或放疗引起的骨髓细胞损害的量存在的CXCR3激动剂。在本发明的又一个方面，CXCR3激动剂可以以有效提高化疗或放疗后外周白血球水平的量存在。本发明的组合物可包含以有效治疗癌症的量存在的CXCR3激动剂。

本发明还提供了一种组合物，其中CXCL9表达载体可以以有效提高化疗或放疗后外周白血球水平的量存在。此外，本发明的组合物可包含以有效治疗癌症的量存在的CXCL9表达载体。例如，本发明的组合物可包含治疗有效量的CXCL9真核表达载体。例如，CXCL9表达载体可以以对于本发明的组合物预防由化疗或放疗引起的骨髓细胞损害而言有效的量存在。

本发明的又一个方面是纯化哺乳动物CXCL9蛋白(诸如人或小鼠CXCL9蛋白)的方法。该方法包括使CXCL9在低于CXCL9pI的pH值结合至阳离子交换剂，清洗阳离子交换剂以除去其它蛋白质，及使阳离子交换剂与具有离子强度渐增的梯度的洗脱缓冲液接触，其中从阳离子交换剂上洗脱纯化的CXCL9蛋白。

本发明的还有一个方面还有联合疗法(combination therapy)，其用以预防骨髓损害，或增加化疗或放疗后的外周白血球，或治疗癌症或骨髓病症。在有些实施方案中，除了在化疗或放疗前施用CXCL9或CXCR3激动剂之外，或者除了在化疗或放疗后施用CXCR3拮抗剂(包括CXCL9抗体、CXCL9siRNA、CXCL9反义核酸、CXCR3抗体、CXCR3siRNA、CXCR3反义核酸或小分子CXCR3拮抗剂)之外，还在化疗或放疗前施用骨髓抑制剂，诸如CCL3。在其它实施方案中，除了在化疗或放疗前施用CXCL9或CXCR3激动剂之外，或者除了在化疗或放疗后施用CXCR3拮抗剂(包括CXCL9抗体、CXCL9siRNA、CXCL9反义核酸、CXCR3抗体、CXCR3siRNA、CXCR3反义核酸、或小分子CXCR3拮抗剂)之外，还在化疗或放疗后施用造血生长因子，诸如GM-CSF或G-CSF。

本发明的任何方法都可包括哺乳动物受试者，优选人受试者。在本发明的另一个方面，提供了增强化疗或放疗治疗癌症的效力的方法。优选地，该方法包括对患有癌症的受试者施用有效量的CXCL9或CXCR3激动剂，并且以比不施用CXCL9或CXCR3激动剂的情况中所施用的剂量更高的剂量施用化疗或放疗。对于本发明的方法，通过对受试者施用CXCL9或CXCR3激动剂能增强化疗或放疗的效力。本发明还提供了一种组合物，其包含治疗有效量的抗CXCL9抗体、CXCL9siRNA、CXCL9反义核酸、CXCR3抗体、CXCR3反义核酸、CXCR3siRNA或其组合及药学可接受载体。例如，本发明提供了一种组合物，其以有效预防由化疗或放疗引起的骨髓细胞损害的剂量包含抗CXCL9抗体、CXCL9siRNA、CXCL9反义核酸、CXCR3抗体、CXCR3反义核酸、CXCR3siRNA或其组合。在本发明的还有一个方面，抗CXCL9抗体、CXCL9siRNA、CXCL9反义核酸、CXCR3抗体、CXCR3反义核酸、CXCR3siRNA或其组合以有效提高化疗或放疗后外周白血球水平的量存在于本发明的组合物中。本发明的组合物还可包含以有效治疗癌症的量存在的抗CXCL9抗体、CXCL9siRNA、CXCL9反义核酸、CXCR3抗体、CXCR3反义核酸、CXCR3siRNA或其组合。

附图简述

图1A显示了5-FU处理后小鼠血清中CXCL9水平的ELISA结果。图1B显示了5-FU处理后小鼠中CXCL9基因的表达水平。

图2A显示了用pcDNA3.1和pcDNA3.1-CXCL9转染后的外周白血球计数。图2B显示了用pcDNA3.1和pcDNA3.1-CXCL9转染后的小鼠骨髓细胞计数。在第5天，CXCL9组显示出比对照组细胞少，而且该样式持续至第17天。用单向(one-way)ANOVA)计算了两组之间的差异显著性，且p^*＜0.01。图2C显示了用pcDNA3.1-CXCL9转染后CXCL9的血清表达水平，通过ELISA测定。

图3A显示了用5-FU处理小鼠后的外周白血球计数。如图所示用pcDNA3.1或pcDNA3.1-CXCL9转染小鼠。图3B显示了来自与图3A所示小鼠同组的骨髓细胞计数。

图4A显示了用图示量的rMuCXCL9或用PBS作为对照处理小鼠后，作为时间函数的外周白血球计数。图4B显示了来自与图4A所示小鼠同组的骨髓细胞计数。

图5A显示了在第0天用5-FU处理小鼠后，作为时间函数的外周白血球计数。如图所示，小鼠在第-5天至第-1天还接受了rMuCXCL9或PBS。图5B显示了来自与图5A所示小鼠同组的骨髓细胞计数。图5C显示了相同rMuCXCL9和对照小鼠的存活曲线。

图6A显示了在第0天用5-FU处理小鼠后，作为时间函数的外周白血球计数。如图所示，小鼠在第0天至第10天还接受了针对MuCXCL9的多克隆大鼠抗血清或对照血清。图6B显示了来自与图6A所示小鼠同组的骨髓细胞计数。图6C显示了相同rMuCXCL9抗血清和对照血清小鼠的存活曲线。

图7显示了质粒pET28a-m(SEQ ID NO：7)的图谱。标有下划线的字母为引物，正向引物包含Nco I位点和额外的“AC”部分。反向引物包含Xho I位点和天然终止密码子“TAA”。

图8A显示了自rMuCXCL9在大肠杆菌(E.coli)BL21中表达得到的级分的SDS-PAGE图谱。泳道M：分子量标志物。泳道1：未诱导的大肠杆菌溶胞物。泳道2：IPTG诱导后的大肠杆菌溶胞物。泳道3：经诱导的大肠杆菌超声处理后的大肠杆菌溶胞物的上清液。泳道4：经诱导的大肠杆菌超声处理后的大肠杆菌溶胞物的沉淀物级分。图8B显示了大肠杆菌溶胞物的Western印迹，其中使用商品化抗CXCL9抗体。泳道1：未诱导的大肠杆菌溶胞物。泳道2：经IPTG诱导的大肠杆菌溶胞物。

图9A显示了rMuCXCL9纯化图谱，其中使用S-Sepharose柱。图9B显示了来自图9A的峰2的SDS-PAGE分析。泳道M：分子量标志物。泳道1：所洗脱的rMuCXCL9蛋白。

图10A显示了5μg峰2rMuCXCL9的SDS-PAGE图谱。图10B显示了峰2rMuCXCL9的毛细管电泳图谱。9分钟后观察到单峰，峰值为60mAU。毛细管电泳利用裸的(bare)熔融石英毛细管运行，有效长度20cm、75μm ID，分离在10kV进行，214nm检测，使用pH 11的40mM磷酸盐缓冲液。

图11显示了rMuCXCL9对小鼠脾淋巴细胞的趋化性。

图12显示了质粒pET28a-h(SEQ ID NO：8)的图谱。标有下划线的字母为引物，正向引物包含Nco I位点和额外的“CT”部分。反向引物包含BamH I位点和天然终止密码子“TAA”。

图13显示了自rHuCXCL9在大肠杆菌BL21中表达得到的级分的SDS-PAGE图谱。泳道M：分子量标志物。泳道1：未诱导的大肠杆菌细胞溶胞物。泳道2：经IPTG诱导的大肠杆菌溶胞物。泳道3：经诱导的大肠杆菌溶胞物超声处理后的上清液。泳道4：经诱导的大肠杆菌溶胞物超声处理后的沉淀物级分。

图14A显示了rHuCXCL9在S-Sepharose柱上的层析纯化。图14B显示了所纯化的rHuCXCL9(来自图14A的峰2)的SDS-PAGE图谱。

图15显示了MuCXCL9的cDNA序列(SEQ ID NO：9)。

图16显示了HuCXCL9的cDNA序列(SEQ ID NO：10)。

图17显示了HuCXCR3的cDNA序列(SEQ ID NO：11)。

发明详述

CXCL9促进骨髓再生，增加外周白血球，并提高存活，如果在用化疗药(诸如5-FU)或放疗治疗受试者前施用的话。在化疗或放疗后施用抗CXCL9抗体得到类似效果。本发明呈现了用于治疗癌症和骨髓病症的组合物和方法。

本发明涉及趋化因子CXCL9的新特性，以前认为其仅仅作为巨噬细胞应答干扰素γ中所涉及的单核因子来发挥功能。然而，依照本发明，CXCL9令人惊讶地在骨髓损害后再生中发挥重要作用。本发明人还发现了牵涉CXCL9的新组合物和方法，一方面对于预防对损害性环境因素(包括化疗剂和辐射)应答时骨髓细胞的损失有用，另一个方面对已经损伤的骨髓再生有用。本发明的组合物和方法可用于降低与化疗或放疗相关的严重的、有时致命的骨髓功能损失，而且在癌症治疗中作为辅助治疗尤其有用。它们还可用于矫正与骨髓病症(诸如再生障碍性贫血和白血病)相关的骨髓细胞损失。

CXCL9具有有力的抗骨髓发生效应，限制骨髓祖细胞的增殖并导致骨髓细胞数降低。并非意欲将本发明限制于任何特定机制，明显地这种抗骨髓发生特性导致CXCL9对骨髓细胞的保护效应，所述骨髓细胞随后用损害性试剂(诸如化疗药或辐射)攻击。通过诱导静止的、非增殖的状态，CXCL9施用预防化疗或放疗期间骨髓中重要的祖细胞或干细胞受破坏，使得在所述治疗后恢复大大改善。医生可以利用这种效应或者改善化疗或放疗的安全性和耐受性，或者通过将化疗剂或辐射的剂量提高到不用CXCL9治疗时无法耐受的水平来提高治疗功效。因此，通过应用本发明，能增强常用癌症疗法的安全性和效力。

此外，本发明人已发现CXCL9在骨髓损害后持续发挥作用的效应。本发明人意外地发现，在用常用的化疗药5-氟尿嘧啶(5-FU)处理后，骨髓中的CXCL9基因表达显著地升高了数倍。如此，在关键的恢复期期间，CXCL9的抗增殖活性变得更强，有助于妨碍骨髓恢复。依照本发明，在化疗或放疗后的一段时期里施用CXCL9活性的拮抗剂会使得骨髓细胞的恢复得到改善(即，细胞数更快增加，和/或最终细胞数更高)。同样，并非意欲将本发明限制于任何特定机制，施用任何拮抗CXCL9活性的试剂看来都降低因暴露于骨髓损害性试剂后CXCL9表达升高所引起的有害效应。

因而，本发明的一个实施方案是预防由化疗、放疗或暴露于骨髓毒剂引起的骨髓细胞损害的方法。该方法包括对将要接受化疗或放疗的受试者施用有效量的CXCL9或CXCR3激动剂。实施此方法的结果是，化疗或放疗后细胞密度或每单位体积骨髓的总细胞数比未实施该方法的要高。通过该方法能预防多种类型的骨髓损害。化疗剂以及辐射对骨髓中细胞的DNA造成损害，而且如果损害足够严重，那么诱导凋亡且细胞死亡。这是用这些疗法治疗癌症的潜在机制。然而，在施用化疗剂或辐射后数日内，导致多种骨髓祖细胞或干细胞中任一种凋亡的损害会降低骨髓细胞数和循环白细胞数，还会使整个免疫系统变弱。如此，在化疗或放疗前施用CXCL9或其受体CXCR3的激动剂，通过降低对干细胞和祖细胞的损害性作用而保护这些细胞，使得治疗后骨髓和免疫功能恢复更快，而且与正常细胞相比，改善化疗或放疗对癌细胞的选择性。

施用CXCL9指施用CXCL9多肽，包括序列变体诸如插入、删除、和保守氨基酸替代，或相关形式诸如突变或者具有高度序列相似性的、相关物种的CXCL9多肽。一般说来，依照本发明施用的CXCL9在功能上是有活性的，通过其抗骨髓发生效应来确定，或者通过其在5-FU处理后或用其它化疗剂处理后或施用后数日内引起骨髓细胞明显损失的辐射后预防骨髓细胞损失的能力来确定。依照本发明施用的CXCL9优选与其所施用物种的CXCL9具有相同氨基酸序列的CXCL9，目的是避免任何针对所施用的CXCL9的免疫应答。例如，如果受试者是人，那么所施用的CXCL9优选人CXCL9，例如重组人CXCL9(rHuCXCL9)。或者，可以施用具有虽不同但密切相关的氨基酸序列的CXCL9，例如根据使用BLAST算法实施的序列比对至少70％、90％、95％、97％、98％、或99％相同的氨基酸序列。还可以施用CXCR3的拮抗剂，或是代替CXCL9或是与CXCL9联合。所述拮抗剂是本领域众所周知的，包括与CXCR3结合且不展示内在活性的其它趋化因子或所述趋化因子的衍生物，以及竞争性抑制CXCL9与CXCR3结合的分子。本发明还涵盖针对CXCL9或CXCR3的拮抗性抗体，意味着与相应抗原结合并阻止细胞内CXCR3的正常信号转导机制活化的抗体，例如通过空间上抑制CXCL9与CXCR3结合。还有另一种施用CXCL9的形式是编码并表达受试者物种的CXCL9的真核表达载体。这样的表达载体能在预期时间窗里，例如在施用化疗或放疗前数天里，产生瞬时提高的CXCL9表达水平。如果需要，还可以使所述载体具有靶向性。例如，一种优选的方法是使用这样的载体进行骨髓细胞的回体(ex vivo)转染，然后例如通过静脉内注射使所述细胞返回患者身体内。由于CXCL9是分泌性蛋白质，所以身体内的表达部位不是关键因素。

应当在化疗或放疗干预前施用CXCL9或CXCR3激动剂，目的是获得有益效应。优选地，在骨髓损害治疗性前施用CXCL9或CXCR3拮抗剂2天或更多天。更优选地，在治疗前施用CXCL9或CXCR3至少3天、至少5天、至少7天、或至少10天。可以例如在紧临治疗前的时间窗口期间通过每日一剂或多剂来施用。可以在化疗或放疗治疗的同一天施用额外的剂量，或者可以在治疗前一天、两天、或三天或更多天进行最终的施用。也可以施用CXCL9或CXCR3激动剂的长效偶联物或清蛋白融合蛋白，用以改善效力或降低所需剂数。可通过任何合适的手段来施用。对于多肽，优选的施用手段是通过静脉内注射；然而，也可使用其它路径，包括表面配制剂、鼻腔喷雾、丸剂、片剂、小胶囊、或栓剂。通常，当给予受试者化疗或放疗时，会终止施用CXCL9或CXCR3激动剂；在所述治疗后继续施用可能是有害的，因为其能延长对骨髓细胞的影响并妨碍恢复。

接受CXCL9或CXCR3激动剂治疗的受试者通常是安排有化疗或放疗的受试者，或者也可以是将要暴露于或有风险暴露于显著量的骨髓损害性辐射或化学药品的人。例如，受试者可以是已经确诊患有癌症的人类患者或动物，对于他们来说化疗或放疗被认为是有利的治疗。大多数类型的癌症可以用化疗或放疗来治疗。优选的是已转移或怀疑已转移，且通过手术无法完全从身体内消除的癌症。已知多种用于此类癌症的动物模型，它们可用于探索本发明各种试剂的有效性，以及施用和剂量给药方案。受试者还可以是将要进入特征为高度辐射暴露或化学药品暴露的区域的人，诸如与太空飞行或由辐射泄露、核事故、爆炸设备或化学药品泄露引起的清除活动相关的。

施用有效量的CXCL9或CXCR3激动剂伴随着化疗、放疗、或其它损害性试剂暴露后骨髓状况的改善。若存在以下一种或多种情况，则受试者的骨髓状况得到改善：骨髓细胞密度大于不施用CXCL9或CXCR3激动剂的情况；骨髓中的祖细胞或干细胞密度大于不施用的情况；骨髓组织质量大于不施用的情况；或者骨髓细胞增殖速率大于不施用的情况。用化学试剂或辐射试剂治疗后任何时间都可测定效力。例如，可以在将试剂(例如化疗剂)投递至受试者后第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10天或更多天进行效力测定。用于此分析的骨髓样品可获自受试者身体中的骨髓的任何部分。为了将结果与不进行施用的预期结果进行比较，可以从一名或多名对照个体，优选从数名个体收集数据，所述对照个体接受相同或类似的化疗或放疗，但不接受CXCL9或CXCR3激动剂。优选地，对照群体为相同疾患，例如为相同类型的癌症接受治疗。若与对照群体相比产生任何益处，则该量为有效量(例如治疗有效量)。例如，如接受治疗的个体或群体具有如下的骨髓状况参数(例如给定祖细胞类型的增殖速率)，其值或均值更接近于正常值(例如高于)；来自对照个体或对照群体的值或均值，则接受治疗的个体或群体的骨髓状况得到改善。在适当时可任选将统计方法应用于此分析。在不同实施方案中，有效量可以是使骨髓状况改善至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％或更多的量。

依照本发明的另一个实施方案涉及施用CXCL9或CXCR3激动剂，如关于上文实施方案所述，但具有不同的可测量结果。在此实施方案中，CXCL9或CXCR3激动剂的有效量增加外周白血球。白细胞的密度(每单位体积血液中的数目)可通过细胞计数或通过测定全血样品中白血球数目的自动化方法来测量。也可以加工血液样品用以在计数前首先分离白血球，或者可使用例如经过标记的抗体来检测白血球。有效量(例如治疗有效量)为对于整个白血球群体或对于其任何亚群产生超过对照水平的任何增加的量。

本发明的又一个实施方案是治疗癌症的方法。例如，该方法包括与上文讨论相同的施用CXCL9或CXCR3激动剂，连同其后对受试者施用化疗或放疗的步骤。在此实施方案中，有效量(例如治疗有效量)为治疗癌症的任何剂量，意味着与不施用CXCL9或CXCR3激动剂的相同疗法相比，癌症治疗(即化疗或放疗)的安全性或有效性得到改善。

在又一个实施方案中，在化疗或放疗前预防性施用CXCL9或CXCR3激动剂，并在化疗后或放疗后施用有效量的拮抗CXCL9活性的试剂作为补充。所述试剂包括但不限于针对CXCL9的拮抗性抗体、对CXCL9表达特异性的siRNA或反义核酸、针对CXCR3(CXCL9配体的天然受体)的拮抗性抗体、对CXCR3表达特异性的siRNA或反义核酸、及CXCR3功能的拮抗剂(例如小分子拮抗剂)。依照本发明可以使用CXCL9的这些拮抗剂中的任何一种或其组合。对于人类受试者，尤其优选施用针对人CXCL9的完全人的抗体。

施用的时程可以变化，但通常将其调整为符合化疗或放疗后CXCL9表达升高的时程相同是有益的。也就是说，例如，若预期受试者的CXCL9表达在化疗后约第7天达到峰值，则可以施用CXCL9拮抗剂，目的是到第7天以治疗有效量存在，且任选在第7天之前和之后存在一天或更多天。CXCL9拮抗剂可以以单剂或多剂投递，例如以日剂量投递。该试剂可以例如仅在第0天(化疗、放疗或暴露于骨髓损害性试剂的当天)施用，或者在其后一天或更多天施用，例如在第0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10天、及以后施用，或者在那些天的任意组合施用。该试剂也可隔日施用，或者作为长效偶联物(诸如PEG化抗体)施用。

在这个实施方案的变化形式中，可使用不同终点来确定有效剂量。对于早期的实施方案，一项可能的终点是与不接受CXCL9拮抗剂的对照组相比骨髓细胞密度升高。另一项可能的终点是外周白血球增加。第三项终点是治疗癌症的有效性，其中与对照组相比，观察到伴随癌症疗法(即化疗或放疗)的安全性或有效性得到改善。

在依照本发明的还有一些其它实施方案中，在用化疗剂或辐射治疗前不施用CXCL9或CXCR3激动剂，但在实施治疗后对受试者施用有效量的CXCL9拮抗剂。就受试者的类型、施用试剂的时程、试剂的类型(即，针对CXCL9的拮抗性抗体、对CXCL9特异性的siRNA或反义核酸、针对CXCR3的拮抗性抗体、对CXCR3特异性的siRNA或反义核酸、或CXCR3的拮抗剂)、及用于确定有效量的终点的类型而言，相同的因素像以前的实施方案一样适用。

与前段中所述的实施方案相关的是治疗特征在于骨髓细胞减少的骨髓病症的方法。所述疾病包括再生障碍性贫血、全血细胞减少症、血小板减少症、白细胞减少症、中性粒细胞减少症、和骨髓纤维化。这些疾病每一种都表现为一种或多种类型的骨髓细胞的减少。原因是常常暴露于损害性试剂，诸如化学试剂或毒素、辐射、或病毒。施用有效量的拮抗CXCL9的试剂减轻CXCL9的抗骨髓发生效应，并引起骨髓细胞增加，这治疗疾病。对于这些方法，所施用的试剂引起身体中任何地方发现的骨髓组织中骨髓细胞数目或密度任何增加的量是有效量。在不同的实施方案中，有效量可以为使骨髓细胞的数目或密度提高至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％或更高的量。施用日程可以选择，目的是增强效力，但通常可为每日一次施用，或者更多或更少的频率施用，施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10天或更多天的一段时间，或者直至观察到骨髓细胞或骨髓细胞子集增加。可用这些方法施用的试剂包括针对CXCL9的拮抗性抗体、对CXCL9特异性的siRNA或反义核酸、针对CXCR3的拮抗性抗体、对CXCR3特异性的siRNA或反义核酸、或CXCR3的拮抗剂。

依照本发明的另一个实施方案是组合物，其可用于实施上文概述的方法。这些组合物包括用于在化疗或放疗或者暴露于骨髓损害性试剂之前或者之后施用的一种或多种试剂。用于在化疗或放疗之前施用的组合物可包含例如治疗有效量的CXCL9、CXCR3激动剂、或表达CXCL9的表达载体，及还有药学可接受载体。用于在化疗或放疗以后施用的组合物可包含例如治疗有效量的CXCL9抗体、CXCL9siRNA或反义核酸、CXCR3抗体、CXCR3siRNA或反义核酸、或CXCR3的拮抗剂，及还有药学可接受载体。另外，有些实施方案包括试剂盒或药物包装，其包含用于在化疗或放疗之前施用的治疗有效量的一种或多种试剂和用于在化疗或放疗之后施用的治疗有效量的一种或多种试剂。

“分离的”、“纯化的”、或“生物学纯的”可以指基本上或本质上不含像在其天然状态中发现的那样通常与之相伴的组分的物质。纯度和同质性通常使用分析化学技术来测定，诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相层析。制备物中存在的优势种类的蛋白质或核酸是基本上纯化的。特别地，分离的核酸是与有些天然位于该基因的侧翼且所编码的蛋白质与该基因编码的蛋白质不同的可读框分开的。在有些方面，术语“纯化的”表示核酸或蛋白质在电泳凝胶中产生本质上一条带。优选地，它意味着核酸或蛋白质为至少85％纯的，更优选至少95％纯的，且最优选至少99％纯的。在其它方面，“纯化”意味着从要纯化的组合物中除去至少一种污染物。从这个意思上说，纯化不要求纯化的化合物是同质的，例如100％纯的。

“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，可以指氨基酸残基的聚合物。这些术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物、包含经过修饰的残基的氨基酸聚合物、及非天然存在的氨基酸聚合物。

类似的，“氨基酸”可以指天然存在的及合成的氨基酸，以及功能类似于天然存在的氨基酸的氨基酸类似物及氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸，以及后来经过修饰的那些氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物指与天然存在的氨基酸具有相同基本化学结构的化合物，例如与氢、羧基、氨基、和R基团结合的α碳，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。所述类似物可以具有经过修饰的R基团(例如正亮氨酸)或经过修饰的肽骨架，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物指具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构，但功能类似于天然存在的氨基酸的化合物。

在本文中氨基酸可以以其公知的三字母符号或者以IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号提及。同样，核苷酸也可以以其公认的单字母代码提及。

“保守修饰的变体”或“保守替代”适用于氨基酸和核酸序列二者。对于特定的核酸序列，保守修饰的变体指编码相同或本质上相同的氨基酸序列的那些核酸，或者若核酸不编码氨基酸序列，则指本质上相同或相关的(例如天然邻近的)序列。由于遗传密码的简并性，所以许多功能上相同的核酸编码大多数蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。如此，在由密码子规定了丙氨酸的每个位置，可以将密码子改变成另一种所述相应的密码子，而不改变所编码的多肽。所述核酸变异是“沉默的变异”，它是一类保守修饰的变异。本文中编码多肽的每种核酸序列也描述了该核酸的沉默变异。技术人员会认识到，在某些语境中，可以修饰核酸中的每个密码子(除了AUG，其通常是甲硫氨酸的唯一密码子，以及TGG，其通常是色氨酸的唯一密码子)以产生功能上相同的分子。因而，编码多肽的核酸的沉默变异常常在所述序列中就表达产物而言是隐含的，但就实际的探针序列而言不是隐含的。

关于氨基酸序列，技术人员会认识到，改变、添加或删除所编码的序列中单个氨基酸或小百分比的氨基酸的，对核酸、肽、多肽、或蛋白质序列的个别替代、删除或添加是“保守的氨基酸置换”，其中所述变化导致某氨基酸被化学上类似的氨基酸替代。保守替代表是本领域众所周知的，其给出了功能上类似的氨基酸。所述保守修饰的变体补充且不排除本发明的多态性变体、种间同系物、及等位基因。典型的保守替代包括任何将以下分组之一的一个成员替代同组的另一个成员的替代：1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；及8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(参见例如Creighton，Proteins(1984))。

在提到例如细胞、或核酸、蛋白质、或载体使用时，“重组”可表示通过导入异源核酸或蛋白质或者改变天然核酸或蛋白质来修饰细胞、核酸、蛋白质或载体，或者表示所述细胞衍生自如此修饰的细胞。如此，例如，重组细胞表达在天然(非重组)形式的该细胞中未发现的基因，或表达在另外情况中异常表达的、不足表达的或根本不表达的天然基因。术语“重组核酸”在本文中意味着最初在体外形成的核酸，以通常在自然界未发现的形式，通常通过核酸操作，例如利用聚合酶和内切核酸酶。用这种方式，实现不同序列的可连接操作。如此，线性形式的分离的核酸，或在体外通过连接通常不相连的DNA分子而形成的表达载体，都被认为是本发明目的的重组体。当然，一旦制得重组核酸并将其重新导入宿主细胞或生物体，那么其会非重组地复制，即利用宿主细胞的体内细胞机构，而不是体外操作；然而，所述核酸一旦重组地产生，则即使之后非重组地复制，也仍然被认为是本发明目的的重组体。类似的，“重组蛋白”指使用重组技术制得的蛋白质，即通过上文所述的重组核酸的表达。

CXCL9

如本文中所使用的，“CXCL9”指任何哺乳动物CXCL9多肽，包括天然存在多肽的片段、突变体、和修饰物，其结合并活化CXCR3，包括成熟的以及全长的形式。用在本发明中的优选CXCL9多肽包括人CXCL9，其具有由SEQID NO：10的核苷酸106-417编码的氨基酸序列，还包括小鼠CXCL9，其具有由SEQ ID NO：9的核苷酸121-438编码的氨基酸序列。对天然存在的CXCL9的修饰包括保守的氨基酸替代、插入、删除、或截短，其产生结合CXCR3并在靶细胞中引发CXCR3介导的应答的多肽。

鼠和人CXCL9的表达及纯化

在一个方面，本发明提供了用于哺乳动物CXCL9蛋白表达、再折叠、及纯化的方法。可使用表达载体从原核细胞表达哺乳动物CXCL9。用于在大肠杆菌细胞中表达的一种合适的载体是pET28a(参见图7和图12)。可将编码哺乳动物CXCL9(包括小鼠或人CXCL9)的核苷酸序列插入载体中，在限制性位点之间。例如，合适的限制酶位点包括Nco I、Xho I、和BamH I。可使用诱导物(诸如IPTG)来诱导高水平表达，导致含有CXCL9多肽的包涵体的形成。可使用尿素使包涵体变性，并通过除去尿素(例如通过在无尿素缓冲液中稀释)来使其再折叠。

本发明进一步提供了新的一步纯化CXCL9的方法。该方法可以例如应用于在大肠杆菌中表达的并自包涵体再折叠的重组CXCL9。在一个方面，该方法涉及使用阳离子交换层析分离溶解的、再折叠的CXCL9包涵体蛋白。使溶解的、再折叠的CXCL9包涵体蛋白在低于CXCL9pI的pH结合至S-Sepharose柱，允许其它蛋白质清洗过柱，并提高离子强度以洗脱纯化的CXCL9蛋白。任选地，洗脱的、纯化的CXCL9的纯度可以通过选自SDS-PAGE、Western印迹、及毛细管电泳的方法来确定。依照本发明的优选的纯化CXCL9方法的进一步细节可在实施例11和实施例12中找到。

与以前纯化rMuCXCL9的方法(例如Zhang et al.[12])相比较，本方法有以下优点：成本效益，＞99％的高纯度，仅需要一个层析步骤，和不使用有毒组分诸如二硫苏糖醇(DTT)。尽管DTT在重组蛋白再折叠期间稳定具有游离巯基的蛋白质，但其可能干扰氧化还原系统。在rMuCXCL9的再折叠缓冲液中添加DTT引起蛋白质聚集。另一个方面，在无DTT的贮藏缓冲液中纯化的rMuCXCL9是稳定的，其化学引诱物活性在4℃保持超过3个月，即使在高盐存在的情况中(NaCl，0.7-1M)。

在有些实施方案中，可在成熟rMuCXCL9蛋白之前添加氨基酸Asp以适应载体中的Nco I位点。Asp是强酸性氨基酸，而且使蛋白质的pI从10.62降至10.52。根据N端法则，蛋白质的体内半衰期与其N末端残基有关。如此，N末端有Asp的CXCL9蛋白于36℃在大肠杆菌中半衰期高于10h，但于30℃在酿酒酵母(S.cerevisiae)中仅3分钟(参见Tobias et al.and Varshavsky[19，20])。

CXCR3

CXCR3是数种天然配体的共享受体，包括CXC趋化因子像IP-10、Mig、I-TAC及BCA-1。CXCR3是G蛋白偶联受体。CXCR3在例如单核细胞和Th1细胞的表面上表达。

术语“CXCR3激动剂”在本文中用于指与CXCR3结合并提升CXCR3活性(特别是当CXCL9结合并活化CXCR3时在细胞中产生的活性)的物质。CXCR3激动剂包括CXCR3的天然配体，诸如IP-10、Mig、I-TAC和BCA-1(及其生物学活性片段和修饰物)，而且还包括具有对针对CXCR3的激动剂活性的已知的和新的化合物。优选地，CXCR3激动剂选自下组：IP-10、Mig、I-TAC、BCA-1、其修饰物和前药。例示性的CXCR3激动剂一般性记载于美国专利No.6,184,358、国际公布No.WO 2005/113597、WO 2004/083394及美国公布No.2005/0119174。

术语“CXCR3拮抗剂”包括与CXCR3结合但不提示细胞中CXCR3活性，而且可以阻断或抑制CXCR3的活性(或是单独起作用，或是在CXCR3的天然配体或激动剂存在的情况中起作用)的物质，而且还包括与CXCR3的天然配体结合，并阻止其结合CXCR3或活化CXCR3的物质。CXCR3拮抗剂可以是例如中性拮抗剂，其通过抑制生理学配体与CXCR3结合来阻断CXCR3的活性，或者可以是反相激动剂，其使CXCR3的有活性形式和无活性形式的平衡向更多无活性形式移动。CXCR3拮抗剂涵盖具有上述性质任一项的已知的和新的化合物。CXCR3拮抗剂的例子包括CXCR3的生理学配体(诸如IP-10、Mig、I-TAC和BCA-1)的降解产物；具有针对CXCR3的亲和力的某些种类CC趋化因子，诸如嗜酸细胞活化趋化因子(eotaxin)(J.Biol.Chem.，273(29)：18288-18291(1998))。更多例示性CXCR3拮抗剂(包括小分子激动剂)一般性记载于国际公布No.WO 2006/088920、WO 2006/088837、WO2006/091428、WO 2006/088921、WO 2006/088919、WO 2006/088836、WO2007/002742、WO 2007/002701、WO 2006/137934、WO 2006/129679、WO2005/113597、WO 2002/085861，美国公布No.2006/0240437、2006/0204498、2006/0276480、2006/0276479、2006/0276448、2006/0276457、2006/0217392、2007/0021611、2007/0015773、2005/0119174、2004/0242498、2003/0077247、2002/0018776、2002/0169159，以及欧洲公布No.EP 1603896、EP 1723970。

CXCR3的生理学配体IP-10、Mig、I-TAC和BCA-1的氨基酸序列及它们的基因的核苷酸序列是已知的。例如，GenBank已经登记了这些配体的人cDNA序列，登录号分别为NM 001565、NM 002416、NM 005409和NM006419。在本发明中，在相应的自人和其它哺乳动物衍生的天然存在趋化因子蛋白之外，“IP-10”、“Mig”、“I-TAC”和“BCA-1”还涵盖由含有编码它们的DNA的重组细胞产生的重组蛋白。

CXCR3激动剂或拮抗剂还能以前药的形式使用，所述前药在受体动物身体中被代谢，并产生展示针对CXCR3的相应激动剂或拮抗剂活性的物质。当CXCR3激动剂或拮抗剂是肽类物质诸如IP-10、Mig、I-TAC或BCA-1时，其“前药”还涵盖含有编码该肽的核酸序列的表达载体，以及用所述表达载体转染的宿主细胞。在表达载体中，编码具有针对CXCR3的激动剂或拮抗剂活性的生理学配体(诸如IP-10、Mig、I-TAC或BCA-1，或者其修饰物)的DNA与启动子可操作连接，所述启动子在受体哺乳动物的细胞中能够展示启动子活性。

抗体

本发明的抗体包括能与特定抗原发生免疫学反应的免疫球蛋白分子，而且还包括多克隆抗体和单克隆抗体。本发明的抗体还包括遗传工程造的形式，诸如嵌合抗体(例如人源化鼠抗体)和异源偶联抗体(例如双特异性抗体)。抗体还包括抗体的抗原结合形式，包括有抗原结合能力的片段(例如Fab’、F(ab’)₂、Fab、Fv和rIgG)。也可参见Pierce Catalog and Handbook，1994-1995(Pierce Chemical Co.，Rockford，Ill.)。还可参见例如Kuby，J.，Immunology，第3版，W.H.Freeman & Co.，New York(1998)。该术语还指重组单链Fv片段(scFv)。术语抗体还包括二价或双特异性分子、双抗体(diabody)、三抗体(triabody)和四抗体(tetrabody)。二价和双特异性分子记载于例如Kostelny et al.(1992)J.Immunol.，148：1547；Pack and Pluckthun(1992)Biochemistry，31：1579；Hollinger et al.(1993)supra；Gruber et al.(1994)J.Immunol.，：5368；Zhu et al.(1997)Protein Sci.，6：781；Hu et al.(1996)CancerRes.，56：3055；Adams et al.(1993)Cancer Res.，53：4026；及McCartney et al.(1995)Protein Eng.，8：301。

能与特定抗原发生免疫学反应的抗体可通过重组方法产生，诸如选择噬菌体或类似载体中的重组抗体的文库，参见例如Huse et al.，Science246：1275-1281(1989)；Ward et al.，Nature 341：544-546(1989)；和Vaughan et al.，Nature Biotech.14：309-314，(1996)，或者可通过用抗原或编码抗原的DNA免疫动物而产生。

通常，免疫球蛋白有重链和轻链。每条重链和轻链包含恒定区和可变区(“区”也称为“域”)。轻链和重链可变区包含4个“框架”区，由3个高变区(也称为“互补决定区”或“CDR”)打断。框架区和CDR的范围已经确定。不同轻链或重链的框架区序列在种内相对保守。抗体的框架区(即轻链和重链组分的框架区组合在一起)用于在三维空间中定位和排列CDR。

CDR主要负责与抗原的表位结合。每条链的CDR通常称作CDR1、CDR2和CDR3(从N末端开始连续编号)，而且通常还由特定CDR所处的链鉴别。如此，V_H CDR3位于发现它的抗体的重链可变域，而V_L CDR1是来自发现它的抗体的轻链可变域的CDR1。

提到“V_H”指抗体的免疫球蛋白重链(包括Fv、scFv、dsFv(二硫化物稳定的Fv)或Fab的重链)的可变区。提到“V_L”指免疫球蛋白轻链(包括Fv、scFv、dsFv或Fab的轻链)的可变区。

短语“单链Fv”或“scFv”指其中传统双链抗体的重链可变域和轻链可变域已经连接以形成一条链的抗体。通常，将接头肽插入两条链之间，以允许正确折叠并产生活性抗原结合位点。

在一个方面，本发明的抗体可以是“嵌合抗体”。例如，嵌合抗体是如下的免疫球蛋白分子，其中(a)恒定区或其部分被改变、替换或交换，从而使抗原结合位点(可变区)连接至类、效应器功能和/或物种不同或改变的恒定区，或者赋予嵌合抗体以新特性的完全不同的分子(例如酶、毒素、激素、生长因子、药物等)；或者(b)可变区或其部分被改变、替换或与具有不同的或改变的抗原特异性的可变区交换。

在一个方面，本发明的抗体可以是“人源化抗体”。例如，人源化抗体是含有自非人类免疫球蛋白衍生的最低限度序列的免疫球蛋白分子。人源化抗体包括如下的人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体互补决定区(CDR)的残基被来自非人类物种(供体抗体)(诸如小鼠、大鼠或家兔)的、具有期望特异性、亲和力和能力的CDR的残基替换。在有些情况中，人免疫球蛋白的Fv框架残基被相应的非人类残基替换。人源化抗体还可包含在受体抗体中，或在所引入的CDR或框架序列中都没有发现的残基。通常，人源化抗体会包含至少一个、通常两个基本上整个如下的可变域，其中所有或基本上所有CDR区与非人类免疫球蛋白对应，且所有或基本上所有框架(FR)区是人免疫球蛋白共有序列的框架区。人源化抗体任选还会包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的(Jones et al.，Nature 321：522-525，(1986)；Riechmann et al.，Nature 332：323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992))。人源化本质上可以按照Winter及其同事的方法来实施(Jones et al.，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann et al.，Nature332：323-327(1988)；Verhoeyen et al.，Science 239：1534-1536(1988))，即用啮齿类动物的CDR或CDR序列替代人抗体的相应序列。因而，此类人源化抗体是嵌合抗体(美国专利No.4,816,567)，其中基本上小于完整人可变域用来自非人类物种的相应序列替代。

在一个方面，本发明的抗体可以是“人抗体”或“完全人的抗体”，其可以指在人框架区和恒定区外还包含人可变区的免疫球蛋白。此类抗体可以用本领域公知的多种技术来生成。例如，体外方法牵涉使用在噬菌体(例如，McCafferty et al.，1990，Nature 348：552-554；Hoogenboom & Winter，J.Mol.Biol.227：381(1991)；及Marks et al.，J.Mol.Biol.222：581，(1991))、酵母细胞(Boder and Wittrup，1997，Nat.Biotechnol.15：553-557)、或核糖体(Hanes andPluckthun，1997，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：4937-4942)上展示的人抗体片段的重组文库。类似的，可以通过将人免疫球蛋白基因座导入其中内源免疫球蛋白基因已经部分或完全灭活的转基因动物(例如小鼠)来制得人抗体。攻击时，观察到人抗体产生，其在所有方面都非常类似于在人体中看到的，包括基因重排、装配、及抗体全集。该方法描述于例如美国专利Nos.6,150,584；5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016，及以下科学出版物中：例如Jakobavits，Adv.Drug.Deliv.Rev.31：33-42(1998)；Marks et al.，Bio/Technology 10：779-783(1992)；Lonberg et al.，Nature 368：856-859(1994)；Morrison，Nature 368：812-13(1994)；Fishwild et al.，Nature Biotechnology14：845-51(1996)；Neuberger，Nature Biotechnology 14：826(1996)；Lonberg &Huszar，Intern.Rev.Immunol.13：65-93，(1995)。

“表位”或“抗原决定簇”指抗原上的，抗体所结合的位点。表位可由连续氨基酸或通过蛋白质三级折叠而并置的非连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的表位在暴露于变性溶剂时通常得到保留，而通过三级折叠形成的表位用变性溶剂处理时通常丧失。表位通常包括至少3个，更通常至少5个、至少6个或8-10个采取独特空间构象的氨基酸。确定表位空间构象的方法包括例如x射线晶体学和二维核磁共振。参见例如Epitope Mapping Protocols in Methodsin Molecular Biology，第66卷，Glenn E.Morris，编(1996)。

抗原或“Ag”指引起免疫应答的分子。此免疫应答可牵涉抗体产生，或特定免疫活性细胞的活化，或两者。技术人员会理解，任何高分子(包括事实上所有蛋白质或肽)都能充当抗原。此外，抗原可以来自重组DNA或基因组DNA。技术人员会理解，任何包含编码引发免疫应答的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列的DNA因此都编码“抗原”。此外，本领域技术人员会理解，抗原不必仅仅由基因的全长核苷酸序列编码。显而易见的是，本发明包括但不限于使用超过一种基因的部分核苷酸序列，而且这些核苷酸序列以多种组合排列以引发期望的免疫应答。此外，技术人员会理解，抗原根本不必由“基因”编码。显而易见的是，抗原可合成产生，或者可衍生自生物学样品。所述生物学样品可包括但不限于组织样品、肿瘤样品、细胞或生物学液体。

可以通过接头或化学键共价地，或者通过离子、范德华、静电或氢键非共价地，使本发明的抗体与效应器分子结合(或连接、或偶联)。效应器分子可以是多种分子，包括例如，检测模块，包括放射性化合物、荧光化合物、酶或底物、标签诸如表位标签、毒素；可活化模块、化疗剂；脂肪酶；抗生素；或者发射“硬”例如β-辐射的放射性同位素。

例如，可将本发明的抗体与“标记物”或“可检测模块”偶联。通常，标记物或可检测模块可以是通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其它物理手段可检测的组合物。例如，有用的标记物包括荧光染料、电子致密试剂、酶(例如ELISA中常常使用的)、生物素、洋地黄毒苷、或半抗原和蛋白质或其它实体，其可以例如通过将放射性标记物掺入肽中，从而使其可检测，或者可将其用于检测具有针对肽的特异性反应性的抗体。放射性同位素可以是例如³H、¹⁴C、³²P、³⁵S或¹²⁵I。在有些情况中，特别是使用针对本发明蛋白质的抗体的情况，使用放射性同位素作为毒性模块，如下所述。可以将标记物掺入核酸、蛋白质和抗体任意位置。可采用本领域公知的、使抗体与标记物偶联的任何方法，包括由Hunter et al.，Nature，144：945(1962)；Davidet al.，Biochemistry，13：1014(1974)；Pain et al.，J.Immunol.Meth.，40：219(1981)；和Nygren，J.Histochem.and Cytochem.，30：407(1982)描述的那些方法。通过添加稳定放射性标记的肽或抗体并保护其免受降解的物质，可以延长放射性标记的肽或放射性标记的抗体组合物的寿命。可以使用稳定放射性标记的肽或抗体的任何物质或物质组合，包括美国专利No.5,961,955中公开的那些物质。

短语与抗体或抗原(诸如蛋白质，优选CXCL9蛋白)“特异性(或选择性)结合”，或“能与...发生特异性(或选择性)免疫反应”，当涉及蛋白质或肽或抗体时，可以指确定蛋白质和其它生物制品的异质群体中蛋白质的存在的结合反应。如此，在指定的免疫测定条件下，特异性抗体以背景的至少两倍、更通常是超过背景的10-100倍的水平与特定蛋白质结合。

能与CXCL9蛋白发生免疫反应且不能与其它蛋白质发生免疫反应的抗体可以例如通过去除与其它分子发生交叉反应的抗体来制备。多种免疫测定形式可用于选择能与特定蛋白质发生特异性免疫反应的抗体。例如，固相ELISA免疫测定法例行用于选择仅能与特定蛋白质发生免疫反应的抗体(参见例如Harlow & Lane，Antibodies，A Laboratory Manual(1988)，关于可用于确定特异性免疫反应性的免疫测定形式和条件的描述)。

抗体施用剂量和频率根据抗体在患者身体中的半衰期而变化。CXCL9或CXCR3抗体的半衰期还可以通过与稳定的多肽或模块(例如清蛋白或PEG)融合而延长。用于产生融合抗体的方法和技术是本领域众所周知的，而且可与本发明的抗体联合起来使用。用于产生融合蛋白或抗体的方法和技术的例子一般性记载于美国专利No.7,081,354、6,972,322、7,041,478和6,987,006。

通常，人源化抗体显示出最长的半衰期，接着是嵌合抗体和非人抗体。在一个方面，本发明的抗体、或其抗原结合片段、变体、或衍生物可以以非偶联形式施用。在另一个方面，本发明的抗体、或其抗原结合片段、变体、或衍生物可以以偶联形式多次施用。在又一个方面，本发明的抗体、或其抗原结合片段、变体、或衍生物可以以非偶联形式施用，然后以偶联形式施用，或反之亦然。

重组抗体的产生

使用本发明的核酸，可以重组产生抗CXCL9单克隆抗体。在一个优选的方面，重组产生嵌合的或人源化的抗CXCL9单克隆抗体。可以采用重组DNA技术，其中将编码抗CXCL9单克隆抗体或其片段的核苷酸序列(诸如一种或多种CDR序列)插入表达载体，转化或转染入适当的宿主细胞，并在适合表达的条件下培养。这些规程通常是本领域公知的，而且在Sambrook et al.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，ColdSpring Harbor，N.Y.(1982)中有一般性描述。“载体”可以指含有能够在细胞中转录的核酸的任何类型基因构建体。该定义还涵盖用于扩增核苷酸序列(编码的和非编码的)的载体。在编码序列外，载体通常会包括限制酶切割位点以及其它初始、末端和中间DNA序列，它们通常用在载体中以促进载体的构建和使用。表达载体可以是质粒、病毒或核酸片段的一部分。

用于本发明的抗CXCL9单克隆抗体的编码序列或其片段和CDR序列可以用化学技术合成，例如Matteucci等(J.Am.Chem.Soc.1981，103：3185)的磷酸三酯法。与核酸序列相关的术语“编码序列”指毗邻的多组三个核苷酸，一组三个核苷酸称为密码子，每个密码子对应一个氨基酸，由生物化学因子根据通用的遗传密码翻译，整个序列编码所表达的蛋白质，或者抑制蛋白质表达的反义链。“遗传编码序列”指其中毗邻的密码子被非编码间插序列或“内含子”间断破坏的编码序列。在mRNA加工期间，除去了内含子序列，恢复编码蛋白质的毗邻密码子序列。

DNA或RNA序列内的任何修饰可仅仅通过用适当的碱基替代编码期望氨基酸序列的碱基。然后可以与适当的接头一起提供编码序列，并连接入本领域通常可得的表达载体，并用该载体转化适当的宿主以产生免疫刺激性肽或蛋白质。许多这样的表达载体和适当的宿主系统是可商购的。为了表达，编码序列会与可操作连接的起始和终止密码子、启动子和终止子区及通常有的复制系统一起提供，以提供用于在期望细胞宿主中表达的表达载体。例如，在包含用于插入期望编码序列的便利限制性位点的质粒中提供与细菌宿主相容的启动子序列。将得到的表达载体转化入适当的细菌宿主中。当然，还可以使用酵母或哺乳动物细胞宿主，其中采用技术人员公知的适当的载体和控制序列。

衍生化的抗体

在天然免疫球蛋白之外，用在本发明中的抗体可以是免疫球蛋白的任何抗原结合片段，或者是经过修饰的免疫球蛋白或抗原结合片段。抗体可以例如通过有机模块的共价附着来修饰。这样的修饰能产生药动学性质改善(例如体内血浆半衰期延长)的抗体。有机模块可以是线性的或分支的亲水性聚合物基团、脂肪酸基团或脂肪酸酯基团。在特定的实施方案中，亲水性聚合物基团分子量可为约800至约120,000道尔顿，而且可以是聚烷二醇(例如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG))、碳水化合物聚合物、氨基酸聚合物或聚乙烯吡咯烷酮，而且脂肪酸或脂肪酸酯基团可包含约8个至约40个碳原子。

用在本发明中的抗体可以包含一个或多个与抗体直接或间接共价键合的有机模块。与本发明的抗体或抗原结合片段键合的每个有机模块可独立地为亲水性聚合物基团、脂肪酸基团或脂肪酸酯基团。脂肪酸可以是一元羧酸或二元羧酸。如本文中所使用的，术语“亲水聚合物基团”指在水中比在辛烷中更易溶的有机聚合物。例如，聚赖氨酸在水中比在辛烷中更易溶。如此，本发明涵盖通过聚赖氨酸的共价附着而修饰的抗体。适合修饰本发明的抗体的亲水性聚合物可以是线性的或分支的，包括例如聚烷二醇(例如，PEG、单甲氧基聚乙二醇(mPEG)、PPG等)、碳水化合物(例如，葡聚糖、纤维素、低聚糖、多糖等)、亲水性氨基酸的聚合物(例如，聚赖氨酸、聚精氨酸、聚天冬氨酸等)、聚烷氧化物(例如，聚氧化乙烯、聚氧化丙烯等)以及聚乙烯吡咯烷酮。优选地，修饰抗体的亲水性聚合物分子量为约800至约150,000道尔顿，其作为分开的分子实体。例如可以使用PEG5000和PEG20,000，其中下标是以道尔顿表示的、聚合物的平均分子质量。亲水性聚合物基团可以用一个至约六个烃基、脂肪酸或脂肪酸酯基团取代。可使用适当的方法制备以脂肪酸或脂肪酸酯基团取代的亲水性聚合物。例如，可以使含有胺基的聚合物与脂肪酸或脂肪酸酯的羧酸根偶联，而且可以使脂肪酸或脂肪酸酯上活化的羧酸根(例如，用N，N-羰基二咪唑活化)与聚合物上的羟基偶联。

适合本发明抗体的脂肪酸和脂肪酸酯可以是饱和的，或者可以含有一个或多个不饱和单元。适合修饰本发明抗体的脂肪酸包括例如n-十二烷酸盐(C12、月桂酸盐)、n-十四烷酸盐(C14、肉豆蔻酸盐)、n-十八烷酸盐(C18、硬脂酸盐)、n-二十烷酸盐(C20、花生酸)、n-二十二烷酸盐(C22、山嵛酸盐)、n-三十烷酸盐(C30)、n-四十烷酸盐(C40)、顺式-δ9-十八烷酸盐(C18、油酸盐)、所有顺式-δ5，8，11，14-二十碳四烯酸盐(C20、花生四烯酸盐)、辛二酸、十四烷二酸(tetradecanedioic acid)、十八烷二酸(octadecanedioic acid)、二十二烷二酸(docosanedioic acid)等。合适的脂肪酸酯包括二羟酸的单酯，其包含线性的或分支的低级烃基。低级烃基可包含一个至约十二个碳原子，优选一个至约六个碳原子。

可以用适当方法制备抗体，诸如通过与一种或多种改性剂反应。如本文中所使用的，术语“改性剂”指包含活化基团的合适的有机基团(例如，亲水性聚合物、脂肪酸、脂肪酸酯)。“活化基团”指能在适当条件下与第二化学基团反应，从而在改性剂与第二化学基团之间形成共价键的化学模块或官能团。例如，氨基反应性活化基团包括亲电子基团，诸如甲苯磺酸酯、甲磺酸酯、卤素(氯、溴、氟、碘)、N-羟基琥珀酰亚胺基酯(NHS)等。能与硫醇反应的活化基团包括例如马来酰亚胺、碘乙酰基、丙烯酰基(acrylolyl)、吡啶基二硫化物(pyridyl disulfides)、5-硫醇基-2-硝基苯甲酸硫醇(TNB-thiol)等。可将醛官能团与含氨或酰肼的分子偶联，而且叠氮基能与三价磷基团反应以形成氨基磷酸酯(phosphoramidate)或亚氨基磷酸酯(phosphorimide)连接。用于将活化基团引入分子中的合适方法是本领域公知的(参见例如Hermanson，G.T.，Bioconjugate Techniques，Academic Press：San Diego，Calif.(1996))。可使活化基团直接地，或者通过接头模块(例如二价C1-C12基团，其中可用杂原子(诸如氧、氮或硫)取代一个或多个碳原子)与有机基团(例如亲水性聚合物、脂肪酸、脂肪酸酯)键合。合适的接头模块包括例如四乙二醇、-(CH₂)₃-、-NH-(CH₂)₆-NH-、-(CH₂)₂-NH-以及-CH₂-O-CH₂-CH₂-O-CH₂-CH₂-O-CH-NH-。包含接头模块的改性剂可以例如通过以下方法制备：使单-Boc-烃基二胺(例如，单-Boc-乙二胺、单-Boc-二氨基己烷)与脂肪酸在1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)存在下反应，用以在游离氨和脂肪酸羧酸根之间形成酰胺键。可用三氟乙酸(TFA)处理从产物中除去Boc保护基团，使得如所述的能与另一个羧酸根偶联的伯胺暴露，或者可使Boc保护基团与马来酸酐反应，并将得到的产物环化以产生脂肪酸的活化的苹果酰胺衍生物(参见例如Thompson，et al.，WO 92/16221，通过述及将其完整教导收入本文)。

本发明的偶联抗体可通过使抗体或抗原结合片段与改性剂反应来制备。例如，可通过采用氨反应性改性剂(例如PEG的NHS酯)，使有机模块与抗体以非位点特异性的方式键合。偶联抗体或抗原结合片段还可以如下制备，即还原抗体或抗原结合片段的二硫键(例如链内二硫键)。然后可使还原的抗体或抗原结合片段与硫醇反应性改性剂反应，以产生本发明的修饰抗体。可用适当方法制备包含与本发明抗体的特定位点键合的有机模块的偶联抗体和抗原结合片段，例如反向蛋白水解(reverse proteolysis)(Fisch et al.，Bioconjugate Chem.，3：147-153(1992)；Werlen et al.，Bioconjugate Chem.，5：411-417(1994)；Kumaran et al.，Protein Sci.，6(10)：2233-2241(1997；Itoh et al.，Bioorg.Chem.，24(1)：59-68(1996)；Capellas et al.，Biotechnol.Bioeng.，56(4)：456-463(1997))，和Hermanson，G.T.，Bioconjugate Techniques，AcademicPress：San Diego，Calif.(1996)中描述的方法。其它可用本发明抗体实施的用于偶联抗体的方法和技术一般性记载于美国专利No.6,426,086；6,071,533；6,214,388；4,429,008和欧洲专利No.EP172435。

抗体的结合亲和力

对靶抗原的结合亲和力通常通过标准抗体-抗原测定法来测量或测定，诸如Biacore竞争性测定法、饱和测定法、或免疫测定法(诸如ELISA或RIA)。

此类测定法可用于测定抗体的解离常数。短语“解离常数”指抗体对抗原的亲和力。如果抗体的解离常数(K_D＝1/K，其中K是亲和常数)小于1μM，优选小于100nM，最优选小于0.1nM，那么抗体和抗原之间存在结合特异性。抗体分子通常会具有更低范围中的K_D。K_D＝[Ab-Ag]/[Ab][Ag]，其中[Ab]是抗体在平衡时的浓度，[Ag]是抗原在平衡时的浓度，而[Ab-Ag]是抗体-抗原复合物在平衡时的浓度。通常，抗原和抗体之间的结合相互作用包括可逆的非共价结合，诸如静电吸引、范德华力和氢键。

本发明的抗体与CXCL9蛋白特异性结合。本说明书中“特异性结合”意味着抗体以至少约0.1mM，更通常至少约1μM，优选至少约0.1μM或更好，最优选0.01μM或更好的K_D与CXCL9蛋白结合。

小干扰RNA(siRNA)

小干扰RNA(siRNA)是一种RNA分子，包含靶向感兴趣基因或多核苷酸的一组核苷酸。如本文中所使用的，术语“siRNA”涵盖所有形式的siRNA，包括但不限于(i)双链RNA多核苷酸，(ii)单链多核苷酸，及(iii)(i)或(ii)的多核苷酸，其中所述多核苷酸中有一处、两处、三处、四处或更多处核苷酸改变或替代。

双链多核苷酸形式的siRNA在长度方面包含约18个碱基对、约19个碱基对、约20个碱基对、约21个碱基对、约22个碱基对、约23个碱基对、约24个碱基对、约25个碱基对、约26个碱基对、约27个碱基对、约28个碱基对、约29个碱基对或约30个碱基对。双链siRNA能够干扰CXCL9的表达和/或活性。

单链siRNA包含靶向感兴趣基因或多核苷酸的RNA多核苷酸序列的一部分。单链siRNA包含长度为约18个核苷酸、约19个核苷酸、约20个核苷酸、约21个核苷酸、约22个核苷酸、约23个核苷酸、约24个核苷酸、约25个核苷酸、约26个核苷酸、约27个核苷酸、约28个核苷酸、约29个核苷酸、或约30个核苷酸的多核苷酸。单链siRNA能够干扰靶多核苷酸或其变体的表达和/或活性。单链siRNA还能够与互补序列退火，产生能够干扰CXCL9表达和/或活性的dsRNA。

在又一个方面，siRNA包括包含双链或者单链多核苷酸的多核苷酸，其中siRNA中有一处、两处、三处、四处或更多处核苷酸改变或替代。

siRNA多核苷酸是干扰RNA活性(通常认为是通过转录后的基因沉默机制而发生的)的RNA核酸分子。siRNA多核苷酸优选包括双链RNA(dsRNA)，但并不限于此，而且可包括单链RNA(参见例如，Martinez et al.，2002 Cell110：563-74)。本发明中包括的siRNA多核苷酸可包括核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸，或者二者组合)，和/或本文中提供的核苷酸类似物(例如，寡核苷酸或多核苷酸等，通常采取5’-3’磷酸二酯连接)的其它天然存在的、重组的、或合成的单链或双链聚合物。因而，会了解，考虑到互补核苷酸碱基配对已确立的原则，公开的例示性序列(如能够指导siRNA多核苷酸转录的DNA序列)也意图用于描述相应的RNA序列和它们的互补序列。

可以使用含有启动子(为RNA聚合酶启动子)的DNA(基因组的、cDNA、或合成的)作为模板来转录siRNA。例如，启动子可以是U6启动子或H1 RNA聚合酶III启动子。或者，siRNA可以是合成衍生的RNA分子。在某些方面，siRNA多核苷酸可以有平端。在某些其它方面，siRNA多核苷酸的至少一条链具有至少一个，优选两个在siRNA多核苷酸任一链的3’末端“悬垂”的核苷酸(即，未与相对链中的互补碱基发生碱基配对)。在本发明一个优选的方面，siRNA多核苷酸双链体的每条链具有3’末端的两个核苷酸的悬垂。两个核苷酸的悬垂优选是胸苷二核苷酸(TT)，但也可以包含其它碱基，例如TC二核苷酸或TG二核苷酸，或者任何其它二核苷酸。悬垂的二核苷酸还可以与干扰所靶向的多核苷酸序列5’末端的两个核苷酸互补。关于siRNA多核苷酸3’末端的讨论，参见例如国际公布No.WO 01/75164。

优选的siRNA多核苷酸包括约18-30个核苷酸碱基对，优选约18个，约19个，约20个，约21个，约22个，约23个，约24个，约25个，约26个，或约27个碱基对，在其它优选的方面约19个，约20个，约21个，约22个或约23个碱基对，或约27个碱基对的双链多核苷酸，其中使用“约”表示在某些方面，在某些条件下，可产生能够干扰所选多肽表达的功能性siRNA多核苷酸的持续(processive)剪切步骤可能并非绝对有效的。因此，siRNA多核苷酸可包括一个或多个siRNA多核苷酸分子，由于在siRNA加工、生物合成、或人工合成方面的可变性，其可以在长度方面有一个、两个、三个、四个或更多个碱基对的差异(例如，通过核苷酸插入或删除)。本发明的siRNA多核苷酸还可包括与特定序列在一个、两个、三个或四个核苷酸处有差异(例如通过核苷酸替代，包括转换或颠换)，从而展示可变性的多核苷酸序列。这些差异可发生在特定siRNA多核苷酸序列的任意核苷酸位置，取决于分子的长度，或是位于双链多核苷酸的有义链中或是位于反义链中。核苷酸差异可在双链多核苷酸的一条链上发现，其中替代核苷酸通常会与之形成氢键碱基配对的互补核苷酸可不必相应地替代。在优选的方面，siRNA多核苷酸对于特定核苷酸序列而言是同质的。

包括本发明siRNA多核苷酸的多核苷酸在某些方面可以衍生自如下的单链多核苷酸，所述单链多核苷酸包括单链寡核苷酸片段(例如约18-30个核苷酸的)及其反向互补物，二者通常由间隔物序列隔开。根据某些此类方面，对间隔物的切割提供单链寡核苷酸片段及其反向互补物，使得它们可退火以形成本发明的双链siRNA多核苷酸，任选带有另外的加工步骤，其可导致从任一条链或两条链的3’末端和/或5’末端添加或去除一个、两个、三个或更多个核苷酸。在某些方面，间隔物具有如下的长度，其允许片段及其反向互补物退火并形成双链结构(例如像发夹多核苷酸)，之后切割间隔物，和任选地，可导致从任一条链或两条链的3’末端和/或5’末端添加或除去一个、两个、三个、四个、或更多个核苷酸的后续加工步骤。间隔物序列因此可以是如本文中提供的任何多核苷酸序列，其位于两个互补的多核苷酸序列区之间，当二者退火成双链核酸时，产生siRNA多核苷酸。优选地，间隔物序列包括至少4个核苷酸。在某些方面，间隔物可包括5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21-25个、26-30个、31-40个、41-50个、51-70个、71-90个、91-110个、111-150个、151-200个、或者更多个核苷酸。已有人描述了自包含由间隔物隔开的两个互补的核苷酸序列的单个核苷酸链衍生的siRNA多核苷酸的例子(例如，Brummelkamp et al.，2002Science 296：550；Paddison et al.，2002 GenesDevelop.16：948；Paul et al.，2002Nat.Biotechnol.20：505-508；Grabarek et al.，2003 BioTechniques 34：734-44)。

多核苷酸变体可包含一处或多处替代、添加、删除、和/或插入，使得siRNA多核苷酸的活性基本上不降低。通常可评估核苷酸内容中任何此类改变对siRNA多核苷酸活性的影响，如本文中别处所述。变体优选显示与编码天然CXCL9的多核苷酸序列的一部分有至少约75％、78％、80％、85％、87％、88％或89％同一性，更优选至少约90％、92％、95％、96％、或97％同一性。百分比同一性可使用任何方法，包括使用本领域普通技术人员众所周知的计算机算法，通过比较多核苷酸与靶多核苷酸相应部分的序列从而很容易地确定。这些包括Align或BLAST算法(Altschul，1991 J.Mol.Biol.219：555-565；Henikoff and Henikoff，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915-10919)。

某些siRNA多核苷酸变体可与编码靶多肽的多核苷酸的一部分基本上同源。自这些多核苷酸变体衍生的单链多核苷酸能够在中等严格条件下与天然存在的编码靶多肽的DNA或RNA序列杂交。在中等严格条件下与编码靶多肽的多核苷酸序列可检测杂交的siRNA多核苷酸可以具有包括至少10个连续核苷酸，更优选11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个连续核苷酸的核苷酸序列，所述连续核苷酸与特定靶多核苷酸互补。在某些优选的方面，这样的siRNA序列(或者其互补序列)对期望干扰表达的编码靶多肽的单一特定多核苷酸会是独特的。在某些其它方面，所述序列(或者其互补序列)可由期望干扰多肽表达的编码靶多肽的两种或多种相关多核苷酸共享。

适当的中等严格条件包括例如在5X SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)的溶液中预清洗多核苷酸；于50℃-70℃，5X SSC杂交多核苷酸1-16小时(例如过夜)；接着于22-65℃用含0.05％-0.1％SDS的2X、0.5X及0.2X SSC中一种或多种清洗多核苷酸一次或两次，每次20-40分钟。对于别的严格性，杂交条件可包括于50-60℃在0.1X SSC和0.1％SDS中另外清洗15-40分钟。本领域普通技术人员会理解，杂交条件严格性的变化可通过改变用于预杂交、杂交以及洗涤步骤的时间、温度、和/或溶液浓度来实现。合适的条件还可部分取决于所使用探针的特定核苷酸序列，以及印迹的、先证者核酸样品的特定核苷酸序列。因而，应了解，当根据多核苷酸与一种或多种某些先证者序列杂交而不与某些其它先证者序列杂交的能力鉴定了该多核苷酸的期望选择性时，能容易地选择适当的严格条件，无需过多实验。

本发明的序列特异性siRNA多核苷酸可使用数项标准中的一项或多项来设计。例如，为设计具有与编码感兴趣多肽的序列相同的约21个连续核苷酸的siRNA多核苷酸，可以对多核苷酸序列的可读框筛选具有一项或多项下述特征的约21个碱基序列长度：(1)A+T/G+C比例约1∶1但不大于2∶1或者1∶2；(2)5’末端为AA二核苷酸或CA二核苷酸；(3)内部发夹环解链温度低于55℃；(4)同二聚体解链温度低于37℃((3)和(4)中所述的解链温度计算可使用本领域技术人员公知的计算机软件来确定)；(5)至少16个连续核苷酸的序列未被鉴定出存在任何其它已知的多核苷酸序列中。或者，可使用来自各供应商的可商购的计算机软件来设计和选择siRNA多核苷酸序列，例如OligoEngine^TM(Seattle，Wash.)；Dharmacon，Inc.(Lafayette，Colo.)；Ambion Inc.(Austin，Tex.)；和QIAGEN，Inc.(Valencia，Calif.)。还可参见Elbashir et al.，2000 Genes &Development 15：188-2000；Elbashir et al.，2001 Nature 411：494-98。然后可以依照本领域公知的和本文中别处描述的方法，对siRNA多核苷酸测试干扰靶多肽表达的能力。siRNA多核苷酸效力的测定不仅包括考虑其干扰靶多肽表达的能力，还要顾及siRNA多核苷酸是否对宿主细胞有毒性。例如，合意的siRNA会展示RNA干扰活性，而且还不会展示不想要的生物学后果。不想要的生物学后果的例子为如下细胞的凋亡，即由于将siRNA导入宿主细胞引起的细胞死亡并非期望的。

根据本公开文本，应该理解本发明的siRNA可实现靶多肽表达不同程度的沉默。如此必须首先对siRNA测试它们的效力。由此根据给定siRNA干扰或调控靶多肽表达的能力进行siRNA的选择。因而，能够干扰期望靶多肽表达的特异性siRNA多核苷酸序列的鉴定需要生成和测试每种siRNA。用于测试各siRNA和选择适用于本发明的siRNA的方法在本文实施例中充分阐释。因为干扰蛋白质表达的siRNA并非全部都会具有生理学上重要的效应，所以本公开文本还阐释了多种生理学上相关的测定法，来确定使用本发明的siRNA干扰靶蛋白质表达的水平是否具有临床上相关的意义。

siRNA的多核苷酸可利用许多种技术中任一种来制备，所述技术对于制备具体期望的siRNA多核苷酸是有用的。例如，多核苷酸可由从合适的细胞或组织类型制备的cDNA扩增。这样的多核苷酸可通过聚合酶链反应(PCR)来扩增。使用这种方法，序列特异性引物根据本文中提供的序列来设计，而且可以直接购买或合成。使用众所周知的技术，可使用引物的扩增部分，从合适的DNA文库中分离全长基因，或其期望部分。用一种或多种适合扩增的多核苷酸探针或引物筛选文库(cDNA或基因组的)。优选地，文库是经过大小选择的，以包括更大的多核苷酸序列。还可优选随机引发的文库，以便鉴定基因的5’和其它上游区。为获得内含子和延伸5’序列，优选基因组文库。本发明所涵盖的siRNA多核苷酸还可以选自siRNA多核苷酸序列的文库。

对于杂交技术，可使用众所周知的技术标记(例如通过切口平移(nicktranslation)或用³²P末端标记)部分多核苷酸序列。然后可以通过用经过标记的探针与含变性细菌菌落(或含噬菌斑的菌苔)的膜杂交来筛选细菌或噬菌体文库(参见例如Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratories，Cold Spring Harbor，N.Y.，2001)。选择并扩增杂交菌落或斑，并分离DNA用于进一步的分析。

或者，从部分cDNA序列获得全长编码序列的许多扩增技术是本领域公知的。在此类技术中，通常通过PCR实施扩增。有一种这样的技术称作“cDNA末端快速扩增”或RACE(参见例如Sambrook et al.，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratories，Cold Spring Harbor，N.Y.，2001)。

在本文中所包括的实施例、附图、和序列表中呈现了许多对干扰靶多肽表达有用的特异性siRNA多核苷酸序列。siRNA多核苷酸通常可用本领域公知的任意方法来制备，包括例如固相化学合成。多核苷酸序列中的修饰还可使用标准诱变技术来引入，诸如寡核苷酸指导的位点专一诱变。此外，可将siRNA化学修饰或与其它分子偶联，以改善它们的稳定性和/或投递特性。本文中所述的siRNA作为一个方面包括在本发明中，其中已从中除去了一个或多个核糖糖。

或者，倘若将DNA掺入带有适当的RNA聚合酶启动子(诸如例如T7、U6、H1、或SP6，但其它启动子可能同样有用)的载体中，那么可通过合适DNA序列(例如，编码靶多肽的多核苷酸序列，或其期望部分)的体外或体内转录来产生siRNA多核苷酸分子。此外，可将siRNA多核苷酸向哺乳动物施用，其可以是支持转录(及任选适当的加工步骤)的DNA序列(例如本文中提供的重组核酸构建体)，以便在体内产生期望的siRNA。

在一个方面，可使用siRNA多核苷酸来生成沉默的细胞，其中该siRNA多核苷酸能够干扰靶多肽的表达。如下的任何siRNA多核苷酸包括在本发明中，即当使其与生物源接触一段时间时，导致靶多肽表达显著降低。优选地，相对于在没有siRNA存在下检测到的靶多肽表达水平，降低大于约10％，更优选大于约20％，更优选大于约30％，更优选大于约40％、约50％、60％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约98％。优选地，细胞中siRNA多核苷酸的存在不导致或引起任何不希望有的毒性效应，例如如下细胞的凋亡或死亡，即该细胞的凋亡不是RNA干扰的期望效应。

在另一个方面，如下的siRNA多核苷酸包括在本发明中，即当使其与生物源接触一段时间时，导致靶多肽表达显著降低。优选地，相对于在没有siRNA存在下检测到的靶多肽表达水平，降低约10％-20％、更优选约20％-30％、更优选约30％-40％、更优选约40％-50％、更优选约50％-60％、更优选约60％-70％、更优选约70％-80％、更优选约80％-90％、更优选约90％-95％、更优选约95％-98％。优选地，细胞中siRNA多核苷酸的存在不导致或引起任何不希望有的毒性效应。

在又一个方面，如下的siRNA多核苷酸包括在本发明中，即当使其与生物源接触一段时间时，导致靶多肽表达显著降低。优选地，相对于在没有siRNA存在下检测到的靶多肽表达水平，降低约10％或更多、更优选约20％或更多、更优选约30％或更多、更优选约40％或更多、更优选约50％或更多、更优选约60％或更多、更优选约70％或更多、更优选约80％或更多、更优选约90％或更多、更优选约95％或更多、更优选约98％或更多。优选地，细胞中siRNA多核苷酸的存在不导致或引起任何不希望有的毒性效应。

本发明的siRNA多核苷酸产生后，技术人员会理解。siRNA多核苷酸会具有某些性质，可修饰这些性质以改善siRNA作为治疗性化合物。因此，通过将siRNA多核苷酸修饰为包含硫代磷酸酯或其它连接、甲基膦酸酯、砜、硫酸酯、羰游基、二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、磷酸酯等，可对其进行进一步设计以抵抗降解(参见例如，Agrwal et al.，1987 Tetrahedron Lett.28：3539-3542；Stec et al.，1985 Tetrahedron Lett.26：2191-2194；Moody et al.，1989 Nucleic Acids Res.12：4769-4782；Eckstein，1989 Trends Biol.Sci.14：97-100；Stein，于：Oligodeoxynucleotides.Antisense Inhibitors of GeneExpression，Cohen，编，Macmillan Press，London，pp.97-117(1989))。

可对本发明的任一种多核苷酸进行进一步修饰以提高其体内稳定性。可能的修饰包括但不限于在5’和/或3’末端添加侧翼序列；在主链中使用硫代磷酸酯或2’O-甲基而不是磷酸二酯连接；和/或包含非传统碱基，诸如肌苷、queosine和wybutosine等，还有腺嘌呤、胞苷、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿苷的乙酰基-甲基-、硫代-及其它修饰形式。

反义核酸

在一个方面，本发明提供了反义的应用。反义通常特别指编码多肽的双链DNA分子非编码链的核酸序列，或者与非编码链基本上同源的序列。反义序列与编码多肽的双链DNA分子的至少一部分序列互补。反义序列没有必要只是与DNA分子编码链的编码部分互补。反义序列可以与编码多肽的DNA分子编码链上规定的调节序列互补，该调节序列控制编码序列的表达。

基因治疗

关于基因治疗规程的综述，参见Anderson，Science(1992)256：808-813；Nabel and Feigner(1993)TIBTECH 11：211-217；Mitani and Caskey(1993)TIBTECH 11：162-166；Mulligan(1993)Science 926-932；Dillon(1993)TIBTECH 11：167-175；Miller(1992)Nature 357：455-460；Van Brunt(1988)Biotechnology 6(10)：1149-1154；Vigne(1995)Restorative Neurology andNeuroscience 8：35-36；Kremer and Perricaudet(1995)British Medical Bulletin51(1)：31-44；Haddada et al.，(1995)于CURRENT TOPICS INMICROBIOLOGY AND IMMUNOLOGY，Doerfler and Boehm(编)Springer-Verlag，Heidelberg Germany；及Yu et al.，GENE THERAPY(1994)1：13-26。

基因或遗传物质投递入细胞中是疾病基因治疗处理中第一个至关重要的步骤。很多投递方法是本领域技术人员众所周知的。此类方法包括例如基于脂质体的基因投递(Debs and Zhu(1993)WO 93/24640；Mannino and Gould-Fogerite(1988)BioTechniques 6(7)：682-691；Rose，美国专利No.5,279,833；Brigham(1991)WO 91/06309；和Felgner et al.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：7413-7414)，以及复制缺陷的反转录病毒载体，其包含治疗性多核苷酸序列作为反转录病毒基因组的一部分(参见例如Miller et al.(1990)Mol.Cell.Biol.10：4239(1990)；Kolberg(1992)J.NIH Res.4：43及Cornetta et al.Hum.Gene Ther.2：215(1991))。广泛应用的反转录病毒载体包括基于鼠白血病病毒(MuLV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、猿免疫缺陷病毒(SIV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)及其组合的那些反转录病毒载体。参见例如，Buchscher et al.(1992)J.Virol.66(5)：2731-2739；Johann et al.(1992)J.Virol.66(5)：1635-1640(1992)；Sommerfelt et al.，(1990)Virol.176：58-59；Wilson et al.(1989)J.Virol.63：2374-2378；Miller et al.，J.Virol.65：2220-2224(1991)；Wong-Staal et al.，PCT/US94/05700；Rosenburg and Fauci(1993)于Fundamental Immunology，第3版Paul(编)Raven Press，Ltd.，New York和其中的参考文献；以及Yu et al.，GENE THERAPY(1994)，supra。

还可使用基于AAV的载体来用靶核酸转导细胞，例如在核酸和肽的体外生成中，以及在体内和回体基因治疗规程中。关于AAV载体的综述，参见West et al.(1987)Virology 160：38-47；Carter et al.(1989)美国专利No.4,797,368；Carter et al.WO 93/24641(1993)；Kotin(1994)Human GeneTherapy 5：793-801；Muzyczka(1994)J.Clin.Invest.94：1351及Samulski(supra)。重组AAV载体的构建在许多出版物中有描述，包括Lebkowski，美国专利No.5,173,414；Tratschin et al.(1985)Mol.Cell.Biol.5(11)：3251-3260；Tratschin，et al.(1984)Mol.Cell.Biol.，4：2072-2081；Hermonat and Muzyczka(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6466-6470；McLaughlin et al.(1988)及Samulski et al.(1989)J.Virol.，63：03822-3828。可用rAAV转化的细胞系包括Lebkowski et al.(1988)Mol.Cell.Biol.，8：3988-3996中所述的那些细胞系。

基因治疗方法学可通过投递部位来描述。投递基因的基本方法包括回体基因转移、体内基因转移、和体外基因转移。在回体基因转移中，自患者取出细胞，并在细胞培养中培养细胞。将DNA转染入细胞中，在数目方面扩增经过转染的细胞，然后将它们再植入患者身体中。对于体外基因转移，方法是一样的，但经过转染的细胞是在培养中生长的细胞(诸如组织培养细胞)，而不是来自患者个体的细胞。体内基因转移牵涉当细胞在患者身体内时将DNA导入患者的细胞中。方法包括使用病毒介导的基因转移，使用非感染性病毒来投递患者身体中的基因或者注射裸DNA入患者身体中的部位，而且DNA被一定百分比的细胞摄取，基因产物蛋白在这些细胞中表达。

另外，本文中描述的其它方法(诸如机械法或化学法)也可用于本发明核酸的体内插入。

DNA投递的机械法包括直接注射DNA(诸如DNA显微注射入种系细胞或体细胞)、气动投递DNA包被的颗粒(诸如“基因枪”中使用的金颗粒)、以及无机化学方法(诸如磷酸钙转染)。另一种方法，即配体介导的基因治疗，涉及使DNA与特定配体络合以形成配体-DNA偶联物，从而指导DNA至特定细胞或组织。

基因治疗的化学法可牵涉化学药品与细胞结合和/或运送DNA穿过细胞膜，诸如致融脂质囊泡(诸如用于膜融合的脂质体或其它囊泡)、掺有阳离子脂质(诸如lipofectin)的DNA脂质颗粒、或聚赖氨酸介导的DNA转移。lipofectin(脂转染试剂)或cytofectin(细胞转染试剂)，即与带负电荷的DNA结合的基于脂质的阳离子，产生复合物，其能穿过细胞膜，使得DNA进入细胞内部。另一种化学法利用基于受体的胞吞作用，其牵涉使特定配体与细胞表面受体结合，将其包封并转运穿过细胞膜。配体与DNA结合，而且整个复合物被转运入细胞中。将配体基因复合物注射入血流中，然后带有受体的靶细胞会与配体特异性结合，并转运配体-DNA复合物入细胞中。

许多基因治疗方法学采用病毒载体来将基因插入细胞中，而且可将其改造成包含本发明的可变剪接载体。例如，已在回体方法中使用改变的反转录病毒载体来将基因导入外周的和浸润肿瘤的淋巴细胞、肝细胞、表皮细胞、肌细胞或其它体细胞。然后将这些改变的细胞导入患者身体中以提供来自所插入DNA的基因产物。

已使用病毒载体来使用体内方案将基因插入细胞(参见例如，Eck，S.L.and J.M.Wilson，“Gene Based Therapy”，Goodman & Gilmer，ThePharmacological Basis of Therapeutics，第8版，pp.77-101，McGraw-Hill，NewYork(1996))。为指导外来基因的组织特异性表达，可使用已知为组织特异性的顺式作用调控元件或启动子。或者，可利用将DNA或病毒载体原位投递至体内特定解剖学部位来实现该目的。例如，通过在动脉壁上选定部位植入经体外转导的内皮细胞，实现了基因体内转移至血管。病毒感染周围细胞，它们也表达基因产物。可将病毒载体直接投递到体内部位，例如通过导管，如此仅使得某些区域受病毒感染，且提供长期、位点专一的基因表达。通过注射改变的病毒入通往器官的血管中，还在乳腺组织和肝组织中验证了利用反转录病毒载体的体内基因转移。

已用于基因治疗方案的病毒载体包括但不限于反转录病毒、其它RNA病毒诸如脊髓灰质炎病毒或辛德比斯(Sindbis)病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒、SV40、牛痘及其它DNA病毒。复制缺陷的鼠反转录病毒载体和腺病毒载体是利用最广泛的基因转移载体。鼠白血病反转录病毒由与核心蛋白和聚合酶(pot)复合的单链RNA构成，由蛋白核心(gag)包围并由确定宿主范围的糖蛋白被膜(env)环绕。反转录病毒的基因组结构包括gag、pot和env基因，由5’和3’长末端重复(LT11)封装。

反转录病毒载体系统利用如下的事实，即倘若在包装细胞株中提供病毒的结构蛋白，那么包含5’和3’LTR及包装信号的最小限度的载体足以使得载体包装、感染并整合入靶细胞中。反转录病毒载体对于基因转移的根本优势包括在大多数细胞类型中有效感染和表达基因、精确的单拷贝载体整合入靶细胞染色体DNA中，以及易于操作反转录病毒基因组。

腺病毒由与核心蛋白复合并由衣壳蛋白包围的线性、双链DNA构成。分子病毒学的发展已使得人们能够利用这些生物体的生物学来创建能够将新的遗传序列转导入体内靶细胞的载体。基于腺病毒的载体会高水平表达基因产物肽。腺病毒载体具有高效感染性，即使是病毒的滴度低。另外，该病毒作为无细胞病毒体具有完全感染性，故不必注射生产者细胞系。腺病毒载体另一潜在优势是能够实现异源基因在有些细胞类型中长期体内表达。

腺病毒载体衍生自没有复制能力的腺病毒，其通常含有E1基因中的删除。将此类载体转染入细胞，诸如293人胚肾I细胞系，使得E1删除的腺病毒复制。转染后，使得腺病毒载体在这些专用的辅助细胞中复制，并形成感染性颗粒，收集并纯化所述颗粒。

用于转染哺乳动物细胞以进行体内基因治疗的质粒包括例如，pRSVCAT，该质粒的构建记载于Gorman et al.，(1982)Proc.Nat.Acad.Sciences(USA)79：6777-6781；p5’PRL3-CAT，该质粒的构建记载于Sakai et al.，(1988)Genes and Development 2：1144-1154；pSIS-CAT，该质粒的构建记载于Huang and Gorman，Nucleic Acids Research，(1990)18：937-948；pSVL；pMSG(Pharmacia，Uppsala，Sweden)；pSV2dhfr(ATCC 37146)；pBC12MI(ATCC67109)；pCMVSport 2.0；及pCMVSport 3.0。可使用的哺乳动物宿主细胞包括人Hela、293、H9和Jurkat细胞，小鼠NIH3T3和C127细胞，Cos 1、Cos 7和CVI，鹌鹑QC1-3细胞，小鼠L细胞及中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。

在一个方面，本发明的治疗剂可用来回体处理骨髓细胞。所述处理是多种疾病状态的治疗中例行考虑的，包括在需要骨髓移植的个体中(例如，患有再生障碍性贫血、急性白血病、复发性淋巴瘤、或实体瘤的患者)。

回体细胞转染用于诊断、研究，或用于基因治疗(例如，通过将经过转染的细胞再灌注入宿主生物体中)是本领域技术人员众所周知的。例如，从受试生物体分离细胞，用基因或cDNA转染所述细胞，并将其再输注回受试生物体(例如患者)中。多种适用于回体转染的细胞类型是本领域技术人员众所周知的(参见例如，Freshney et al.，Culture of Animal Cells，a Manual ofBasic Technique，第3版Wiley-Liss，New York(1994)以及其中引用的参考文献，关于如何分离和培养来自患者的细胞的讨论)。在人类中，实施髂嵴的骨髓穿刺，例如在手术室中全身麻醉下。骨髓细胞回体转染后，将它们静脉内注射回患者身体中。

表达载体

本发明提供了包括本发明多核苷酸的载体、用本发明的载体遗传工程改造的宿主细胞，以及通过重组技术生成本发明的多肽。所述方法包括在适于表达CXCL9多核苷酸的条件下培养宿主细胞，并回收由细胞培养物产生的多肽。

在一个方面，本发明提供了包含重组构建体的宿主细胞，如下所述。所述宿主细胞可以是高等真核细胞(诸如哺乳动物细胞)，或低等真核细胞(诸如酵母细胞)，或者原核细胞(诸如细菌细胞)。合适宿主的代表性例子包括细菌细胞，诸如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)；以及假单胞菌属(Pseudomonas)、链霉菌属(Streptomyces)和葡萄球菌属(Staphylococcus)内的各种物种，但其它种也可用作常规选项；真菌细胞，诸如酵母；昆虫细胞，诸如果蝇属(Drosophila)和Sf9；动物细胞，诸如CHO、COS或Bowes黑素瘤；植物细胞等。遵从本文中提供的指导，相信适当宿主的选择在本领域技术人员的范围内。

宿主细胞用本发明的载体进行遗传工程改造(转导或转化或转染)，所述载体可以是克隆载体或表达载体。经工程改造的宿主细胞可在为适于激活启动子、选择转化子或扩增CXCL9基因而改良的常规营养培养基中培养。培养条件(诸如温度、pH等)是与选择用于表达的宿主细胞先前所使用的条件，对本领域技术人员会是显而易见的。

本发明还包括重组构建体，其包含一段或多段上文概述的序列。所述构建体包括载体，诸如质粒或病毒载体，本发明的序列以正向或反向插入所述载体中。所述载体包括染色体的、非染色体的和合成的DNA序列，例如SV40的衍生物；细菌质粒；噬菌体DNA；酵母质粒；衍生自质粒和噬菌体DNA组合的载体，以及病毒DNA，诸如牛痘、腺病毒、禽痘病毒和假性狂犬病病毒。在一个优选的方面，构建体包含表达载体(如下所述)。许多合适的质粒和载体是本领域技术人员公知的，并且可商购。提供下述载体作为例子：(a)细菌的：pBR322(ATCC 37017)；pGEM1(Promega Biotec，Madison，WI)、pUC、pSPORTI和pProExl(Life Technologies，Gaithersburg，MD)；pQE70、pQE60、pQE-9(Qiagen)；pBs、phagescript、psiX174、pBluescript SK、pBsKS、pNH8a、pNH16a、pNH18a、pNH46a(Stratagene)；pTrc99A、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5和pGEX4T(Pharmacia Fine Chemicals，Uppsala，Sweden)；以及(b)真核的：pWLneo、pSV2cat、pOG44、pXTI、pSG(Stratagene)；pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(Pharmacia)；pcDNA3.1(Invitrogen)。其它适用于原核和真核宿主的克隆和表达载体记载于Sambrook et al.，supra。

然而，通常任何质粒或载体都可以使用，只要其在宿主中可复制和可存活。例如，质粒和载体可包括pIRESbleo3、pCMV-SPORT6、pUMCV3、pORF、pORF9、pcDNA3.1/GS、pCEP4、pIRESpuro3、pIRESpuro4、pcDNA3.1/Hygro(+)、pcDNA3.1/Hygro(-)、pEF6/V5-His、XLGold、超感受态细胞(Stratagene)、XL-Blue、DH5c、DH1OB、pIRESblleo3、pCMV-SPORT6、pUMCV3、pORF、pORF9、pcDNA3.1/GS、pCEP4、pIRESpuro3、pIRESpuro4、pcDNA3.1/Hygro(+)、pcDNA3.1/Hygro(-)、pEF6/V5-。

在一个方面，构建体是表达载体，其还包括与感兴趣序列可操作连接的、用以指导mRNA合成和多肽产生的调节序列。已知在原核细胞和/或真核细胞中运转的调节序列包括用于调节mRNA转录的可诱导的和非可诱导的启动子、用于翻译起始的核糖体结合位点、用于翻译终止的终止密码子、及转录终止子和/或多腺苷酸化信号。另外，表达载体可包括用来扩大表达的适当序列(诸如二氢叶酸还原酶基因)。

启动子区可选自任何期望基因，但优选来自高表达的基因。特别提到的细菌启动子包括lacZ、gpt、λP_R、P_L和trp。真核启动子包括巨细胞病毒(CMV)立即早期、单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶、早期和晚期SV40、来自反转录病毒的LTR、小鼠金属硫蛋白-1、朊病毒蛋白质和神经元特异性烯醇化酶(NSE)。合适启动子的选择完全在本领域普通技术人员水平之内。另外，重组表达载体会包括复制起点和选择标记(诸如赋予针对抗生素(例如新霉素、氯霉素或氨苄西林)的抗性的基因或报告基因(萤光素酶))，其允许选择稳定转化或转染的宿主细胞。

在一种优选的原核或酵母表达载体中，将异源的结构序列(即本发明的多核苷酸)以适当的状态与翻译起始和终止序列，和优选地能够指导所翻译的蛋白质分泌入周质空间或胞外培养基的前导序列一起装配。

任选地，异源序列会编码融合蛋白，包括赋予期望特性的N末端鉴定肽，所述特性例如所表达的重组产物的稳定作用或简单纯化。

优选的真核表达载体还会包括复制起点、与感兴趣序列可操作连接的合适启动子、还有任何必要的翻译增强序列、多腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点、转录终止序列、及5’侧翼非转录序列。可使用衍生自SV40病毒基因组的DNA序列(例如SV40起点、早期启动子、增强子、剪接和多腺苷酸化位点)来提供所需的非转录遗传元件。此类载体还可包括增强子序列以提高基因转录。

增强子是DNA的顺式作用元件，通常约10-300bp，作用于启动子以提高其转录速率。例子包括复制起点晚期侧的SV40增强子(bp 100-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起点晚期侧的多瘤增强子、及腺病毒增强子。

可通过多种规程将适当的DNA序列插入载体中。通常，用合适的限制酶在由这些可商购酶的厂商通常指定的条件下处理DNA，从而实施位点专一的DNA切割。通常，约1微克(Ig)质粒或DNA序列用1单位酶在约20微升(tL)缓冲溶液中切割，37℃温育1-2小时。与限制酶一起温育后，通过酚/氯仿抽提除去蛋白质，并用乙醇沉淀回收DNA。可依照一般从业者公知的方法，利用聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分离经过切割的片段(参见Sambrook et al.，supra)。

使用标准缓冲液和温度条件，用连接酶(例如T4DNA连接酶)和ATP实施连接。粘末端连接比平末端连接需要更少的ATP和更少的连接酶。当载体片段用作连接混合物的一部分时，常常用细菌碱性磷酸酶(BAP)或小牛肠碱性磷酸酶(CIAP)处理载体片段，以除去5’-磷酸根，如此防止载体再连接。或者，可使用不想要的片段的限制酶消化法来防止连接。将连接混合物转化入适当的克隆宿主(诸如大肠杆菌中)并通过包括抗生素抗性在内的方法选择成功的转化子，然后筛选正确的构建体。

用本发明的构建体转化或转染适当的宿主，使得宿主产生重组多肽，还可以以多种方式实施。例如，可通过氯化钙转化、氯化锂或磷酸钙转染、DEAE-Dextran介导的转染、或电穿孔，将构建体导入宿主细胞。用于转化/转染宿主细胞的这些方法及其它方法是一般从业者众所周知的(参见L.Daviset al.，Basic Methods in Molecular Biology，第2版，Appleton and Lang，Paramount Publishing，East Norwalk，CT(1994))。

转化或转染适当的宿主株并培养宿主株至适当的细胞密度后，从重组宿主细胞中回收所表达的蛋白质，所选启动子用适当手段(例如变温或化学诱导)遏制，并将细胞再培养一段时期。

通常通过离心收获细胞，用物理或化学手段破坏细胞(以释放胞内蛋白)，并保留所得粗提物用于进一步纯化。蛋白质表达中所采用的微生物细胞可用任何便利方法破坏，包括冻融循环、超声处理、机械破碎、或使用溶胞剂；此类方法是普通技术人员公知的。当所表达的蛋白质已分泌时，可直接从收获细胞的上清液中纯化它。

用已知方法从上清液或粗提物中回收并纯化CXCL9多肽，所述方法包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、亲和层析、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水相互作用层析、羟磷灰石层析或凝集素层析。优选在纯化期间有低浓度(约0.1-5mM)钙离子存在(Price，et al.，J.Biol.Chem.244：917(1969))。必要时，可在完成蛋白质构型中使用蛋白质重折叠步骤。最后，可将高效液相层析(HPLC)用于最终纯化步骤。

一种生成大量分泌蛋白质的备选方法牵涉转化哺乳动物胚胎，并从转基因牛、山羊、绵羊等产生的奶中回收重组蛋白。多肽和密切相关的分子可用这种方式重组表达以便于蛋白纯化。有一种办法涉及表达嵌合蛋白质，其包括一个或多个不是在人类多肽上天然存在的别的多肽结构域。此类便于纯化的结构域包括但不限于金属螯合肽，诸如组氨酸-色氨酸结构域(允许在固定化的金属上纯化)，蛋白A结构域(允许在固定化的免疫球蛋白上纯化)，及FLAGS延长/亲和纯化系统(Immunex Corp，Seattle，WA)中所利用的结构域。在多肽序列和纯化结构域之间包含可切割接头序列，诸如来自Invitrogen(San Diego，CA)的肠激酶或因子XA，对于回收多肽可能是有用的。

基因治疗施用

本领域技术人员认识到，可利用不同投递方法将载体施用入细胞中。例子包括：(1)利用物理手段的方法，诸如电穿孔(电)、基因枪(物理力)或应用大体积液体(压力)；以及(2)其中所述载体与另一实体复合的方法，所述实体诸如脂质体、聚集的蛋白质或转运蛋白分子。

此外，实际剂量和日程安排可根据组合物是否与其它药物组合物联合施用而变化，或者根据个体间在药动学、药物分布和代谢方面的差异而变化。类似地，体外应用中的量可根据所利用的特定细胞系而变化(例如，基于细胞表面上存在的载体受体的数目，或用于基因转移的特定载体在该细胞系中复制的能力)。此外，每个细胞要添加的载体量有可能会随着载体中插入的治疗基因的长度和稳定性，以及序列的性质而变化，而且此量尤其是需要凭经验确定的参数，而且由于对于本发明的方法来说并非固有的因素(例如与合成相关的费用)，此量可以改变。本领域技术人员能根据特定形势的紧迫性进行任何必要调整。

本文中所述的这些方法绝非包括一切，而且适合特定应用的其它方法对普通技术人员来说会是显而易见的。此外，组合物的有效量可通过与已知发挥期望效果的化合物类比来进一步近似估算。

化疗剂

化疗剂包括烷化剂、抗代谢物、天然产物诸如植物生物碱和生物制品。烷化剂与DNA共价结合以抑制DNA合成和终止细胞生长。合适的烷化剂包括但不限于氮芥类诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)和美法仑(melphalan)，氮丙啶(aziridine)衍生物类诸如塞替派(thiotepa)，烃基磺酸酯诸如白消安(busulfan)及亚硝基脲诸如卡莫司汀(carmustine)。

抗代谢物是阻断生物合成或正常细胞代谢物使用的试剂。与烷化剂类似，抗代谢物抑制DNA合成。然而，抗代谢物针对生长较慢的肿瘤比烷化剂更有效。合适的抗代谢物包括但不限于叶酸类似物诸如甲氨蝶呤(methotrexate)，嘌呤类似物诸如氟达拉滨(fludarabine)、巯嘌呤(mercaptopurine)和硫鸟嘌呤(thioguanine)，腺苷类似物诸如克拉屈滨(cladribine)和喷司他丁(pentostatin)，及嘧啶类似物诸如卡培他滨(capecitabine)、阿糖胞苷(cytarabine)、depocyt(脂质体阿糖胞苷注射剂)、氟尿苷(floxuridine)和氟尿嘧啶(fluorouracil)。

第三类化疗剂是天然产物，诸如抗肿瘤抗生素。合适的抗肿瘤抗生素包括但不限于博来霉素(bleomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、多柔比星(doxorubicin)、doxil(盐酸多柔比星脂质体)、表柔比星(epirubicin)、伊达比星(idarubicin)、丝裂霉素(mitomycin)和米托蒽醌(mitoxantrone)。

其它天然产物包括长春花生物碱(vinca alkaloids)，其通过解聚微管来防止有丝分裂纺锤体形成从而阻滞细胞分裂。合适的长春花生物碱包括但不限于长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、长春瑞滨(vinorelbine)和长春地辛(vindesine)。紫杉烷是另一种类型的天然产物化疗剂。紫杉烷包括但不限于帕利他赛(paclitaxel)和多西他赛(docetaxel)。紫杉烷稳定微管以抑制有丝分裂纺锤体装配从而防止细胞分裂。

生物制品是又一类化疗剂，而且涵盖单克隆抗体、可溶性受体、蛋白质化疗偶联物、反义寡核苷酸等。此类试剂的例子包括(bevacizumab，贝伐单抗)、(alemtuzumab，阿仑单抗)、(cetuximab，西妥昔单抗)、(trastuzumab，曲妥单抗)、Rituxan(rituximab，利妥昔单抗)、Zevalin^TM(ibritumomab tiuxetan，替伊莫单抗)、(托西莫单抗(Tositumomab)和I-131托西莫单抗；靶向CD20抗原的单克隆抗体和放射性标记形式的抗体)、Mylotarg^TM(gemtuzumab ozogamicin，吉姆单抗奥佐米星)。

上述化疗剂可以是细胞周期依赖性的或者是非细胞周期依赖性的。若试剂效力取决于施用试剂时靶细胞(癌细胞)和非靶细胞(正常细胞)处于细胞周期的那个阶段，则试剂是细胞周期依赖性的。例如，烷化剂通常是细胞周期依赖性的，因为它们在S期对细胞有选择性毒性。非细胞周期依赖性的化疗剂在细胞周期的所有阶段具有近似相等的毒性。针对肿瘤抗原的抗体，尤其是如果用毒素或放射性同位素标记的话，有可能是非细胞周期依赖性的。

放射治疗

放射治疗(放疗)可用于治疗几乎每一种类型的实体瘤，包括脑、乳腺、宫颈、喉、肺、胰腺、前列腺、皮肤、脊柱、胃、子宫癌，或软组织肉瘤。辐射的适当剂量取决于许多因素，包括癌症的类型、辐照处理的类型、还有放射治疗与附近可受辐射损害的组织和器官的接近度、及那些组织和器官对辐射的耐受。例如，对于前列腺癌的治疗，辐射剂量范围从65Gy的低值到81Gy的高值，而对于实体上皮瘤的治疗，剂量范围可在50Gy与70Gy之间。相反，淋巴瘤通常接受更低的剂量，日剂量范围在20-40Gy。

适合用在本文中所述的联合治疗中的放射治疗包括使用a)外线束辐射；和b)包含发出辐射的放射性同位素的放射性药剂。

用来治疗癌症的外线束辐射治疗使用对患者来说是外部的辐射源，通常是放射性同位素，诸如⁶⁰Co、¹³⁷Cs，或者是高能X射线源，诸如线性加速器。外部源产生指导入患者身体中肿瘤部位的准直束。外源放射治疗避免了内源放射治疗的一些问题，但在辐射束路径中，其不尽如人意地、必定连同肿瘤组织一起照射到显著体积的非肿瘤或健康组织。

用会聚在肿瘤部位上的射束以多种“机架”角透射外辐射线束入患者身体中，可降低照射健康组织的不良反应，而在肿瘤组织中维持给定剂量的辐射。沿着辐射束路径的健康组织的特定体积元素改变，减少整个治疗期间到达此类健康组织元素的总剂量。

还可以通过将辐射束紧密对准垂直于辐射束轴的肿瘤的一般截面(general cross section)，从而减少对健康组织的辐照。存在许多系统用于产生这样的周向准直(circumferential collimation)，其中有些使用多个滑动快门，其能分段地产生不透射线的任意外形的掩模。

还可使用一种新的外部放疗方法，称为共形放疗(conformal radiotherapy)或三维共形放疗(three-dimensional conformal radiotherapy)，来治疗在过去被认为太接近于重要器官或组织而不容许有效放疗的肿瘤。共形放疗的复杂过程始于患者肿瘤和正常邻近解剖的三维重建的建立。使用为此开发的三维计算机影像将高度聚焦的或“共形的”放疗投递至肿瘤，而不伤害正常邻近组织，产生比以前容许的总体上更高的剂量，而对邻近的组织和器官引起的伤害更小。

本文中定义的“放射性药剂”指含有至少一种发出辐射的放射性同位素的药剂。放射性药剂例行用在核医学中，用来诊断和/或治疗多种疾病。放射性标记的药剂，例如放射性标记的抗体，含有充当辐射源的放射性同位素(RI)。如本文中所涵盖的，术语“放射性同位素”包括金属的和非金属的放射性同位素。根据放射性标记的药剂的医学应用来选择放射性同位素。当放射性同位素是金属放射性同位素时，通常采用螯合剂使金属放射性同位素与分子的其余部分结合。当放射性同位素是非金属放射性同位素时，通常直接地或通过接头使非金属放射性同位素与分子的其余部分连接。

如本文中所使用的，“金属放射性同位素”是在体内或体外治疗或诊断规程中有用的任何合适的金属放射性同位素。合适的金属放射性同位素包括但不限于：锕-225、锑-124、锑-125、砷-74、钡-103、钡-140、铍-7、铋-206、铋-207、铋212、铋213、镉-109、镉-15m、钙-45、铈-139、铈-141、铈-144、铯-137、铬-51、钴-55、钴-56、钴-57、钴-58、钴-60、钴-64、铜-60、铜-62、铜-64、铜-67、铒-169、铕-152、镓-64、镓-67、镓-68、钆153、钆-157、金-195、金-199、铪-175、铪-175-181、钬-166、铟-110、铟-111、铱-192、铁55、铁-59、氪85、铅-203、铅-210、镥-177、锰-54、汞-197、汞203、钼-99、钕-147、镎-237、镍-63、铌95、锇-185+191、钯-103、钯-109、铂-195m、镨-143、钷-147、钷-149、镤-233、镭-226、铼-186、铼-188、铷-86、钌-97、钌-103、钌-105、钌-106、钐-153、钪-44、钪-46、钪-47、硒-75、银-110m、银-111、钠-22、锶-85、锶-89、锶-90、硫-35、钽-182、锝-99m、碲-125、碲-132、铊-204、钍-228、钍-232、铊-170、锡-113、锡-114、锡-117m、钛-44、钨-185、钒-48、钒-49、镱-169、钇-86、钇-88、钇-90、钇-91、锌-65、锆-89、及锆-95。

如本文中所使用的，“非金属放射性同位素”是在体内或体外治疗或诊断规程中有用的任何合适的非金属放射性同位素(非金属的放射性同位素)。合适的非金属放射性同位素包括但不限于：碘-131、碘-125、碘-123、磷-32、砹-211、氟-18、碳-11、氧-15、溴-76、及氮-13。

用于放疗的最适合的同位素的鉴定需要权衡多种因素。这些因素包括肿瘤摄取和潴留、血液清除、辐射投递速率、放射性同位素的半衰期和比放射性、及放射性同位素以经济的方式大规模生产的可行性。治疗性放射性药物的关键点在于向肿瘤细胞投递需要量的辐射剂量，及获得细胞毒性效应或杀肿瘤效应，而不引起难以控制的副作用。

优选在肿瘤部位治疗性放射性同位素的物理半衰期类似于放射性药物的生物学半衰期。例如，如果放射性同位素的半衰期太短，则放射性药物达到最大靶/本底比之前会已经发生很多衰变。在另一个方面，半衰期太长会对正常组织产生不必要的辐射剂量。理想情况是，放射性同位素应具有足够长的半衰期以达到最小剂量率，并照射所有处于细胞周期的辐射最敏感期的细胞。另外，放射性同位素的半衰期必须足够长，以留出足够的时间制造、发行和运输。

其它在选择用于肿瘤治疗中给定应用的放射性同位素方面的实际考虑是可得性和质量。纯度必须足够且可重现，因为痕量杂质能影响放射性药物的放射性标记和放射化学纯度。

肿瘤中的靶受体部位通常在数目上是有限的。就这点而论，优选放射性同位素具有高比放射性。比放射性主要取决于生产方法。必须使痕量金属污染物降到最低，因为它们常常与放射性同位素竞争螯合剂，而且它们的金属复合物与放射性标记的、螯合的药剂竞争受体结合。

适合用在本发明方法中的辐射的类型可不同。例如，辐射本质上可以是电磁的或微粒的。在本发明实践中有用的电磁辐射包括但不限于x射线和伽马射线。在本发明实践中有用的微粒辐射包括但不限于电子束(β粒子)、质子束、中子束、α粒子、及阴性π介子。可使用常规放射学处理设备和方法，及通过术中立体定向方法(intraoperative and stereotactic method)投递辐射。另外的关于适合用在本发明实践中的辐射处理的讨论可见于Steven A.Leibel etal.，Textbook of Radiation Oncology(1998)(W.B.Saunders Company)，特别是第13章和第14章。也可通过其它方法投递辐射，诸如通过例如放射性“粒源”靶向投递，或者靶向放射性偶联物的全身投递。J.Padawer et al.，CombinedTreatment with Radioestradiol lucanthone in Mouse C3HBA MammaryAdenocarcinoma and with Estradiol lucanthone in an Estrogen Bioassay，Int.J.Radiat.Oncol.Biol.Phys.7：347-357(1981)。其它辐射投递方法可用在本发明的实践中。

对于肿瘤治疗，已研究了α和β粒子放射体。α粒子是特别好的细胞毒剂，因为它们在一个或两个细胞直径内散发大量能量。β粒子放射体有相对较长的穿透距离(在组织中2-12mm)，取决于能级。远程穿透对于有不均匀的血流和/或受体表达的实体瘤尤其重要。即使在靶组织内非均匀分布时，β粒子放射体也产生更均匀的剂量分布。

与别的骨髓抑制剂综合疗法

可将本发明的组合物和方法与施用一种或多种别的骨髓抑制剂联合，从而进一步预防对骨髓的损害，或增加后续化疗或放疗之后的外周白血球，或治疗癌症或骨髓病症。一种这样的骨髓抑制剂是CCL3，也称为巨噬细胞炎性蛋白-1α。应理解，在天然形式CCL3以外，还可以使用CCL3的变体，诸如片段、突变体或化学修饰形式，只要它们有骨髓抑制效应。诸如CCL3等试剂阻碍造血干细胞进入细胞周期的S期。参见例如Clemons et al.，Blood92：1532(1998)。在有些实施方案中，在施用例如CXCL9或CXCR3激动剂之外，还在化疗或放疗前施用有效剂量的CCL3或其它骨髓抑制剂。在其它实施方案中，在化疗或放疗前施用有效剂量的CCL3或其它骨髓抑制剂，并在化疗或放疗后施用本发明的CXCR3拮抗剂，诸如CXCL9抗体、CXCL9siRNA、CXCL9反义核酸、CXCR3抗体、CXCR3siRNA、CXCR3反义核酸、或小分子CXCR3拮抗剂。

与造血生长因子的综合疗法

化疗或放疗后，还可将本发明的组合物和方法与造血生长因子(诸如GM-CSF或G-CSF)的施用一同施用。造血生长因子可以是天然存在的分子，或其片段、突变体或化学修饰物，只要生长因子在刺激一种或多种类型骨髓干细胞或祖细胞增殖中，或者在促进干细胞或祖细胞通向髓生成或血细胞生成的分化和发育中是有效的。在有些实施方案中，在化疗或放疗及施用造血生长因子前施用CXCL9或CXCR3激动剂。在其它实施方案中，化疗或放疗后，施用造血生长因子伴随施用CXCR3拮抗剂(包括CXCL9抗体、CXCL9siRNA、CXCL9反义核酸、CXCR3抗体、CXCR3siRNA、CXCR3反义核酸、或小分子CXCR3拮抗剂)。

治疗疾病

本发明的试剂诸如本发明的抗CXCL9抗体和siRNA可以以多种方式寻求用途。在一个优选的方面，一种方法包括以下步骤：对受试者(优选需要此类治疗的受试者)施用对于治疗疾病而言有效的量的抑制CXCL9信号传导的试剂。优选地，受试者为人类。本文中公开了用在此方法中的试剂，诸如抗CXCL9抗体或siRNA。

在一个优选的方面，疾病为癌症。本发明的试剂对于治疗选自下组的癌症是有用的：乳腺、卵巢、结肠直肠、胃、肺、肾、膀胱、前列腺、子宫、甲状腺、胰腺、宫颈、食管、间皮瘤、头与颈、肝细胞、黑素瘤、脑、外阴、睾丸、肉瘤、肠、皮肤、白血病、及淋巴瘤癌症。优选的癌症为乳腺癌、黑素瘤、肺癌、间皮瘤、甲状腺癌、结肠癌或肝癌。

如本文中所使用的，术语“治疗”和“处理”包括：(1)预防疾病，诸如癌症，即使得在可能对疾病易感、但还没有遭受疾病任何症状的受试者中不发生疾病的临床症状；(2)抑制疾病，即阻滞或减轻疾病或其临床症状的发生；或(3)缓解疾病，即使得疾病或其临床症状消退。优选地，需要此类治疗的受试者为哺乳动物，更优选为人类。

可施用本发明的含抑制剂和试剂(例如抗体)的组合物，用于治疗性或预防性处理。在治疗性应用中，以足以治愈或至少部分阻滞疾病及其并发症的量，对患有疾病(例如乳腺癌)的患者施用组合物。足够实现此目的的量定义为“治疗有效剂量”。有效用于此用途的量会取决于疾病的严重性和患者健康的一般状况。组合物单次或多次给药可依赖于所需剂量和频率及患者耐受来施用。在任何情况中，组合物都应提供足够数量的本发明试剂，以有效地治疗患者。能够预防或减慢患者身体中癌症发生的抑制剂的量称为“预防有效剂量”。预防性处理所需的特定剂量会取决于医学状况和患者的病史、所预防的特定癌症、以及其它因素诸如年龄、体重、性别、施用路径、有效性等。此类预防性处理可以例如用在以前患有癌症的患者中以预防癌症复发，或者用在怀疑有发生癌症的显著可能性的患者中。

如本文中所使用的，“治疗有效量”是足以对施用组合物的哺乳动物提供有益效果的治疗性组合物的量。本文中所述的这些方法绝非包括一切，而且适合特定应用的其它方法对普通技术人员来说会是显而易见的。此外，组合物的有效量可通过与已知发挥预期效果的化合物类比来进一步近似估算。

实验动物模型

本发明的方法和组合物对髓发生具有有益效果。在体内(在动物和人类中)和体外都存在多种模型，允许研究髓发生过程的某些方面。此类模型可用于研究本发明的组合物和方法的有效性，以及例如用于选择剂量或给药方案。例如，骨髓干细胞或骨髓祖细胞的水平或增值活性可以在骨髓中或者在循环血中测定。祖细胞诸如CFU-GM、CFU-GEMM、BFU-E、或CFU-S可从小鼠或人类分离，对其计数，并培养细胞以确定本发明的组合物或方法在刺激祖细胞供体的骨髓再生中的有效性。或者，可进行竞争性再生测定法，其中在受致死辐射的小鼠中评估测试骨髓标本的再增殖(repopulating)能力。还可采用体外集落测定法，诸如CFU-GM、BFU-E、CFU-GEMM、和CFu-Blast测定法，测量来自经处理的动物或人类的样品中健康干细胞的数目。此类测定法的更多例子可见于Mauch et al.，Int.J.Radiation，31：1319-1339(1995)。

本发明的一个方面是治疗癌症的方法。一种这样的方法包括在施用化疗或放疗前向癌症患者施用CXCL9激动剂或CXCR3激动剂。另一种这样的方法包括在施用化疗或放疗后施用CXCL9拮抗剂或CXCR3拮抗剂。已知许多癌症动物模型，可用它们来选择适当的剂量或给药方案，实施本发明的方法或使用本发明的组合物。

由于与人结肠癌的形态学相似性、高再现性及相对短的潜伏期，由前致癌物1，2-二甲肼及其代谢物氧化偶氮甲烷(azoxymethane，AOM)诱导的啮齿类结肠腺癌是已经很好表征的致癌物诱导的肿瘤(Shamsuddin，(1986)HumanPath.17：451-453)。此啮齿类肿瘤模型不仅在其形态上(Shamsuddin & Trump，(1981)J.Natl.Cancer Inst.66：389-401)，而且在肿瘤发生涉及的基因上(Shivapurkar et al.，(1985)Cancer Lett.96：63-70；Takahashi et al.，(2000)Carcinogenesis，21：1117-1120)，都类似于人结肠腺癌。

在化学致癌物诱导的啮齿类结肠癌模型以外，磷酸肌醇-3-OH激酶(PI3-Kγ)催化亚单位的基因破坏(Sasaki et al.，(2000)Nature 406：897-902)或鸟苷结合蛋白Gαi2(Rudolph et al.，(1995)Nat.Genet.10：143-50)也在啮齿类中引起自发性结肠癌。这些研究表明，除了原型肿瘤抑制基因和癌基因的改变，人结肠癌的病因学中可能涉及别的潜在原因。

已开发了口腔鳞状细胞癌的许多动物模型，包括大鼠、小鼠和仓鼠模型。由致癌物7，12-二甲基苯蒽(7，12-dimethylbenzanthracene)诱导的仓鼠颊囊肿瘤模型仍然是最常用的模型之一(Baker(1986)Malignant neoplasms of the oralcavity.于：Otolaryngology-Head and Neck Surgery，Cummings et al.(编)pp.1281-1343.St.Louis，Mo.：CV Mosby)，但显示出许多相对于人类口腔肿瘤发生的差异。已利用致癌物4-硝基喹啉1-氧化物(4-NQO)开发了最新小鼠模型，其更严密地模拟人口腔和食管癌发生的许多方面(Tang et al.(2004)Clin.Cancer Res.10：301-313)。

已经描述了多发性骨髓瘤的动物模型(Garrett et al.(1997)Bone20：515-520)，其使用鼠骨髓瘤细胞系5TGM1，当该细胞系注射入小鼠身体中时，引起人骨髓瘤的损害特性。所述损害包括严重的骨质溶解及累及非骨器官包括肝和肾。用培养的5TGM1细胞接种的小鼠可预期并可再现地发生疾病，其症状包括形成单克隆丙种球蛋白病和放射学骨损害。

存在许多用于研究神经胶质瘤的动物模型，包括大脑内大鼠神经胶质瘤模型(Sandstrom et al.(2004)Br.J.Cancer，91：1174-1180)，及利用注射狗衍生的J3T1神经胶质瘤细胞的鼠模型(美国专利No.6,677,155)。

以前已经描述了用于研究非小细胞肺癌的动物模型，例如通过LC-6人非小细胞肺癌皮下移植将人肿瘤异种移植入BALB/C-nu/nu小鼠(Tashiro et al.(1989)Cancer Chemother.Pharmacol.24：187)。

已经描述了用于研究胃癌的动物模型，其在裸鼠中使用AZ-521人胃癌异种移植物(Fukushima et al.(2000)Biochem.Pharmacol.59：1227-1236)。

以前已经描述了AML的许多动物模型，包括大鼠(Blatt，J et al.(1991)Leuk.Res.15：391-394)和SCID小鼠(Vey，N.et al.(2000)Clin.Cancer Res.，6：731-736)中的。

已经描述了许多用于研究HCC的动物模型(Chisari et al.，(1985)Science230：1157-1160；Babinet et al.(1985)Science 230：1160-1163；美国公布No.2004/0016011)。这些参考文献公开了通过将HBV病毒掺入基因组中，产生HCC转基因小鼠模型。

具有与人类患者中经常观察到的那些类似的实验性转移样式的动物模型(Engebraaten & Fodstad，(1999)Int.J.Cancer.82：219-25)，使用MA-11和MT-1，两种雌激素和孕酮受体阴性人乳腺癌细胞系。乳腺癌的其它模型包括美国公布No.2003/0215861(通过述及收入本文)。或者，可用野生型Sprague-Dawley大鼠中致癌剂诱导的乳腺肿瘤在体内证实本发明的化合物(或是单独的或是与其它试剂联合的)发挥抗乳腺癌试剂的功能的能力(Thompson H.J et al，Carcinogenesis，(1992)13：1535-1539)。

卵巢癌的许多动物模型是本领域公知的。例如，Connolly et al.((2003)Cancer Research，63：1389-1397)公开了通过在MISIIR启动子控制下嵌合表达SV40标签，在小鼠中产生上皮性卵巢癌的方法。在另一个例子中，Liu et al.(Cancer Research，64：1655-1663(2004))将人HRAS或KRAS癌基因引入永生化的人卵巢表面上皮细胞中，它们在注射入免疫受损的小鼠身体中后，形成皮下肿瘤。

可得到很多用于研究前列腺癌的动物模型。美国专利No.6,756,036中公开了一种鼠模型，其利用引入SCID小鼠中的前列腺癌异种移植物。或者，可使用转移性前列腺癌的常位小鼠模型，如美国公布No.2004/0009508中公开的。

剂量给药和施用

本文中使用的受试者指动物，诸如哺乳动物，包括但不限于灵长类(例如人)、牛、绵羊、山羊、马、猪、犬、猫、家兔、豚鼠、大鼠、小鼠或其它牛科动物、羊科动物、马科动物、犬科动物、猫科动物、啮齿目动物或鼠科动物的物种。在一个优选的方面，哺乳动物为人类。

如本文中所使用的，治疗和处理指部分或完全抑制癌症形成，或用别的方式治疗(例如，逆转或抑制癌症的进一步发展)癌症，所述癌症诸如肿瘤(tumors)、新生物(neoplasms)、癌/癌瘤(carcinomas)、肉瘤(sarcomas)、白血病(leukemias)、淋巴瘤(lymphomas)等。

如本文中所使用的，治疗有效量指足以引发期望生物学应答的量。在本发明中，期望生物学应答是部分或完全抑制癌症形成，或用别的方式治疗(例如，逆转或抑制癌症的进一步发展)癌症，所述癌症例如肿瘤、新生物、癌/癌瘤、肉瘤、白血病、淋巴瘤等。

治疗有效量可在本发明的方法或药物组合物中实现，采用第一种量的CXCL9和第二种量的合适的化疗或放疗剂。在一个方面，CXCL9和合适的化疗或放疗剂各自以治疗有效量施用(即，各自以若单独施用会在治疗上有效的量)。在另一个方面，CXCL9和合适的化疗或放疗剂各自以单独施用不提供治疗效果的量(亚治疗剂量)施用。在又一个方面，CXCL9可以以治疗有效量施用，而合适的化疗或放疗剂以亚治疗剂量施用。在还有一个方面，CXCL9可以以亚治疗剂量施用，而合适的化疗或放疗剂以治疗有效量施用。应理解，第一种量的CXCL9和第二种量的合适的化疗或放疗剂的共同施用可导致增强的或协同的治疗效果，其中联合的效果比分别施用第一种量的CXCL9和第二种量的合适的化疗或放疗剂引起的叠加效果更大。协同效应可以例如是比分别施用各试剂的预期治疗效果总和升高3倍、10倍、100倍或更大的治疗效果。所述更大的治疗效果可以表现为多种方式，例如肿瘤大小减少更多、肿瘤大小减少更快、发病率或死亡率降低、或者距肿瘤复发的时间更长。

协同效应的存在可利用评估药物相互作用的适当方法来确定。适当的方法包括例如Sigmoid-Emax方程(Holford，N.H.G.and Scheiner，L.B.，Clin.Pharmacokinet.6：429-453(1981))、Loewe加和性方程(Loewe，S.andMuischnek，H.，Arch.Exp.Pathol.Pharmacol.114：313-326，(1926))、及中值效应方程(median-effect equation)(Chou，T.C.and Talalay，P，Adv.Enzyme Regul.22：27-55(1984))。以上提到的各方程可应用于实验数据，产生相应的图，帮助评估联合用药的效果。与以上提到的方程有关的相应图分别为浓度-效果曲线、等效线图解法曲线和联合指数曲线。

药学可接受载体包括药物稀释剂、赋形剂或载体，它们是关于预定施用形式适当选择的且符合常规的药学实践的。例如，固体载体/稀释剂包括但不限于树胶、淀粉(例如玉米淀粉、预胶化淀粉)、糖(例如乳糖、甘露醇、蔗糖、右旋糖)、纤维素物质(例如微晶纤维素)、丙烯酸酯(例如聚丙烯酸甲酯)、碳酸钙、氧化镁、滑石、或其混合物。

药学可接受载体可为水溶剂或非水溶剂。非水溶剂的例子有丙二醇、聚乙二醇、及可注射的有机酯诸如油酸乙酯。水载体包括水、醇/水溶液、乳状液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。

用在本发明方法中的化合物可配制成供任何合适路径施用，诸如口服或胃肠外，例如经皮肤、经粘膜(例如，舌下、舌、(经)口腔)、阴道(例如经阴道及阴道周围)、鼻(内)和(经)直肠、皮下、肌肉内、真皮内、动脉内、静脉内、吸入、及表面施用。

合适的组合物和剂型包括片剂、胶囊剂、小胶囊、丸剂、凝胶帽、含片、分散体、悬浮液、溶液、糖浆剂、颗粒剂、珠、透皮贴片、凝胶剂、粉剂、弹丸剂、乳浆剂、锭剂、乳膏剂、糊剂、硬膏剂、洗剂、盘状物(discs)、栓剂、液体喷雾剂、干粉或雾化配制剂。

优选经口施用化合物。合适的口服剂型包括例如通过常规手段用药学可接受赋形剂诸如粘合剂(例如聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填充剂(例如乳糖、微晶纤维素或磷酸钙)；润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石或二氧化硅)；崩解剂(例如淀粉羟乙酸钠)；或润湿剂(例如十二烷基硫酸钠)制备的片剂、胶囊剂或小胶囊。如果期望，可使用适当方法将片剂包衣，例如用以使其易于吞咽或延迟活性剂的释放。口服给药的液体制剂可以为溶液、糖浆或悬浮液的形式。液体制剂(例如溶液、悬浮液或糖浆)也适合口服给药，而且可通过常规手段用药学可接受添加剂诸如助悬剂(例如山梨醇糖浆、甲基纤维素或氢化食用脂)；乳化剂(例如卵磷脂或阿拉伯胶)；非水媒介(例如杏仁油、油酯或乙醇)；及防腐剂(例如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯或山梨酸)来制备。

如本文中所使用的，术语“药学可接受盐”指要施用的化合物的盐，自其药学可接受的无毒的酸制备，所述酸包括无机酸、有机酸、溶剂合物、水合物，或包合物。所述无机酸的实例有氢氯酸、氢溴酸、氢碘酸、硝酸、硫酸、和磷酸。合适的有机酸可以选自例如脂肪酸、芳香酸、羧酸及磺酸类有机酸，其实例有甲酸、乙酸、丙酸、琥珀酸、樟脑磺酸、柠檬酸、延胡索酸、葡萄糖酸、羟乙磺酸、乳酸、苹果酸、粘酸、酒石酸、对甲苯磺酸、羟基乙酸、葡糖醛酸、马来酸、呋喃甲酸/糠酸、谷氨酸、苯甲酸、邻氨基苯甲酸、水杨酸、苯乙酸、扁桃酸、双羟萘酸(巴莫酸)、甲磺酸、乙磺酸、泛酸、苯磺酸(苯磺酸盐)、硬脂酸、对氨基苯磺酸、海藻酸、半乳糖醛酸等。

应理解，CXCL9化合物可以例如用适当方法筛选分子文库或集合来鉴定。感兴趣化合物的另一个来源是组合文库，其可包括许多结构上不同的分子种类。可使用组合文库来鉴定先导化合物或优化以前确定的先导化合物。所述文库可用众所周知的组合化学方法构建，并用适当的方法筛选。

如本文中所使用的，连续剂量给药指所选的活性剂的长期给药。

如本文中所使用的，按需剂量给药(也称为“必要时”(pro re nata)、“pm”剂量给药和“按需要”(on demand)剂量给药或施用)意味着在活性开始前的一定时间施用治疗有效剂量的化合物，其中抑制下泌尿道病症是期望的。

可以在刚好临所述活性之前施药，包括在所述活性之前约0分钟、约10分钟、约20分钟、约30分钟、约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时，或约10小时，取决于配制剂。

在一个特定的方面，药物施用或剂量给药以按需为基础，而且不牵涉长期药物施用。凭借立即释放剂型，按需施用可包括刚好临活性开始前施用，其中抑制膀胱活动过度的症状是期望的，但通常范围为所述活性之前约0分钟至约10小时，优选范围为所述活性之前约0分钟至约5小时，最优选范围为所述活性之前约0分钟至约3小时。

CXCL9适当的剂量给药范围可以例如为每天约100微克至约2克，例如每天约200微克至约1克，诸如每天约300微克至约750毫克，或者例如每天约400微克至约600毫克。

用在本发明方法中的化合物可以配制成单位剂型。术语“单位剂型”指物理上分立的单位，作为单一剂量适用于治疗中的受试者，且每个单位含有经计算产生期望治疗效果的预定数量活性物质，任选与适当的药学载体联合。单位剂型可为单次日剂量，或者多次日剂量(例如每天约1-4次或更多次)之一。当使用多次日剂量时，单位剂型的每次剂量可以相同或不同。

在实践本发明的方法中，共同施用指施用第一种量的CXCL9和第二种量的合适的化疗或放疗剂，其中第一种量和第二种量一起包括治疗有效量，以治疗需要治疗的受试者中的癌症。共同施用涵盖以基本上同步的方式施用共同施用的第一种和第二种量的化合物，诸如以单一药物组合物，例如具有第一种和第二种量固定比例的胶囊剂或片剂，或者各自以多个、分开的胶囊或片剂。另外，所述共同施用还涵盖以任一次序的序贯方式使用每种化合物。当共同施用牵涉分别施用第一种量的CXCL9和第二种量的适合的化疗或放疗剂时，各化合物施用在时间上足够接近以获得预期治疗效果。例如，能产生期望治疗效果的每次给药之间的时间段的范围可以是数分钟到数小时，而且可以考虑各化合物的性质来确定，所述性质诸如效能、溶解度、生物利用度、血浆半衰期和动力学图谱。例如，CXCL9和合适的化疗或放疗剂可以以任何次序施用，两者之间约24小时内、两者之间约16小时内、两者之间约8小时内、两者之间约4小时内、两者之间约1小时内、或者两者之间约30分钟内。

第一种量的CXCL9和第二种量的合适的化疗或放疗剂联合的治疗有效量会取决于患者的年龄、性别和体重，患者当前的医学状况及要治疗的癌症的性质。技术人员根据这些因素及其它因素会能够确定合适的剂量。CXCL9与任何单一化疗或放疗剂的比例的范围可以是例如约1∶1000、1∶100、1∶50、1∶10、1∶1、10∶1、50∶1、100∶1、或1000∶1(以重量计)。

配制剂

如下文所述，含有本发明治疗剂的一种或多种合适的单位剂型可以任选地配制用于持续释放(例如利用微囊化，国际公布No.WO 94/07529和美国专利No.4,962,091)，可以通过多种路径施用，包括胃肠外，包括通过静脉内和肌肉内路径，以及通过直接注射入患病组织。例如，可将治疗剂直接注射入肿瘤。适当时，配制剂可以以分立的单位剂型方便地提供，而且可通过药学上公知的任何方法来制备。所述方法可包括使治疗剂与液体载体、固体基质、半固体载体、磨细的固体载体或它们的组合相结合的步骤，然后必要时，将产物引入或成形入期望的投递系统中。

当制备本发明的治疗剂用于施用时，优选将它们与药学可接受载体、稀释剂或赋形剂组合，形成药物配制剂，或单位剂型。所述配制剂中总活性成分包括0.1％至99.9％，按配制剂重量计。“药学可接受的”指载体、稀释剂、赋形剂、和/或盐与配制剂中其它成分相容且对其接受者无害。施用的活性成分可以以粉末或颗粒；以溶液、悬浮液或乳状液提供。

含有本发明治疗剂的药物配制剂可通过本领域公知的规程，利用众所周知且容易得到的成分来制备。本发明的治疗剂还可以配制成适合胃肠外施用的溶液，例如通过肌肉内、皮下或静脉内路径。

本发明治疗剂的药物配制剂还可采取含水的或无水的溶液或者分散体的形式，或者乳状液或悬浮液的形式。

如此，治疗剂可配制用于胃肠外施用(例如，通过注射，例如推注或连续输注)，而且可以在安瓿、预装填注射器、小体积输液容器中或者在含额外防腐剂的多剂量容器中以单位剂型来提供。活性成分可采用诸如油性或水性媒介中悬浮液、溶液或乳状液的形式，而且可含有配方剂诸如助悬剂、稳定剂和/或分散剂。或者，活性成分可以为粉末形式，通过无菌固体的无菌分离或通过从溶液中冻干而获得，临使用前用适当媒介例如无菌、无热原水配制。

应了解，各剂型单独气雾剂剂量中所包含的一种或多种活性成分的单位含量本身不必构成治疗特定适应症或疾病的有效量，因为可通过施用多个剂量单位来达到必要的有效量。此外，有效量可用小于剂型中的剂量来获得，或者单独施用，或者一系列施用。

本发明的药物配制剂可包括药学可接受载体、稀释剂、增溶剂或乳化剂及本领域公知类型的盐，作为任选成分。在本发明药物配制剂中有用的载体和/或稀释剂的具体非限制性例子包括水和生理学可接受的缓冲盐水溶液，诸如磷酸盐缓冲盐水溶液(pH 7.0-8.0)。

本发明的表达载体、经转导细胞、多核苷酸和多肽(活性成分)可以通过任何手段配制并施用，以治疗多种疾病状态，所述手段使活性成分与试剂在生物体身体中的作用部位发生接触。它们可通过任何可得的常规手段施用，与药物联合使用，或是作为单独的治疗活性成分，或是与治疗活性成分组合。它们可单独施用，但通常与药学载体一起施用，所述载体根据所选择的施用路径和标准药学实践来选择。

通常，水、适宜的油、盐水、含水右旋糖(葡萄糖)、及相关的糖溶液和二醇类(诸如丙二醇或聚乙二醇)是适用于胃肠外溶液的载体。用于胃肠外施用的溶液包含活性成分、适宜的稳定剂和必要时的缓冲物质。抗氧化剂诸如硫酸氢钠、亚硫酸钠或抗坏血酸(或是单独的或是组合的)是合适的稳定剂。还使用柠檬酸及其盐，及乙二胺四乙酸钠(EDTA)。另外，胃肠外溶液可含有防腐剂诸如苯扎氯铵、对羟基苯甲酸甲酯或丙酯和三氯叔丁醇。合适的药学载体记载于Remington’s Pharmaceutical Sciences，这是此领域的标准参考书。

可将本发明的活性成分配制为悬浮在药学可接受组合物中，适合用在哺乳动物中，特别是人类。所述配制剂包括使用佐剂，诸如美国专利No.4,082,735；4,082,736；4,101,536；4,185,089；4,235,771；和4,406,890中描述的胞壁酰二肽衍生物(MDP)或类似物。其它有用的佐剂包括明矾(PierceChemical Co.)、脂质A、海藻糖二霉菌酸酯和溴化二甲基双十八烷基铵(DDA)、弗氏佐剂、及IL-12。其它组分可包括聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物非离子型表面活性剂、及可代谢的油类诸如角鲨烯(美国专利No.4,606,918)。

另外，可采用标准的药学方法来控制作用持续时间。这些在本领域是众所周知的，而且包括控制释放制剂，可包括合适的大分子，例如聚合物、聚酯、聚氨基酸、聚乙烯吡咯烷酮、乙烯乙酸乙烯、甲基纤维素、羧甲基纤维素或硫酸鱼精蛋白。为了控制释放，可调整大分子的浓度以及掺合的方法。另外，可将试剂掺入聚合材料的颗粒中，所述聚合材料诸如聚酯、聚氨基酸、水凝胶、聚(乳酸)或乙烯乙酸乙烯共聚物。在掺合之外，还可用这些试剂将化合物圈在微胶囊中。

因而，本发明的药物组合物可通过多种路径来投递，并投递至哺乳动物身体中多个部位，从而实现特定的效果(参见例如，Rosenfeld et al.，1991；Rosenfeld et al.，1991a；Jaffe et al.，supra；Berkner，supra)。本领域技术人员会认识到，尽管可以用不止一种路径来施用，但特定路径可提供比别的路径更即时且更有效的反应。通过施用可实现局部的或全身的投递，所述施用包括应用或滴注配制剂入体腔中、吸入或吹入气雾剂、或者通过胃肠外导入，包括肌肉内、静脉内、腹膜、皮下、真皮内、还有表面施用。

本发明的活性成分可以以单位剂型提供，其中每个剂量单位(例如茶匙、片剂、溶液或栓剂)含有预定量的组合物，或是单独的或是与其它活性剂适当组合的。本文中使用的术语“单位剂型”指物理上分立的单位，适合作为单一剂量用于人类和哺乳动物受试者，每个单位含有预定数量的本发明组合物，或是单独的或是与其它活性剂组合的，以足以产生期望效果的量计算得出，适当时与药学可接受稀释剂、载体或媒介联合。本发明单位剂型的规格取决于要实现的特定效果及特定宿主中与药物组合物有关的特定药效学。

本文中所述的这些方法绝非包括一切，而且适合特定应用的其它方法对普通技术人员来说会是显而易见的。此外，组合物的有效量可通过与已知发挥期望效果的化合物类比来进一步近似估算。

诊断、研究、和治疗应用中使用的试剂盒

本发明还提供了试剂盒，其可用于检测本文中公开的CXCL9核酸或蛋白质。进一步，提供了包含本文中描述的组合物的试剂盒，其使得用户可以实践本发明的方法。在诊断和研究应用中，所述试剂盒可包括以下任何或所有各项：测定试剂、缓冲剂、CXCL9特异性抗体、杂交探针和/或引物等。治疗性产物可包括无菌盐水或其它药学可接受乳状液或悬浮液基材。

在一个优选的方面，试剂盒包含试剂，包括本文中概述的特效药，其中所述试剂结合CXCL9蛋白或CXCL9核酸(诸如mRNA)，干扰CXCL9信号传导，或抑制CXCL9蛋白与其它蛋白质结合。该试剂盒可进一步包含一个或多个用于本发明试剂和组合物的容器，还包括使用试剂治疗疾病(诸如癌症)或实践本文中所述任何方法的说明书。

在本发明一个优选的方面，试剂盒包括siRNA，其中siRNA与CXCL9mRNA结合，并抑制CXCL9mRNA翻译。任选地，试剂盒包括对照siRNA。

如上文所指出的，试剂盒可包含指导材料，包括用于实践本发明方法的说明(即方案)。尽管指导材料通常包括书写的和打印的材料，但并不限于此。任何能够存储所述说明并将其传递至最终用户的介质都包括在本发明中。所述介质包括但不限于电子存储介质(例如磁盘、磁带、盒式存储器、芯片)、光学介质(例如CD ROM)等。所述介质可包括提供所述指导材料的因特网地址。

在一个方面，以适于治疗的量或剂量对患者施用本发明的抗体。通常，剂量给药可根据患者考虑而变化。所述考虑包括例如年龄、状况、性别、疾病程度、禁忌症、伴随治疗等。基于这些考虑的例示性单位剂量也可由本领域熟练医师来调整或修改。对受试者施用本发明的抗体可以是局部的或全身的，而且通过静脉内、动脉内、鞘内(经脊髓液)等实现。还可以真皮内或腔内施用，取决于检查的身体部位。

本文中提供实施例用以说明本发明的优势，所述优势以前未描述过，而且进一步帮助本领域普通技术人员制备或使用本发明的化合物或其盐、药物组合物、衍生物、前药、外消旋混合物或互变异构形式。实施例可包括或合并上述的本发明的任何变形或方面。上述方面还可进一步各自包括或合并本发明的任何或全部其它方面的变形。

实施例

实施例1：真核小鼠CXCL9表达质粒的构建

骨架质粒pcDNA3.1(-)及其宿主菌株大肠杆菌DH5α由上海大学刘教授提供。RT-PCR试剂盒和KOD plus购自Toyoba(日本)。限制酶和T4DNA连接酶购自Fermentas(美国)。endofree质粒制备试剂盒购自BioDev(中国北京)。

小鼠CXCL9cDNA由从C57BL/6B小鼠骨髓细胞分离的总RNA反转录。基因的编码序列从碱基58到碱基438(GB：NM_008599)，不含信号肽编码序列。PCR引物根据编码序列设计，并由Sangon(中国)合成。正向引物包含工程化XhoI位点(标有下划线)和KOZAC序列‘CCACC’：5’-CCG CTCGAGCCACC ATGAAGTCCGCTGTTCTTTTCC-3’(SEQ ID NO：1)，而反向引物包含工程化EcoRI位点(标有下划线)：5’-CG GAATTC TTGTAGTCTTCCTTGAACGAC-3’(SEQ ID NO：2)。为将组氨酸标签框架装配到载体中，在反向引物中编码序列和EcoRI位点之间添加一个额外的T。其使用载体中的终止密码子。

DNA于94℃变性2分钟后，如下所述实施PCR：94℃解链20秒，56℃退火30秒，和68℃延伸45秒，共35个循环。将纯化的PCR产物和载体用XhoI和EcoRI消化，凝胶纯化，连接在一起。然后将重组质粒转化到大肠杆菌DH5α感受态(component)细胞中，将细胞于37℃在含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB琼脂上培养用于选择。进一步通过限制酶切割样式分析重组质粒，并最后通过DNA测序(Invitrogen，China)来确认。经序列验证的质粒在大肠杆菌DH5α中扩增，并纯化供使用。

实施例2：编码CXCL9的DNA的体内电穿孔

依照常用的方案，肌肉内注射质粒DNA后实施电穿孔(DNA+EP)。简言之，通过腹膜内注射水合氯醛来麻醉小鼠，剂量为10μl/g体重。完全镇静后，使用微量注射器，每只小鼠在右侧胫骨前(TA)肌中接受含25μg DNA的50μlpH7.4PBS。注射后，立即用BTX800电穿孔设备(Harvard Apparatus，USA)，通过一对相距5mm并覆盖肌肉内注射部位的银电极，以8次电脉冲施加电穿孔。电脉冲持续20毫秒，相隔1秒，总电压100V(200V/cm)。

雌性6-8周龄C57BL/6小鼠和SD大鼠(体重100-150g)购自SLAC实验动物有限公司(中国上海)。本研究中使用的所有动物实验方案都是遵守SJTU和中国政府的规章设计和实施的。

实施例3：抗rMuCXCL9多克隆抗体的制备

使用纯化的rMuCXCL9在Wistar大鼠(SLAC)中产生抗MuCXCL9多克隆抗体。简言之，将300μg rMuCXCL9与等体积的弗氏完全佐剂混合，并皮下注射入大鼠中。自首次注射后第21天，通过每周注射与等体积弗氏不完全佐剂混合的蛋白质共3周来对大鼠进行加强。最后一次加强后两周从动物身体中收集抗体。

实施例4：外周血细胞和骨髓细胞计数

从麻醉小鼠的颈静脉收集血液，并使用MEK6300细胞计数器(日本)依照用户手册对外周血细胞计数。然后处死小鼠，并用pH7.4PBS清洗每只小鼠的右侧股骨和胫骨，用于收获骨髓细胞。1500rpm离心10分钟后，将细胞沉淀物重悬在1ml PBS中，并使用MEK6300计数器(日本)对细胞进行了计数。

实施例5：CXCL9在5-FU处理的小鼠中的表达

经尾静脉给7-8周龄小鼠注射5-氟尿嘧啶(5-FU)，剂量为250mg/kg。注射后第0、3、7、11、14天，使用小鼠CXCL9ELISA试剂盒分析小鼠血清。小鼠CXCL9ELISA试剂盒购自R&D。图1(A)中显示了血清中发现的CXCL9水平。5-FU处理后第7天，CXCL9表达大大上调，达到比正常高约10倍的水平(根据单向ANOVA，P^*＜0.001)。然而，CXCL9的表达在第7天后迅速降低。5-FU处理后第11天，在正常小鼠和5-FU处理的小鼠之间，血清中的CXCL9水平已经没有差异了。

使用Affymetrix基因芯片进行的CXCL9基因表达分析显示了第7天的类似的峰(图1(B))。从5-FU处理后第0、3、7、11、14天收集的骨髓细胞中提取了5份总RNA样品。每个时间点使用来自5-20只小鼠的骨髓细胞，以收集足够的细胞用于RNA提取。使用来自每份样品的等量poly(A)RNA来合成双链cDNA。使用5份样品的等量cDNA，通过体外转录制备了5份cRNA探针。等量探针用于与含34,323个经证实小鼠基因的小鼠基因组表达寡核苷酸阵列(GeneChip mouse expression set 430，Affymetrix，Santa Clara，CA)杂交。使用GeneChip扫描仪3000收集杂交强度信息，并用Affymetrix微阵列套装软件5.1版(Affymetrix，Santa Clara，CA)分析。将全局缩放策略用于所有阵列，设定阵列的平均信号强度为500靶信号。使用第0天阵列作为基线，计算了每个时间点表达数据的比较分析。

实施例6：体内表达的CXCL9抑制正常小鼠造血细胞增殖

使用pcDNA3.1(-)质粒构建了能够在真核细胞中表达CXCL9的载体。表达载体的构建参见实施例1。将质粒施用到小鼠右腿胫骨肌肉，接着电穿孔。电穿孔规程的细节参见实施例2。转染后第0、5、10、17和27天，如实施例4中所述，对外周白血球和骨髓细胞进行了计数，结果在图2中显示。

CXCL9和对照组在外周白血球计数方面没有显著差异(图2(A))。对1μl外周血中的细胞进行了计数。

获得了来自一根股骨和一根胫骨的总骨髓细胞计数(图2(B))。在第5天，CXCL9组显示出比对照组少的细胞，该样式持续到第17天。在第27天，两组已从电穿孔的影响中恢复，CXCL9组具有比对照多的细胞。使用单向ANOVA计算了两组之间差异的统计学显著性，p^*＜0.01。

来自pcDNA3.1(-)的CXCL9cDNA表达在图2C中显示。在第0天，注射含25μg/50μl质粒的pH7.4PBS到骨骼肌，之后立即电穿孔。在第5、7、10和17天，处死小鼠，并通过ELISA测试血清中的CXCL9水平。CXCL9的表达在第5天升高到峰值，但在第7天迅速下降。

实施例7：使用CXCL9表达载体增强骨髓从5-FU处理中恢复

将5-FU以200mg/kg的剂量，通过注射入尾静脉中处理小鼠(雌性，8周龄)后第7天，如实施例2中所述，使用CXCL9表达载体转染所述小鼠。5-FU注射后第0、3、7、11和14天，对外周血细胞和骨髓细胞进行了计数，以评估骨髓抑制和恢复。

图3(A)显示了外周白血球计数的结果。数据显示了1μl外周血的细胞数。除了在第11天外，两组间没有显著差异。在第11天，CXCL9组的白血球比pcDNA3.1对照组恢复得更好。

图3(B)显示了骨髓细胞计数的结果。该计数为来自一根股骨和一根胫骨的总骨髓细胞。在第0天，CXCL9组显示出比对照组少的细胞，该样式与图2B一致。在第3、7和14天，两组之间没有显著差异。然而，在第11天，CXCL9组的骨髓细胞比对照组恢复地显著更好。用单向ANOVA计算了差异显著性，p^*＜0.01。

在对照小鼠中，5-FU处理后第7天，外周血细胞和骨髓细胞都受到极大抑制。然而，在第14天，外周血细胞和骨髓细胞计数都几乎恢复至正常水平。在第11天，CXCL9组显示出比对照组要恢复地更好(图3)。显然，在CXCL9组，更多造血祖细胞幸免于5-FU毒性，从而允许更迅速地恢复。

实施例8：重组CXCL9在正常小鼠中的骨髓抑制功能

在大肠杆菌BL21中表达了重组小鼠CXCL9(rMuCXCL9)，并纯化。用趋化性测定法检验纯化的rMuCXCL9蛋白，发现其是有生物活性的。通过注射入尾静脉中将rMuCXCL9施用到C57雌性小鼠(7-8周龄)。评估了三个剂量：每只小鼠3ng、30ng和300ng；小鼠体重每只约18g。将等体积的PBS注射入对照小鼠中。施用rMuCXCL9连续5天，每天一次。在第0、5、10、15和20天，对外周白血球和骨髓细胞进行计数。

图4A显示了1μl外周血中的白血球计数。在第0天和第5天，rMuCXCL9组与对照组之间没有显著差异。两个更高剂量的rMuCXCL9组与对照组之间出现了差异，用*表示。

图4B显示了来自一根股骨和一根胫骨的总骨髓细胞计数。在第5天，接受两个更高剂量的rMuCXCL9组显示出与对照组相比减少的细胞计数。骨髓细胞计数在第10天迅速恢复。骨髓细胞计数提示，rMuCXCL9抑制了造血细胞的增殖，导致减少。用单向ANOVA计算了组间差异显著性，p^*＜0.01。

实施例9：用重组CXCL9保护骨髓免受高剂量5-FU损害

研究了rMuCXCL9对用高剂量5-FU处理的小鼠存活的影响。用于本研究的C57小鼠为雌性，7-8周龄。rMuCXCL9以每只小鼠200ng的剂量施用，每天一次，连续5天。此后，小鼠以250mg/kg接受5-FU，经尾静脉注射(第0天)。如此，rMuCXCL9施用为第-5至-1天。对照小鼠施用PBS代替rMuCXCL9，但接受250mg/kg剂量的5-FU。在第0、3、7、11和14天观察外周白血球和骨髓细胞的变化(图5A和图5B)。因为250mg/kg 5-FU的剂量对7-8周龄小鼠通常是致死的，所以也记录了小鼠的死亡(图5C)。

图5A显示了1μl外周血中的白血球计数。由于施用rMuCXCL95天，rMuCXCL9组具有比对照组低的细胞计数。虽然在第14天对照组仍受抑制，但是rMuCXCL9组已经恢复到正常水平了。

图5B显示了来自一根股骨和一根胫骨的骨髓细胞计数。在第11天和第14天，rMuCXCL9恢复得比对照组更好，用*表示。特别是在第14天，rMuCXCL9组已恢复到接近正常水平。用单向ANOVA计算了组间的差异显著性，p^*＜0.01。

图5C显示了两组的存活数据。对照组的大多数小鼠未在高剂量5-FU毒性下存活，到第12天存活率仅约10％。然而，rMuCXCL9组有高得多的存活率，约60％。

实施例10：通过抗CXCL9抗体增强高剂量5-FU施用后的骨髓细胞恢复

用rMuCXCL9免疫大鼠，产生了抗CXCL9多克隆抗体。对照大鼠注射不含rMuCXCL9的PBS缓冲液，以产生对照血清。通过Western印迹分析这两种血清。抗CXCL9血清能够特异性结合rMuCXCL9蛋白，而对照血清没有作用。

将抗CXCL9血清和对照血清皮下施用到5-FU处理的小鼠。5-FU处理的当天当成第0天，血清从第0天到第10天连续施用，每天一次。注射前即刻取1μl血清，用生理盐水稀释到10μl。如上文ELISA实验所述，5-FU处理后CXCL9水平上调，5-FU处理后第7天高达正常水平的10倍。

图6A显示了1μl外周血中的白血球计数。从第0天到第11天，对照血清和抗CXCL9血清组之间没有显著差异。在第11天，对照血清组的小鼠相继死亡，所以第11天和第14天对照组细胞计数数据取自图5A。抗CXCL9血清组比对照组恢复得更好，用*表示。

图6B显示了来自一根股骨和一根胫骨的骨髓细胞计数。因与图6A相同的原因，对照组在第11天和第14天的数据取自图5B的PBS对照组。抗CXCL9血清组恢复得比对照PBS组更好，用*表示。特别是在第14天，抗CXCL9血清组已经恢复到接近正常水平。用单向ANOVA计算了组间的差异显著性，p^*＜0.01。

图6C显示了两组的存活信息。到第11天，对照血清组的小鼠相继死亡，而抗CXCL9组最终存活百分比为＞60％。

实施例11：重组鼠CXCL9的表达及纯化

实验简单的单柱纯化策略，从细菌包涵体获得了高度纯化的(＞99％)rMuCXCL9。使用鼠脾细胞趋化性测定法证实了纯化的蛋白质的生物学活性。

rMuCXCL9表达载体的构建

表达载体pET28a(+)及其宿主菌株大肠杆菌BL21(DE3)购自Novagen。RT-PCR试剂盒和DNA聚合酶(KOD plus)购自Toyoba公司(日本)。CXCL9cDNA由从C57BL/6b小鼠骨髓细胞中分离的总RNA反转录。成熟小鼠CXCL9cDNA覆盖GB：NM_008599中bp 121至438的基因编码序列，不含信号肽编码序列。PCR引物根据该序列设计，并由Sangon(中国)合成。正向引物包含工程化NcoI位点(标有下划线)5’-CATG CCATGG ACACCCTAGTGATAAGG-3’(SEQ ID NO：3)，而反向引物掺有工程化XhoI位点(标有下划线)5’-CCGCTCGAG TTATGTAGTCTTCCTTGAACG-3’(SEQ ID NO：4)。其使用基因的天然终止密码子(图7)。为避开载体的His标签和T7标签，选择了NcoI位点来包含ATG翻译起始密码子(图7)。为了将成熟MuCXCL9的编码序列构建成与ATG处于同一读码框中并连接至NcoI位点中额外的G，通过添加AC到MuCXCL9编码序列的5’末端创建了额外的氨基酸Asp(D)。

于94℃变性2分钟后，实施以下扩增。共35个循环，包括94℃20s，56℃30s和68℃40s。纯化的PCR产物和载体用NcoI和XhoI(Fermentas，美国)消化，凝胶纯化，并连接在一起。用重组体载体以化学方法转化大肠杆菌DH5α，并于37℃在含卡那霉素(100μg/ml)的LB琼脂中培养，用于重组体选择。包含MuCXCL9基因准确拷贝的重组质粒命名为pET28a-m(图7)。将其用限制酶消化样式进一步分析，并最后通过DNA测序证实(Invitrogen，中国)。

rMuCXCL9的表达

用质粒pET28a-m转化大肠杆菌BL21(DE3)细胞。将单个转化的BL21菌落接种到补充有卡那霉素(100μg/ml)的3ml LB培养基中，于37℃250rpm振摇培养过夜。将100μl培养物转移到装有3ml新鲜LB培养基的10ml管中。培养物于37℃250rpm振摇培养，直到OD600达到1.0，然后添加3μl 500mM IPTG进行诱导。诱导后3小时收集1ml样品。沉淀物重悬于50μl ddH₂O中，与2x SDS加样缓冲液(0.09M Tris-HCl，pH6.8；0.1M DTT；2％SDS；20％甘油；0.02％溴酚蓝)混合，100℃加热5分钟。样品于10,000g离心5分钟，通过12％SDS-PAGE分析了10μl上清液，用考马斯亮蓝R-250溶液染色。

诱导了15kDa蛋白质的表达(图8A，泳道2)。使用可商购的抗CXCL9抗体，通过Western印迹研究了所表达的蛋白质的身份。通过SDS-PAGE分离了未诱导的和诱导的大肠杆菌蛋白质提取物(图8A，泳道1和泳道2)，将它们转移到PVDF膜上。用抗CXCL9抗体进行Western印迹，检测到膜上与rMuCXCL9大小一致的一条带，仅存在于IPTG诱导后的细菌提取物中(图8B，泳道2)，未诱导的细菌提取物中不存在(图8B，泳道1)。Western印迹结果说明，观察到的诱导蛋白是rMuCXCL9。

rMuCXCL9的预测分子量为12.4kDa。用SDS-PAGE分析时，rMuCXCL9显示出约15kDa的迁移率。

IPTG诱导后，将含rMuCXCL9的细菌超声处理，通过SDS-PAGE和蛋白质染色分析了可溶性细胞溶胞物(图8A，泳道3)和包涵体(图8A，泳道4)。发现了包涵体含有大部分rMuCXCL9，占包涵体中总蛋白的40％(通过染色凝胶密度测定扫描测量的)。

包涵体的制备

用过夜起始培养物接种补充有卡那霉素(100μg/ml)的800ml LB培养基(OD600＜0.1)。培养物于37℃250rpm振摇培养至OD600为0.8-1.0，然后用1mM IPTG(终浓度)诱导3小时。10,000g离心15分钟收获细胞。细胞沉淀物重悬于裂解缓冲液(1x PBS，1mM EDTA，0.1mM PMSF)，终浓度50mg/ml，超声处理(SANYO soniprep 150，15bar；冰上一个循环工作30s和休息30s，18个循环)。于4℃12,000g离心15分钟后，收集不溶解的包涵体，并用沉淀清洗缓冲液(0.5％Triton X-100，10mM EDTA，50mM NaCl)于4℃12,000g清洗5分钟，共5次。然后使包涵体溶解在含8M尿素(9ml尿素/g沉淀物)的缓冲液U(20mM Na₂HPO₄，1mM EDTA，50mM NaCl，pH 9.0)中，37℃轻微振摇1小时。4℃15,000g离心20分钟除去了不溶沉淀物，溶解的包涵体准备好进行进一步纯化。

rMuCXCL9的重折叠及纯化

通过逐步稀释到限定的蛋白质折叠缓冲液中进行重折叠。在剧烈(磁搅拌器)搅动下，通过泵入10倍体积的重折叠缓冲液(20mM NaPO₄，1mMEDTA，pH6.0)滴加了蛋白质溶液。溶液的pH保持在6.0。然后将等体积的稀释缓冲液(20mM NaPO₄，1mM EDTA，pH8.5)加到折叠缓冲液中。重折叠蛋白质溶液4℃放置约24小时。

重折叠蛋白质溶液18,000g离心30分钟。将收集的上清液上样至体积约20ml的S-Sepharose柱。所述柱经缓冲液A(20mM NaPO₄，1mM EDTA，pH7.2)预平衡。样品以0.5ml/min的速度上样，然后用2个柱体积的缓冲液A洗柱。用缓冲液B(20mM NaPO₄，1mM EDTA，1M NaCl，pH7.2)的编程梯度以3ml/min的速度洗脱柱结合的蛋白质。

SDS-PAGE和Western印迹

使用12％分辨胶在PowerPac Basic(Bio-Rad)上进行了SDS-PAGE。简言之，将蛋白质样品上样至凝胶上，120V电泳1小时，然后用考马斯亮蓝R-250染色。

为了Western印迹实验，在槽式印迹设备(Bio-Rad)上将蛋白质转移至PVDF膜上，200mA 90分钟。辣根过氧化物酶偶联的多克隆抗MuCXCL9抗体(R&D，USA)用含0.05％Tween 20的PBS(TBS)1∶500稀释。印迹后，于4℃用TBS稀释的5％(w/v)奶粉将膜封闭10小时。然后在抗体存在下，将印迹于37℃温育1小时。用TBS洗膜5次，每次5分钟，印迹用过氧化物酶底物四甲基联苯胺(Tiangen，中国)染色。

毛细管电泳

毛细管电泳(CE)广泛用在蛋白质和肽的分析中，其基于通过荷质比的分离。CE在配有UV检测仪的P/ACE MDQ毛细管电泳系统(Beckman Coulter，U.S.A.)上进行。使用75μm I.D.、20cm长的裸的熔融石英毛细管来分离。用磷酸盐缓冲液(40mM NaPO₄，pH11.0)作为电泳缓冲液。

rMuCXCL9的纯化

rMuCXCL9具有碱性pI值，为10.52。选择阳离子交换层析来纯化，缓冲液pH低于10.52。根据分批吸收/洗脱实验，将蛋白质结合条件优化为20mMNaPO₄，1mM EDTA，pH7.2(缓冲液A)。用缓冲液A平衡柱子。重折叠蛋白质溶液以0.5ml/min的速度上样后，用缓冲液A洗柱，至280nm处的吸光度回到基线，说明除去了非结合的蛋白质。然后通过由1M NaCl缓冲液B缓慢提高缓冲液的离子强度来洗脱重组蛋白。洗脱期间有两个蛋白质峰。第一个峰在电导率达到30mS/cm时出现(图9A，峰1)，而第二个峰在电导率75mS/cm时出现(图9A，峰2)。用SDS-PAGE和蛋白质染色分析洗脱的蛋白质，发现了rMuCXCL9在峰2处洗脱(图9B)。

rMuCXCL9的SDS-PAGE和毛细管电泳分析

为得到纯化的rMuCXCL9的纯度，通过SDS-PAGE和蛋白质染色分析了来自峰2(图9A)的结合蛋白质级分。将5μg峰2洗脱物上样到凝胶上。除了与rMuCXCL9预测大小一致的带以外，看不见其它带(图10A)。由于蛋白质染色的灵敏度为50ng，所以估算rMuCXCL9的纯度为＞99％。

为进一步验证纯化的rMuCXCL9的纯度，进行了毛细管电泳(CE)。裸的熔融石英毛细管对带负电荷的蛋白质有亲和力，因为当缓冲液pH超过3.0时，石英的表面变成带正电荷。将运行缓冲液调节到pH11.0，这稍微超过rMuCXCL9的预测pI(10.52)，以使蛋白质带负电荷。通过应用压力(0.5psi5秒)，导入纯化的rMuCXCL9(0.3μg/μl)。在10kV的恒压下进行电泳。CE运行期间，仅在约9分钟处出现一个峰，测量值为60mAU(图10B)。30分钟的运行期间，未观察到其它峰，证明在rMuCXCL9的最终制备物中不存在污染性蛋白质(图10B)。

通过SDS-PAGE和蛋白质染色分析了来自每个步骤的蛋白质样品。使用BandScan 5.0软件扫描蛋白质条带。记录每条带的强度，换算成数字数据，并使用蛋白质信号强度的数值计算了来自每个纯化步骤的rMuCXCL9纯度。随着纯度升高，rMuCXCL9产率逐步随纯化步骤降低。每个纯化步骤都有助于rMuCXCL9的纯化。与起始蛋白质相比，rMuCXCL9的最终产率为5.2％(表1)。

表1：使用大肠杆菌表达系统纯化重组小鼠CXCL9^*

  纯化步骤  总蛋白质(mg)  rMuCXCL9纯度(％)  总rMuCXCL9(mg)  蛋白质产率(％)  超声处理溶胞物  390  40.7  158.7  100  8M尿素变性  80  66.6  53.3  33.6  通过稀释复性  40  90.0  36  22.7  S-Sepharose洗脱  8.2  99.7  8.2  5.2

*结果来自表达重组蛋白的大肠杆菌的800ml培养物。

*总蛋白质是通过Bradford的方法估算的[17]。

通过趋化性测定法测定rMuCXCL9的生物学活性

使用24孔transwell槽(6.5mm直径，3μm孔径，Costar 3415，Corning Costar)进行趋化性测定法，基本上如Gosling et al.[16]所描述的。新鲜分离的C57BL/6b小鼠脾淋巴细胞重悬于IMEM细胞培养基(Invitrogen，美国)，将细胞密度调节到3×10⁶个细胞/ml。将100μl 3×10⁵个细胞加到顶槽，而含10nM-300nM rMuCXCL9的600μl IMEM加到底孔。然后将槽于37℃在含5％CO₂的气氛中温育3小时。从下部的孔中收获穿过膜的细胞并计数。

用PBS作为阴性对照，测试了三个浓度的rMuCXCL9(30ng/ml、100ng/ml、300ng/ml)。将rMuCXCL9加到transwell系统的底槽，脾细胞置于上槽中。温育后3小时，对迁移穿过transwell膜的细胞进行计数。在所有的三个rMuCXCL9浓度，迁移穿过transwell的细胞数都显著高于PBS对照中的情况(图11，p＜0.001)。100ng/ml rMuCXCL9活性最高，其计算ED₅₀为30ng/ml。这些结果说明，rMuCXCL9的趋化活性是浓度依赖性的(p＜0.002)。

实施例12：重组人CXCL9的表达和纯化

使用原核表达系统及单柱纯化策略来获得高度纯化的(＞90％)rHuCXCL9。

rHuCXCL9表达载体的构建

表达载体pET28a(+)及其宿主菌株大肠杆菌BL21(DE3)购自Novagen。RT-PCR试剂盒和KOD plus购自Toyoba公司(日本)。CXCL9cDNA由从C57BL/6b小鼠骨髓细胞中分离的总RNA反转录。成熟的人CXCL9cDNA覆盖106bp到417bp(GB：NM_002416)的基因编码序列，不含信号肽编码序列。PCR引物根据该序列设计，并由Sangon(中国)合成。正向引物包含工程化NcoI位点(标有下划线)5’-CATG CCATGG CTACCCCAGTAGTGAG-3’(SEQID NO：5)，而反向引物包含工程化BamHI位点(标有下划线)5’-CGCGGATCC TTATGTAGTCTTCTTTTG-3’(SEQ ID NO：6)。其使用基因的天然终止密码子(图12)。为避开载体的His标签和T7标签，选择了NcoI位点来包含ATG翻译起始密码子(图12)。为了将成熟HuCXCL9的编码序列构建成与ATG处于同一读码框中并连接至NcoI位点中额外的G，通过添加CT到5’CXCL9编码序列创建了额外的氨基酸Asp(A)。

DNA于94℃变性2分钟后，实施以下扩增，共35个循环，包括94℃20s，56℃30s和68℃40s。纯化的PCR产物和载体用NcoI和BamHI(Fermentas，美国)消化，凝胶纯化，并连接在一起。用重组体载体以化学方法转化大肠杆菌DH5α，并于37℃在含卡那霉素(100μg/ml)的LB琼脂中培养，用于重组体选择。包含准确的人CXCL9基因的重组质粒命名为pET28a-h(图12)。将其通过限制酶样式进一步分析，并最后通过DNA测序证实(Invitrogen，中国)。

rHuCXCL9的表达

用质粒pET28a-h转化大肠杆菌BL21(DE3)细胞。将单个转化的BL21菌落接种到补充有卡那霉素(100μg/ml)的3ml LB培养基中，于37℃250rpm振摇培养过夜。将100μl培养物转移到装有3ml新鲜LB培养基的10ml管中。培养物于37℃250rpm振摇培养，直到OD600达到1.0，然后添加3μl 500mM IPTG进行诱导。诱导后3小时收集1ml样品。沉淀物重悬于50μl ddH₂O中，与2x SDS加样缓冲液(0.09M Tris-HCl，pH6.8；0.1M DTT；2％SDS；20％甘油；0.02％溴酚蓝)混合，100℃加热5分钟。样品于10,000g离心5分钟，通过12％SDS-PAGE分析了10μl上清液，用考马斯亮蓝R-250溶液染色。诱导了与rHuCXCL9的预测大小一致的蛋白质的表达(图13，泳道2)。

IPTG诱导后，将含rMuCXCL9的细菌超声处理，通过SDS-PAGE和蛋白质染色分析了可溶性细胞溶胞物(图13，泳道4)和包涵体(图13，泳道5)。发现了包涵体含有大部分rHuCXCL9，占包涵体中总蛋白的40％(通过染色凝胶密度测定扫描测量的)。

包涵体的制备

用过夜起始培养物接种补充有卡那霉素(100μg/ml)的800ml LB培养基(OD600＜0.1)。培养物于37℃250rpm振摇培养至OD600为0.8-1.0，然后用1mM IPTG(终浓度)诱导3小时。10,000g离心15分钟收获细胞。细胞沉淀物重悬于裂解缓冲液(1x PBS，1mM EDTA，0.1mM PMSF)，终浓度50mg/ml，超声处理(SANYO soniprep 150，15bar；冰上一个循环工作30s和休息30s，18个循环)。于4℃12,000g离心15分钟后，收集不溶解的包涵体，并用沉淀清洗缓冲液(0.5％Triton X-100，10mM EDTA，50mM NaCl)于4℃12,000g清洗5分钟，共5次。然后使包涵体溶解在含8M尿素(9ml尿素/g沉淀物)的缓冲液U(20mM Na₂HPO₄，1mM EDTA，50mM NaCl，pH 9.0)中，37℃轻微振摇1小时。4℃15,000g离心20分钟除去了不溶沉淀物，溶解的包涵体准备好进行进一步纯化。

rHuCXCL9的重折叠及纯化

通过逐滴稀释到限定的蛋白质折叠缓冲液中进行重折叠。在剧烈(磁搅拌器)搅动下，通过泵入10倍体积的重折叠缓冲液(20mM NaPO₄，1mMEDTA，pH6.0)滴加了蛋白质溶液。溶液的pH保持在6.0。然后将等体积的稀释缓冲液(20mM NaPO₄，1mM EDTA，pH8.5)加到折叠缓冲液中。重折叠蛋白质溶液4℃放置约24小时。

重折叠蛋白质溶液18,000g离心30分钟。将收集的上清液上样至体积约20ml的S-Sepharose柱。所述柱经缓冲液A(20mM NaPO₄，1mM EDTA，pH7.2)预平衡。样品以0.5ml/min的速度上样，然后用2个柱体积的缓冲液A洗柱。用缓冲液B(20mM NaPO₄，1mM EDTA，1M NaCl，pH7.2)的编程梯度以3ml/min的速度洗脱柱结合的蛋白质。

rHuCXCL9具有碱性pI值，为10.33。选择阳离子交换层析来纯化，缓冲液pH低于10.33。根据分批吸收/洗脱实验，将蛋白质结合条件优化为20mMNaPO₄，1mM EDTA，pH7.2(缓冲液A)。用缓冲液A平衡柱子。重折叠蛋白质溶液以0.5ml/min的速度上样后，用缓冲液A洗柱，至280nm处的吸光度回到基线，说明除去了非结合的蛋白质。然后通过由1M NaCl缓冲液B缓慢提高缓冲液的离子强度来洗脱重组蛋白。洗脱期间有两个蛋白质峰。第一个峰在电导率达到45mS/cm时出现(图14A，峰1)，而第二个峰在电导率60mS/cm时出现(图14A，峰2)。通过SDS-PAGE和蛋白质染色分析洗脱的蛋白质，发现了rHuCXCL9在峰2处洗脱(图14B)。根据图14B的泳道2，rHuCXCL9级分的纯度为90％以上。

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