铂类药物疗效相关基因mRNA表达检测液相芯片和检测方法

摘要

本发明公开了一种铂类药物疗效相关基因mRNA表达水平检测液相芯片，所述检测液相芯片，主要包括有：与胺基修饰的支持探针偶联的微球；连接支持探针与目标基因mRNA的支持延伸探针，每条支持延伸探针包括5’端能与对应的目标基因mRNA结合的特异性序列、间隔臂序列、3’端的能与对应的支持探针的特异性序列互补配对的序列；连接目标基因mRNA与信号检测组分间的扩增延伸探针，每条扩增延伸探针包括5’端能与目标基因mRNA结合的特异性序列、间隔臂序列、3’端能与标记探针互补配对的序列。本发明还公开了运用该液相芯片对铂类药物疗效相关基因mRNA表达水平检测的方法。本发明检测过程无需RNA提取、逆转录、PCR等步骤，检测结果受样本中RNA的质量影响较小，保证了检测结果的准确性；另一方面，由于液相芯片技术使多指标并行检测成为了现实，在一次检测中可设置多个内参基因，使检测结果更为可靠。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及铂类药物疗效相关基因mRNA表达检测液相芯片和检测方法。

背景技术

铂类是目前常用的广谱抗肿瘤药，已成为癌症化疗中不可缺少的药物。目前已发展出以卡铂为代表的第二代，和以奥沙利铂为代表的第三代铂类药物。铂类药物的抗肿瘤作用是通过作用于DNA，形成Pt-DNA结合物，导致DNA的链内和链间交联，从而抑制DNA的合成及复制。铂类药物的疗效虽得到广泛认可，但患者用药后药效的个体差异很大、且有不同程度的毒副作用。其副作用主要是消化系统毒性，常见为恶心、呕吐，还可有肾毒性、肝毒性和骨髓抑制，耳毒性和神经毒性较轻。

大量的临床研究已经证实，铂类药物的疗效/毒副作用与患者体内核苷酸切除修复交叉互补组1(ERCC1)、遗传性乳腺癌和卵巢癌易感基因BRCA1的表达水平关系密切。

(1)铂类药物与核苷酸切除修复交叉互补组1(ERCC1)

ERCC1是核酸外切修复家族中重要成员，参与DNA链的切割和损伤识别。缺失有功能ERCC1的肿瘤细胞不能修复顺铂导致的DNA损伤而死亡；反之，ERCC1 mRNA高表达则导致铂类药物的耐药。研究表明手术切除的中晚期非小细胞肺癌中ERCC1低表达接受吉西他滨和顺铂联合化疗后生存期明显延长，同时ERCC1表达阴性的肺癌患者接受辅助性化疗显著受益。另外，进展期非小细胞肺癌中ERCC1 mRNA低表达的患者中位生存期明显高于高表达者。研究已证实ERCC1参与非小细胞肺癌铂类化疗药物耐药发生，与肺癌疗效和生存期呈负相关；ERCC1 mRNA低表达者对含铂类化疗药的辅助化疗显示良好的获益率，因而ERCC1mRNA的表达水平可作为铂类药物耐药的关键指标之一。

(2)铂类药物、抗微管类药物与遗传性乳腺癌和卵巢癌易感基因BRCA1

铂类化合物是最常使用的肿瘤化疗药物，由于铂类药物通过广泛结合DNA而抑制细胞分裂实现抗癌目的，因此铂类药物的使用不可避免地损伤患者机体内正常分裂细胞，造成毒副作用。大量临床研究已经证实：铂类药物的疗效与肿瘤组织中BRCA1基因mRNA表达水平密切相关，即BRCA1基因表达水平低的患者对铂类药物敏感，反之表达水平高的患者表现耐药。

抗微管类化疗药是作用于细胞微管，通过影响纺锤体形成，从而抑制细胞有丝分裂的一类化疗药。抗微管类药物的抗癌谱很广，是使用最为广泛的抗肿瘤药物。但在临床应用中，却时常出现治疗有效率低和副作用大的问题，而且存在显著的个体差异。大量的临床研究显示，抗微管药物的疗效与肿瘤组织中BRCA1基因的mRNA表达水平密切相关，即BRCA1基因表达水平高的患者对抗微管类药物敏感，反之表达水平低的患者表现耐药。

在对卵巢癌患者的临床研究中显示，BRCA1的mRNA表达水平与铂类和紫杉醇治疗的疗效相关。BRCA1的mRNA低表达和中等表达的患者接受铂类化疗后的生存期比高表达患者显著增长，而在BRCA1 mRNA高表达的患者中，接受紫杉醇/铂类化疗的比只接受铂类化疗的患者生存期延长。

(3)持家基因β2-微球蛋白(B2M)、铁传递蛋白受体(TFRC)和TATA框结合蛋白(TBP)

持家基因一般在体内可稳定表达，但由于这种稳定表达是相对的，在一定的病理状态或用药情况下，某些常用的持家基因的表达也会发生变化。选择在我们所研究对象中稳定表达的基因作持家基因，对保证检测结果的准确性至关重要。因此，本发明从一定数量的常用持家基因中进行筛选，确定3个合适的持家基因，分别是：β2-微球蛋白(B2M)、铁传递蛋白受体(TFRC)、TATA框结合蛋白(TBP)。

基于以上基因的表达水平与铂类药物疗效的相关性，专家推荐患者在接受铂类药物治疗之前，应当进行相关的基因mRNA表达水平的检测，帮助临床医生根据患者的个体差异制定个体化用药方案，以提高药物疗效，减少药物毒副作用的发生。

目前，对基因的mRNA表达水平进行检测的技术主要有：逆转录定量PCR法、实时荧光定量PCR法、RNA原位核酸杂交(RISH)等。其中，RISH主要用于分析组织或细胞内RNA分布以了解特定基因的表达情况，且其过程较长、操作繁琐，不适合用于临床应用；而逆转录定量PCR法与实时荧光定量PCR法，首先，这两种方法均需要进行RNA抽提、逆转录，检测的结果受RNA降解影响大；其次，这两种方法只通过一对引物进行PCR扩增，容易产生非特异性结合，从而导致假阳性高；再次，这两种方法一般只有一个持家基因作对照，其准确性容易受到病理状态的影响；因此，逆转录定量PCR法与实时荧光定量PCR法作为临床应用均存在着难以克服的技术缺陷。

液相芯片技术利用聚苯乙烯微球作为反应的载体，在微球的制造过程中，掺入不同比例的染色剂，从而形成100种不同颜色编码的微球。不同的微球共价结合了针对不同待检测物的探针分子从而实现对多达100中待检物质的同步并行检测。因此，我们采用液相芯片技术可以同时检测多个基因的mRNA表达水平，实现了检测的高通量，大大提高了检测效率。

技术方案

本发明的目的之一是提供与铂类药物疗效相关的基因mRNA表达水平液相检测芯片，该液相芯片可用于检测以下5种目标基因的表达水平：ERCC1、BRCA1、B2M、TFRC、TBP。

实现上述目的的技术方案如下：

一种铂类药物疗效相关基因mRNA表达水平检测液相芯片，主要包括有：

(1)与胺基修饰的支持探针偶联的微球，每条支持探针主要包括5’端的间隔臂序列和3’端能与支持延伸探针互补配对的特异性序列P1，所述支持探针选自SEQ.NO.1-SEQ.NO.5，每个目标基因选用一种微球，每种微球具有不同的荧光编码；

(2)连接支持探针与目标基因mRNA的支持延伸探针，每条支持延伸探针主要包括5’端能与对应的目标基因mRNA结合的特异性序列P2、间隔臂序列、3’端能与对应的支持探针的特异性序列P1互补配对的P3序列，所述支持延伸探针的特异性序列P2包括有：针对ERCC1基因的选自SEQ.NO.6-SEQ.NO.10中的2条或2条以上、和/或针对BRCA1基因的选自SEQ.NO.11-SEQ.NO.16中的2条或2条以上；以及针对B2M基因的选自SEQ.NO.17-SEQ.NO.21中的2条或2条以上，针对TFRC基因的选自SEQ.NO.22-SEQ.NO.26中的2条或2条以上，和针对TBP基因的选自SEQ.NO.27-SEQ.NO.31中的2条或2条以上；

(3)扩增延伸探针，每条扩增延伸探针包括5’端能与目标基因mRNA结合的特异性序列P4、间隔臂序列、3’端序列P5，3’端还修饰有生物素；所述扩增延伸探针的特异性序列P4包括有：针对ERCC1基因的选自SEQ.NO.32-SEQ.NO.41中的5条或5条以上、和/或针对BRCA1基因的选自SEQ.NO.42-SEQ.NO.53中的5条或5条以上；以及针对B2M基因的选自SEQ.NO.54-SEQ.NO.63中的5条或5条以上，针对TFRC基因的选自SEQ.NO.64-SEQ.NO.73中的5条或5条以上，和针对TBP基因的选自SEQ.NO.74-SEQ.NO.83中的5条或5条以上；所述P5所述P5为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配、与P1、P2、P3、P4和总mRNA之间均不存在非特异性结合的序列。

或者，主要包括有：

(1)与胺基修饰的支持探针偶联的微球，每条支持探针主要包括5’端的间隔臂序列和3’端能与支持延伸探针互补配对的特异性序列P1，所述支持探针选自SEQ.NO.1-SEQ.NO.5，每个目标基因选用一种微球，每种微球具有不同的荧光编码；

(2)连接支持探针与目标基因mRNA的支持延伸探针，每条支持延伸探针主要包括5’端能与对应的目标基因mRNA结合的特异性序列P2、间隔臂序列、3’端能与对应的支持探针的特异性序列P1互补配对的P3序列，所述支持延伸探针的特异性序列P2包括有：针对ERCC1基因的选自SEQ.NO.6-SEQ.NO.10中的2条或2条以上、和/或针对BRCA1基因的选自SEQ.NO.11-SEQ.NO.16中的2条或2条以上；以及针对B2M基因的选自SEQ.NO.17-SEQ.NO.21中的2条或2条以上，针对TFRC基因的选自SEQ.NO.22-SEQ.NO.26中的2条或2条以上，和针对TBP基因的选自SEQ.NO.27-SEQ.NO.31中的2条或2条以上；

(3)扩增延伸探针，每条扩增延伸探针包括5’端能与目标基因mRNA结合的特异性序列P4、间隔臂序列、3’端序列P5；所述扩增延伸探针的特异性序列P4包括有：针对ERCC1基因的选自SEQ.NO.32-SEQ.NO.41中的5条或5条以上、和/或针对BRCA1基因的选自SEQ.NO.42-SEQ.NO.53中的5条或5条以上；以及针对B2M基因的选自SEQ.NO.54-SEQ.NO.63中的5条或5条以上，针对TFRC基因的选自SEQ.NO.64-SEQ.NO.73中的5条或5条以上，和针对TBP基因的选自SEQ.NO.74-SEQ.NO.83中的5条或5条以上；所述P5为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配、与P1、P2、P3、P4和总mRNA之间均不存在非特异性结合的序列；和

(4)标记探针，所述标记探针具有与扩增延伸探针P5互补配对的序列，且末端具有生物素修饰。

优选地，还包括有填充序列，包括：针对ERCC1基因的SEQ.NO.84；针对BRCA1基因的选自SEQ.NO.85-SEQ.NO.86中的一条或多条；针对B2M基因的选自SEQ.NO87-SEQ.NO.94中的一条或多条；和/或针对TFRC基因的选自SEQ.NO.95-SEQ.NO.98中的一条或多条.

优选地，所述间隔臂序列为5-10个T；所述P5的组成为CCTATGCCTCCCGTGTCTA。

本发明的另一目的是提供一种检测铂类药物疗效相关基因mRNA表达水平的方法。

具体方案如下：

一种检测铂类药物疗效相关基因mRNA表达水平的方法，使用权利要求1-4任一项所述液相芯片，主要包括以下步骤：

(1)裂解样本释放总RNA，得裂解混合液；

(2)将裂解混合液、偶联有支持探针的微球、支持延伸探针、扩增延伸探针密封于杂交板中，54℃±1℃，600rpm震荡孵育过夜，支持延伸探针的序列P3与支持探针的P1结合互补结合，支持延伸探针的特异性序列P2与目标mRNA特异结合，从而将目标mRNA结合到微球上；扩增延伸探针带有生物素标记，扩增延伸探针的P4与目标mRNA特异结合从而实现目标mRNA信号的级联放大；

(3)步骤(二)的产物与链霉亲和素-藻红蛋白进行反应；

(4)通过荧光检测仪检测。

或者，主要包括以下步骤：

(1)裂解样本释放总RNA，得裂解混合液；

(2)将裂解混合液、偶联有支持探针的微球、支持延伸探针、扩增延伸探针密封于杂交板中，54℃±1℃，600rpm震荡孵育过夜，支持延伸探针的序列P3与支持探针的P1结合互补结合，支持延伸探针的特异性序列P2与目标mRNA特异结合，从而将目标mRNA结合到微球上；扩增延伸探针的P4与目标mRNA特异结合；

(3)再加入标记探针，标记探针带有生物素标记，50℃±1℃，600rpm震荡孵育1小时，标记探针与扩增延伸探针的序列P5互补配对结合，从而实现目标mRNA信号的级联放大；

(4)步骤(三)的产物与链霉亲和素-藻红蛋白进行反应；

(5)通过荧光检测仪检测。

本发明的主要优点在于：

(1)本发明所设计的各种探针，能够在均一的反应条件下进行杂交反应，且各种探针之间基本不存在非特异性结合；所设计的探针在检测中特异性好、信噪比高。同时，多种探针的组合使用使液相芯片和检测方法形成一个检测效果完好的系统。运用本发明所述的液相芯片和检测方法，对铂类药物疗效相关基因mRNA表达水平进行检测，无需RNA提取、逆转录、PCR等步骤，检测结果受样本中RNA的质量影响较小，保证了检测结果的准确性；另一方面，以多个持家基因作对照(N≥3)，检测结果不易受病理状态的影响，准确性高；

(2)本发明使用的是探针的多位点特异配对、级联放大的方式来实现信号的放大，而不是PCR扩增的方法，提高了检测信号，实现了检测的特异性，避免了逆转录PCR和实时荧光定量PCR技术的假阳性。

(3)本发明所述的液相芯片和检测方法适用于新鲜组织，在石蜡包埋固定组织、组织切片均适用。对比起其他的mRNA检测方法，有着操作简易、准确性高、特异性高的特点。

具体实施方式

本领域的人员所知，所述间隔臂序列为用于将支持探针与微球表面间隔开来，在支持延伸探针与扩增延伸探针内部也存在间隔臂序列，通过在探针序列与胺基之间、探针内部设置适当长度的间隔臂序列，可减少空间位阻，提高杂交反应的效率以及杂交反应的特异性。常见的间隔臂序列包括多聚dT，即poly(dT)，寡聚四聚乙二醇以及(CH2)n间隔臂(n≥3)，如(CH2)12、(CH2)18等。另外，如果存在poly(dA)干扰，还可以用poly(TTG)作为间隔臂(间隔臂长度优选2-4)。本发明间隔臂优选为5-10个T，在中国，T的合成技术比较成熟，成本相对较低。

实施例1铂类药物疗效相关目标基因mRNA表达水平检测液相芯片试剂盒，主要包括有：

一、偶联有支持探针(SP)的微球

支持探针由三部分组成，5’端是与微球结合的胺基端，3’端是与支持延伸探针结合的特异性序列P1，中间是8个寡聚核苷酸T的间隔臂序列，每个目标基因选用一种微球，并选用一条支持探针，每种微球具有不同的荧光编码。每个目标基因的支持探针如表1所示：

表1不同的目标基因及其选用微球的编号、支持探针(SP)

  基因  微球号  SP序列(5’→3’)NH₂+poly(dT)+P1  SEQ ID  ERCC1  20  5’NH₂-TTTTTTTT-ATCATCAATCACTTTA  1  BRCA1  56  5’NH₂-TTTTTTTT-CTTTTACATTCATTAC  2  B2M  22  5’NH₂-TTTTTTTT-CTTTCTTTAATCTCAA  3  TFRC  61  5’NH₂-TTTTTTTT-CATTCAAATCTCAACT  4  TBP  33  5’NH₂-TTTTTTTT-CAATTACTTCAAATCT  5

所有探针由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。将合成的支持探针用灭菌ddH₂O配成100nmol/ml的贮存液。微球包被的过程如下：

分别取5×10⁶个上述编号的羧基化的微球(购自Luminex公司)悬浮于50ul 0.1mol/L的MES溶液中(pH4.5)，加入10ul合成的捕获探针(100nmol/ml)。配制10ng/ml的EDC(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide)(购自Pierce Chemical公司)工作液。往微球悬液中加入2.5ul的EDC工作液，恒温孵育30分钟，再加入2.5ul的EDC工作液，再恒温孵育30分钟。反应结束后，用0.02％的Tween-20洗涤一次，再用0.1％的SDS液洗涤一次。将洗涤后的包被有支持探针的微球重悬于100ul的Tris-EDTA溶液[10mmol/L Tris(pH8.0)，1mmol/LEDTA]中，2-8℃避光保存。

二、与目标基因mRNA特异结合的支持延伸探针(SE)、扩增延伸探针(AE)

1)支持延伸探针(SE)是连接支持探针(SP)与目标基因mRNA之间的序列，SE由三部分组成，5’端是能与目标基因mRNA结合的特异性序列P2，长度介于17nt至27nt，3’端是能与支持探针5’端通过碱基互补结合的特异性序列P3，中间是5个寡聚核苷酸T的间隔臂序列。每个目标基因分别设计5至6条支持延伸探针，以提高检测的特异性。使用时，针对每种目标基因，选择2条或2条以上支持延伸探针即可完成检测，特异性和稳定性都很好(实验数据省略)，优选于使用5至6条支持延伸探针，以使特异性达到最好。合成后的每条探针分别用10mmol/L Tris Buffer配制成100pmol/mL的贮存液。目标基因的支持延伸探针(SE)见表2。

表2目标基因的支持延伸探针(SE)

2)扩增延伸探针(AE)是连接目标基因mRNA与信号检测组分之间的序列，AE由三部分组成，5’端是能与目标基因mRNA结合的特异性序列P4，3’端是能与标记探针互补配对的序列P5，(如不运用标记探针检测时，则3’端还修饰有生物素)，中间是5个寡聚核苷酸T的间隔臂序列。每个目标基因分别设计10至12条扩增延伸探针，从而将检测信号进行级联放大。合成后的每条探针分别用10mmol/L Tris Buffer配制成100pmol/mL的贮存液。目标基因的扩增延伸探针(AE)见表3。所述P5的设计按照本领域的探针设计的公知常识，其为不存在内部发夹结构，探针内部和探针间都不形成二聚体、不存在错配，与P1、P2、P3、P4和总mRNA之间均不存在非特异性结合，本发明优选的碱基组成为CCTATGCCTCCCGTGTCTA。

使用时，针对每种目标基因，选择5条或5条以上扩增延伸探针即可完成检测，特异性和稳定性都很好(实验数据省略)，优选于使用10条或12条扩增延伸探针，以使特异性达到最好。

表3目标基因的扩增延伸探针(AE)

2)填充序列(FS)，将目标基因mRNA中没有与SE、AE特异结合的区域封闭，以减少后续反应中生物素或标记探针的非特异性结合，从而减少检测背景。填充序列的Tm值应与SE、AE接近，如表4所示。

表4目标基因的填充序列(FS)

三、标记探针(LP)

标记的探针(LP)由两部分组成，其3’端是能与扩增延伸探针序列P5互补结合的序列，5’端带有生物素标记，通过与扩增延伸探针结合实现目标mRNA信号的级联放大。

实施例2运用铂类药物疗效相关基因mRNA表达检测液相芯片对临床样本的检测所述各种溶液的配方如下：

一、裂解样本释放总RNA

1.将FFPE肿瘤组织切片从载玻片上刮下，放入1.5ml离心管中，加入300ul匀浆缓冲液和3ul蛋白酶K(50ug/ul)，混合均匀，65℃消化2h。

2.消化2h后的样品，室温下13,000rpm离心5分钟，吸取中间澄清的溶液转移至新的1.5ml离心管中备用。(如溶液仍不澄清，则重复本步骤1～2次。)

二、目标mRNA通过与探针特异性结合固定在微球上。

1.取出探针工作液于室温融解，然后在95℃变性5分钟，马上置于冰上。

2.按下表配制工作液，混合均匀

3.将上述配制好的工作液分装至杂交板上，60ul/孔。然后将上述处理好的样品以40ul/孔分别加入杂交板中；空白对照加入匀浆缓冲液40ul/孔。密封杂交板，54℃±1℃，600rpm震荡孵育过夜(16-22h)。

4.用洗涤缓冲液润湿滤板1分钟，除去洗涤缓冲液。

5.将杂交板取出，500×g离心1分钟。将反应液全部转移至滤板中。

6.除去溶液，用200ul洗涤缓冲液洗涤3次。

三、通过多步杂交反应将目标RNA信号放大

1.加入标记探针工作液100ul/孔。50℃±1℃，600rpm震荡孵育1小时。

2.除去溶液，用200ul洗涤液洗涤2次。

四、与SA-PE结合，并在液相芯片阅读仪上检测

1.加入SA-PE工作液100ul/孔，600rpm震荡室温孵育30min。

2.除去溶液，用200ul SA-PE洗涤液洗涤2次，用吸水纸吸干滤板底部。

3.加入SA-PE洗涤液130ul/孔。室温，600rpm震荡孵育2至5分钟。

4.在液相芯片仪上读取数据。

五、数据分析及cutoff值的界定

在5个目标基因中，目标基因2个，分别是：ERCC1、BRCA1；

持家基因3个，分别是：B2M、TFRC、TBP；

将读取的荧光值按照以下方法进行均一化处理：

步骤1：获得原始数据(MFI值)

步骤2：样品的MFI减去空白孔N的MFI＝net MFI

步骤3：每个样品的三个持家基因的net MFI值分别取几何平均值，得到相应的G1、G2、G3......Gn

步骤4：每个样品目标基因mRNA的net MFI除以对应的Gn得到相应的Nn。Nn即为已排除上样量差异，可在样品间进行相对表达量比较的数值。

本实施例中对10例样品进行检测，检测结果如下所示：

表610例样品原始数据(MFI值)与ERCC1、BRCA1的相对表达量

实施例3：不同间隔臂的液相芯片对铂类药物疗效相关基因mRNA表达水平的检测

一、液相芯片制备的设计(间隔臂的选择)

以ERCC1检测液相芯片的支持探针为例，分别选用不同的间隔臂，具体设计如表7所示。探针SP、SE与AE的合成、SP序列包被微球、检测方法等如实施例1和实施例2所述。

表7间隔臂及其长度

  间隔臂种类  长度  实验组  poly(dT)  8  1  poly(dA)  8  2  (CH2)n  15  3  poly(TTG)  3  4

二、样品检测

采用上述设计制备的液相芯片，按实施例2所述检测过程和方法对样品11-15进行检测，检测结果如下(表中数据为检测荧光值)：

表8样品检测结果(检测荧光值<MFI值>)

  Sample 实验组1 实验组2 实验组3 实验组4  N 8 12 18 9  11 8596 8645 8589 8649  12 6859 6845 6829 6798  13 6591 6488 6558 6524  14 3652 3695 3625 3678  15 5625 5698 5627 5675

将4组设计的检测荧光值进行统计学分析，证明4组设计的检测效果没有差异。因此，这4种间隔臂的设计是等效的。

其它针对支持延伸探针、扩增延伸探针内部不同的间隔序列的液相芯片，其结果依然稳定可靠，具体数据省略。

实施例4：不同信号检测组分液相芯片对铂类药物疗效相关基因mRNA表达水平的检测

一、液相芯片制备的设计(信号检测组分)

信号检测组分有两种选择，1)扩增延伸探针3’端序列P5的3’端带有生物素标记；2)扩增延伸探针3’端序列P5与标记探针(LP)通过碱基互补配对结合，同时标记探针的5’端带有生物素标记。这两种信号检测组分均能实现信号放大，检测到正常信号。其中，使用标记探针的生物素活性更加稳定，效果较优。

以所述液相芯片的检测ERCC1基因的两种信号检测组分为例，具体设计如表9所示。即所述液相芯片的组成为：

实验组1：支持探针偶联的微球、支持延伸探针、填充序列同实施例1，扩增延伸探针具有生物素标记；没有标记探针；

实验组2：支持探针偶联的微球、支持延伸探针、填充序列、标记探针同实施例1，扩增延伸探针不具有生物素标记。

表9信号检测组分

二、样品检测

采用上述设计制备的液相芯片，检测方法：实验组2同实施例2所述检测过程和方法对样品16-20进行检测，实验组1所述检测方法，省略(三、通过杂交反应将目标RNA信号放大)该步骤，其余同实施例2。

表10样品检测结果(检测荧光值<MFI值>)

  Sample  实验组1  实验组2  N  9  15  16  5968  5989  17  4658  4689  18  8569  8596  19  3596  3625  20  5681  5698

将两组设计的检测荧光值进行统计学分析，证明两组设计的检测结果没有差异，因此，这两种信号检测组分对信号的检测是等效的。其中，使用标记探针的信号检测组分，由于其生物素的活性更为稳定，效果较优。

以上是针对本发明的可行实施例的具体说明，但该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明技艺精神所为的等效实施或变更，均应包含于本发明的专利范围中。

序列表

<110>广州益善生物技术有限公司

<120>铂类药物疗效预测的基因mRNA表达检测液相芯片和检测方法

<160>99

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

atcatcaatc acttta                            16

<210>2

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

cttttacatt cattac                            16

<210>3

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

ctttctttaa tctcaa                            16

<210>4

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

cattcaaatc tcaact                            16

<210>5

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

caattacttc aaatct                            16

<210>6

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

ggctgaggaa cagggcaca                         19

<210>7

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

cacatccacc tggacaagca gg                     22

<210>8

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

ggcgaggatc aatgtgcagt c                      21

<210>9

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

gaggtccgct ggtttctgc                         19

<210>10

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

caggagggtc tgactgtccg ttt                    23

<210>11

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>11

gagtgagagg agctcccagg g                      21

<210>12

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>12

caagcagaaa atctttaagg gaccc                  25

<210>13

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<400>13

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<210>14

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>14

tgcctttgtg aacacagggt tttag                  25

<210>15

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

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<212>DNA

<213>人工序列

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<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

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<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

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<212>DNA

<213>人工序列

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<212>DNA

<213>人工序列

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<212>DNA

<213>人工序列

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<210>22

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

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acaatagccc aagtagccaa tcat                   24

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<211>22

<212>DNA

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<212>DNA

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tattttcttg ctgccagtct gg                     22

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<212>DNA

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<212>DNA

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<212>DNA

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caattggtgg cgtttaaatg gtt                    23

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aaccagctat tctcttgagg cca                    23

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<212>DNA

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agtgggggtg aattcagtgt agta                   24

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<211>23

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<211>25

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<211>22

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<211>23

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acccaacttc tgtacaactc tagc                   24

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tcttgaagtc caagaactta gctgg                  25

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<211>22

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gggtgagcac aaggccttct aa                     22

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<211>26

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tcatttctaa tacctgcctc agaatt                 26

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<211>17

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cagtaagtca acttcaatgt cg                     22

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catatcaata ttaaaaagca agc                    23

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<212>DNA

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ctacattttg tgcataaagt gta                    23

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cgcaagattt tcatcttttt gag                    23

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ctaccgttct tatcaactat gat                    23

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<211>19

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tagacacggg aggcatagg                         19