用于测试冷藏食品中嗜冷菌的试纸条及其制备方法

摘要

一种生物传感技术领域的用于测试冷藏食品中嗜冷菌的试纸条及其制备方法，包括：底板、透明膜片、反应膜片、玻璃纤维片和聚酯板，其中：玻璃纤维片、反应膜片和透明膜片由上而下依次固定设置于聚酯板和底板之间，玻璃纤维片的两端分别与两块聚酯板的内侧相连接，聚酯板的外侧与底板固定连接，底板的中央设有一正对透明膜片的通孔。本发明敏感性强、准确率高、重复性好、使用范围广泛，试纸条能有效保存一年以上。

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种生物传感技术领域的产品，具体是一种用于测试冷藏食品中嗜冷菌的试纸条及其制备方法。

背景技术

嗜冷菌是一种抗冻能力极强的细菌，一般在0℃～20℃之间最适宜生长，因此给低温贮藏食物带来一定的困难，肉类、奶及奶制品、豆制品、沙拉和水产品等，都是较易受其污染的食物。大部分嗜冷菌在病原学上作为人畜共患和食源性疾病的致病菌已得到世界范围的普遍公认。目前检测嗜冷菌的方法主要是传统的细菌鉴定法及PCR、ELISA等免疫学检测方法，传统的细菌鉴定法操作繁琐、耗时长；免疫检测特异性强、灵敏度高，但一般只能用于检测单一病原菌且需要相关精密仪器，无法满足现场大规模的快速筛查嗜冷菌污染情况。

经对已有相关文献和专利的检索发现，中国专利申请号为200710070629.3，名称为“细菌实时荧光定量聚合酶链式反应检测试剂盒及其应用”。该专利的关键在于运用实时荧光定量PCR技术对常见菌进行检测，该方法样品前处理过程复杂且需要专业人员进行操作，不适于嗜冷菌的现场快速检测。

发明内容

本发明针对现有技术存在的上述不足，提供一种用于测试冷藏食品中嗜冷菌的试纸条及其制备方法，采用的快速检测食品中嗜冷菌的试纸条法是利用光电型的生物传感技术，将辣根过氧化物酶和盐酸邻联甲苯胺作为反应底物制备成反应底物膜片，当嗜冷菌和一定浓度的过氧化氢反应后剩余的过氧化氢便可与反应底物膜片中的试剂发生显色反应，颜色的深浅与过氧化氢的剩余量有关，从而可根据过氧化氢的剩余量反推出样品中原有嗜冷菌的含量，即过氧化氢的剩余量与样品中原有嗜冷菌的含量呈反比。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明涉及用于测试冷藏食品中嗜冷菌的试纸条，包括：底板、透明膜片、反应膜片、玻璃纤维片和聚酯板，其中：玻璃纤维片、反应膜片和透明膜片由上而下依次固定设置于聚酯板和底板之间，玻璃纤维片的两端分别与两块聚酯板的内侧相连接，聚酯板的外侧与底板固定连接，底板的中央设有一正对透明膜片的通孔。

所述的底板为PVC材料制成，所述的透明膜片为PET材料制成。

所述的反应膜片长度为1~2cm，其上表面设有厚度为10~30nm的辣根过氧化物酶层。

本发明涉及上述用于测试冷藏食品中嗜冷菌的试纸条的制备方法，包括以下步骤：

第一步、将盐酸邻联甲苯胺溶解于有机溶剂中，再以柠檬酸缓冲液进行定容处理，最后加入水溶性壳聚糖及牛血清蛋白并冷藏制成透明凝胶；

所述的有机溶剂是指体积比为1∶1~1∶3的无水乙醇和二氧六环的混合液；

所述的盐酸邻联甲苯胺的用量为：每200~600μL有机溶剂称取25~35mg的盐酸邻联甲苯胺；

所述的柠檬酸缓冲液是指pH4.5~6.0的柠檬酸缓冲液；

所述的定容处理是指：采用柠檬酸缓冲液定容为10~15mL。

第二步、将透明凝胶与柠檬黄和辣根过氧化酶搅拌均匀并置于真空干燥器中抽真空后冷藏，然后用涂布器涂覆于聚氯乙烯片上，经真空冷冻干燥重复进行二次涂膜及真空冷冻干燥，制成反应膜片。

所述的辣根过氧化酶的浓度为1mg/mL；

第三步、在底板中央打孔后分别将透明膜片、反应膜片和玻璃纤维片依次搭接粘贴在该底板上，并将两张聚酯板作为盖片整体固定，制成用于测试冷藏食品中嗜冷菌的试纸条。

本发明操作方法为：采用500μL测试杯，在测试杯中依次加入0.05mol/L盐酸邻联甲苯胺100μL、0.015％~0.02％过氧化氢100μL、冷藏食品浸出液100μL，充分反应10~15min后，将试纸条固定普通光反射计内，取30μL待测反应液加在试纸条的玻璃纤维片区域，待测反应液透过玻璃纤维片与反应膜片中的试剂发生显色反应，在45秒后记录光反射计显示数值。

本发明的结果判定标准：普通光反射计显示数值为0.45±0.01时，判定样品中嗜冷菌含量达标，为0~5×103CFU/mL，此时肉眼看试纸条样品反应区颜色为黄色，试纸条样品反应区原有颜色为黄色，结果判定为阴性；普通光反射计显示数值＞0.47时，判定样品中嗜冷菌含量超标，此时肉眼看试纸条样品反应区颜色为绿色，绿色的深浅与过氧化氢的剩余量呈正相关，结果判定为阳性。

本发明具有下列优点：敏感性强、准确率高、重复性好、使用范围广泛。本发明利用嗜冷菌分泌的过氧化氢酶针对性的催化过氧化氢，因此具有很高的敏感性，利用机械涂膜器制作出的底物膜片厚度均一，重复样品检测相对标准差(RSD)4.8％，结果准确率达到95％以上，其适用范围十分广阔。操作简便快速。本发明试纸条前处理简单，免除了传统细菌检测中细菌培养和检测过程中必须的无菌条件，因此可用于多数冷藏食品中嗜冷菌的直接快速检测，按测试程序10~15mim即可判断结果，非专业人员可在几分钟内学会且无需大型仪器设备。结果形象、准确。本发明试纸条通过普通光反射计显示的数值判定结果，同时还可直观以显色进行判断，背景清晰，无人为操作误差。有效期长、成本低、可大批量生产。本发明试纸条能有效保存一年以上，可批量生产，成本低廉，具有广阔的市场前景和大范围推广应用的价值。

附图说明

图1为本发明结构示意图。

图2为实施例菌落反射率示意图。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

如图1所示，本实施例制备所得的用于测试冷藏食品中嗜冷菌的试纸条，包括：底板1、透明膜片2、反应膜片3、玻璃纤维片4和聚酯板5，其中：玻璃纤维片4、反应膜片3和透明膜片2由上而下依次固定设置于聚酯板5和底板1之间，玻璃纤维片4的两端分别与两块聚酯板5的内侧相连接，聚酯板5的外侧与底板1固定连接，底板1的中央设有一正对透明膜片的通孔6

所述的底板1为PVC材料制成，颜色要求为白色，这样能提高颜色变化的对比值，使检测结果更加准确。

所述的透明膜片2为PET材料制成，要求具有良好的透光和反射功能。

所述的反应膜片3包括辣根过氧化物酶、显色剂、酶保护剂、交联剂。所述显色剂为盐酸邻联甲苯胺，嗜冷菌和一定浓度的过氧化氢反应后剩余的过氧化氢便可在辣根过氧化物酶的催化下与盐酸邻联甲苯胺发生显色反应，显色为蓝色。加入柠檬黄与蓝色叠合生成对比度更大的绿色，更好的提高了传感器的精密度。所述交联剂为水溶性壳聚糖，能让反应膜片牢牢地固定在透明承载膜片2上，此外，水溶性壳聚糖具有良好的亲水性，能让样品液更快的进入反应层反应。所述的酶保护剂为牛血清蛋白，这样能大大延长试纸条的使用寿命。反应膜片的制备采用涂布成膜法，制出的膜层厚度均一，可以使试纸条个体间差异降到最小。

反应膜层的制备：首先用200μL的无水乙醇和200μL的二氧六环充分溶解25mg的盐酸邻联甲苯胺，并用pH4.5的柠檬酸缓冲液将溶解液定容为10mL，然后分别加入0.3g水溶性壳聚糖和12mg牛血清蛋白，置于4℃冰箱中隔夜保存，形成透明凝胶，最后将8mL凝胶倾倒于研钵中，与5g柠檬黄和1mL的1mg/mL辣根过氧化酶搅拌均匀。置于真空干燥器中抽真空25min，放入4℃冰箱中10h。用涂布器在透明聚氯乙烯片上涂布成膜，真空冷冻干燥25min后进行二次涂膜，真空冷冻干燥，机械剪切为长度1~2cm的小片覆盖于底板1的通孔6上。

检测试纸条的组装为：将聚酯板盖片5和底板1叠合后用孔径为3~4mm的打孔机打孔，将反应底物膜层、玻璃纤维片4按图一所示对应孔洞依次固定在底板1上，固定好后，将聚酯板盖片5与底板1重合固定，最后用裁剪刀或切条机切成25×50mm的试纸条，将做好的试纸条与干燥剂一起装入铝箔袋内密封于4℃保存。

将试纸条固定普通光反射计内，取30μL待测反应液加在试纸条的玻璃纤维片区域，待测反应液透过玻璃纤维片与反应底物膜层中的试剂发生显色反应，颜色的深浅与过氧化氢的剩余量有关，从而可根据过氧化氢的剩余量反推出样品中原有嗜冷菌的含量。

以下结合实际操作来介绍嗜冷菌试纸条的使用。

(1)试纸条检测嗜冷菌标准株操作程序：吸取100μL嗜冷菌产单核细胞李斯特菌标准株培养液于400μL三蒸水中，并依次以5倍梯度稀释8~9管。采用500μL测试杯，在测试杯中依次按菌液浓度由大到小的顺序加入稀释菌液100μL、0.01mol/L盐酸邻联甲苯胺100μL、0.015％过氧化氢100μL，空白管用100μL三蒸水代替稀释菌液，充分反应10~15min后，将试纸条固定普通光反射计内，依次取30μL待测反应液加在玻璃纤维片上，待测反应液透过玻璃纤维片与反应膜片中的试剂发生显色反应，在45秒后记录光反射计显示数值。

(2)结果判定：当菌落数≤5×103CFU/mL时，普通光反射计显示数值为0.45±0.01时，判定样品中嗜冷菌含量达标，此时肉眼看试纸条样品反应区颜色为黄色，试纸条样品反应区原有颜色为黄色，结果判定为阴性；当菌落数＞5×104CFU/mL时，普通光反射计显示数值＞0.47时，判定样品中嗜冷菌含量超标，此时肉眼看试纸条样品反应区颜色为绿色，绿色的深浅与过氧化氢的剩余量呈正相关，结果判定为阳性。见图2

(3)重复性试验：用不同批次制作的试纸条重复检测5次不同稀释倍数的嗜冷菌标准株菌液，重复样品检测相对标准差(RSD)2.8％，结果准确率达到95％以上。

实施例2

试纸条的底板1、透明膜片2、玻璃纤维片4和聚酯板5，所用材料同实施例1，具体制作过程如下：

将聚酯板盖片5和底板1叠合后用孔径为3~4mm的打孔机打孔。

反应膜层的制备：改用35mg的盐酸邻联甲苯胺。其他试剂用量与制作方法同实施例1。机械剪切为长度1~2cm的小片覆盖于底板1的通孔6上。

将玻璃纤维片4剪切成大小与反应膜层相同的小片，覆盖于反应膜层上。

将反应底物膜层、玻璃纤维片4对应孔洞依次固定在底板1上，固定好后，将聚酯板盖片5与底板1重合固定，最后用裁剪刀或切条机切成25×50mm的试纸条，将做好的试纸条与干燥剂一起装入铝箔袋内密封于4℃保存。

按上述方法制出的试纸条，样品配制同实施例1，然后进行测试。取30μL不同浓度的嗜冷菌标准菌液滴加在按上述方法制成的试纸条玻璃纤维片区域，分别在30秒、45秒、60秒、75秒、90秒、105秒、120秒、后记录光反射计显示数值。发现嗜冷菌浓度与试纸条的光反射率在加样后45秒时成良好的拟合曲线。

实施例3

试纸条的底板1、透明膜片2、玻璃纤维片4和聚酯板5，所用材料同实施例1，具体制作过程如下：

将聚酯板盖片5和底板1叠合后用孔径为3~4mm的打孔机打孔。

反应膜层的制备：仍用25mg的盐酸邻联甲苯胺，辣根过氧化酶为2mg/mL。其他试剂用量与制作方法同实施例1。机械剪切为长度1~2cm的小片覆盖于底板1的通孔6上。

将玻璃纤维片4剪切成大小与反应膜层相同的小片，覆盖于反应膜层上。

将反应底物膜层、玻璃纤维片4对应孔洞依次固定在底板1上，固定好后，将聚酯板盖片5与底板1重合固定，最后用裁剪刀或切条机切成25×50mm的试纸条，将做好的试纸条与干燥剂一起装入铝箔袋内密封于4℃保存。

按上述方法制出的试纸条，结合以下操作进行测试

(1)人工向安全达标的冷藏豆腐中添加嗜冷菌的操作方法：用无菌注射器取产单核细胞李斯特标准菌液1ml均匀添加到冷藏豆腐表面，4℃冰箱保存12h。

(2)试纸条检测豆腐中嗜冷菌操作程序：采用500μL测试杯，在测试杯中依次加入0.01mol/L盐酸邻联甲苯胺100μL、0.015％过氧化氢100μL、上述冷藏豆腐样品浸出液100μL，充分反应15min后，将试纸条固定普通光反射计内，取30μL待测反应液加在玻璃纤维片上，在45秒后记录光反射计显示数值。

(3)结果判定：利用实施例一中的判定标准可判断人为添加过嗜冷菌的冷藏豆腐样品中嗜冷菌超标。结果由平皿计数实验证实，菌落数为1.5×106~2.5×106CFU/mL。

(4)重复性试验：用不同批次制作的试纸条重复检测人为添加过嗜冷菌的冷藏豆腐样品浸出液，结果准确率达到100％。

结合显色程度、嗜冷菌浓度与试纸条的光反射率所成拟合曲线的拟合度、反应时间、试纸条成本考虑。采用显色剂浓度0.01mol/L，辣根过氧化物酶1mg/mL的配方制作出嗜冷菌检测试纸条为最优方案。然后将试纸条固定普通光反射计内，取30μL待测反应液加在玻璃纤维片上，在45秒后记录光反射计显示数值。从而直接刻判断出样品中所含嗜冷菌含量。用该试纸条检测冷藏食品中的嗜冷菌，结果形象、准确、有效期长、成本低、可大批量生产，从而可以实现现场大规模的嗜冷菌快速检测。