用于猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)病毒生长的非猿猴细胞

摘要

本发明公开了与使用非猿猴细胞生长猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)相关的组合物和方法。在一个具体的实例中，所公开的猪肺泡巨噬细胞具有支持PRRSV感染及繁殖的能力。本发明公开的细胞或细胞系可用于包括疫苗技术在内的与PRRS疾病相关的应用。

说明书

相关专利申请的交叉引用

本申请要求以2007年1月12日提交的流水号为US 60884782和 2007年8月17日提交的流水号为US 60956597的申请为优先权基础， 这些申请中不与本文矛盾的内容均通过引用的方式纳入本文。

政府资助的研究和开发的声明

无

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是猪的一种病毒疾病，该疾病与曾经 重创猪肉产业的任何现有的或以前的感染性疾病相比，每年都会造成最大 的经济损失。还被称为“神秘猪病(Mystery Swine Disease)”、猪不育与 呼吸综合征(SIRS)及“蓝耳病”的PRRS最初于1987年在北美及于1990 年在欧洲被首次检测到。从那时起，PRRS开始在全世界除澳大利亚外的 猪生产区成为猪产业的一个主要威胁。PRRS对幼仔和新生小猪的影响最 显著。在感染的母猪的一窝幼仔中有多达20-30％的小猪为死胎，在感染 的兽群中多达80％的小猪会在断奶前死亡。因此，该疾病会对经济产生 破坏性的后果(见Chladek等人的美国专利5476778)。一项部分由国家 猪肉委员会(National Pork Board)资助的研究中指出，仅在美国由PRRS 造成的损失就超过5.6亿美元(Neumann EJ et al.，2005)。

对PRRS的研究及诊断和治疗方法的开发(包括新疫苗和疫苗生产技 术)受到体外培养PRRS病毒的选择方案的有限可用性的限制。以前，现 有技术已知猿猴细胞是用于维持PRRS生长以进行疫苗生产的仅一可用 细胞系类型。猿猴细胞系MA-104及相关衍生物(如MARC-145)可能 代表迄今为止实际应用于支持PRRS病毒体外复制的唯一选择。

本发明对于现有技术的改进在于，提供用于操作PRRS病毒的其他 选择，例如可支持PRRS生长的非猿猴细胞的实施方案。

其他的结果不如意的方法已经被用于开发用于PRRSV生长的可选 方案。在一种方法中，猪肺泡巨噬细胞可用于PRRSV生长；然而，分离 自不同猪的细胞中高水平的固有变异性被认为是一个缺点(见Vincent et al.，2005；Bautista et al.，1993)。在另一种方法中，Weingartl等人在将从 12周龄猪获得的原代猪肺泡巨噬细胞转染后建立了猪单骨髓细胞系。经 测试这些细胞不能支持PRRSV的复制(Weingartl et al.，2002，Journal of Virological Methods 104：203-216)。相反，本发明令人吃惊地尤其公开了 这样的发现，即来自胎猪的某些细胞确实能够支持PRRSV生长。

利用本发明所惠及的技术应用包括应用研究方面，例如除了能够在 基础研究水平研究PRRS病毒的生长之外，还有兽医疫苗的生产。 PRRSV疫苗(其为改良的活疫苗或灭活的死疫苗)可通过本发明的细 胞和细胞系产生。用于培养这种具体病毒的工具和相关的方法在生成用 于诊断应用的材料的情形中也是重要。在意欲强调科学突破的类似历史 情形中，由于体外培养病毒困难及缺乏可选方案，操作人类免疫缺陷病 毒(HIV)的能力普遍受到限制。在研究及生成HIV的诊断及潜在疫苗 的能力方面的关键进步归因于这样的转折性事件，即能够在体外成功地 培养该病毒；见Gallo RC，2002，Historical essay.The early years of HIV/AIDS；Science 298(5599)：1728-30。

控制PRRS疾病的主要局限被认为是在于疫苗技术的可用性和有效 性。因此用于PRRS病毒生长的创新细胞和方法的贡献可表示以下能力 方面的显著进步：即操作PRRS病毒，开发其他的及/或改良的疫苗技 术，以及解决PRRS疾病的问题。

发明内容

本发明在广义上涉及能够繁殖PRRS病毒的非猿猴细胞及使用这种 细胞繁殖PRRS病毒的方法。

在一个实施方案中，本发明提供了一种能够繁殖PRRS病毒的分离 的非猿猴细胞，其中所述非猿猴细胞获自动物个体并被培养至少5个传 代。

在一个实施方案中，本发明提供了一种能够被PRRS病毒感染和/或 繁殖PRRS病毒的分离的猪胎肺细胞。在一个实施方案中，所述细胞为 肺泡巨噬细胞。在一个实施方案中，所述细胞在培养基中繁殖至少5个传 代。在一个实施方案中，所述细胞在培养物中繁殖至少10个传代。在一 个实施方案中，所述细胞在培养物中繁殖至少20和/或50个传代。

在一个实施方案中，本发明提供了获自猪胎肺的分离的原代细胞或细 胞群。在一个实施方案中，所述胎儿具有约30天至约90天的妊娠龄。在 一个实施方案中，所述细胞为肺泡巨噬细胞或包含至少一种肺泡巨噬细胞 的细胞群。在一个实施方案中，所述细胞为巨噬细胞、巨噬细胞系或其祖 细胞。

在一个实施方案中，本发明提供了在本文中被命名为ZMAC的细胞 或细胞系。在一个实施方案中，本发明提供了在本文中被命名为FBAL-A 的细胞或细胞系。在一个实施方案中，本发明提供了以美国标准生物品收 藏中心(American Type Culture Collection)指定为ATCC专利保藏编号 PTA-8764的保藏物为代表的细胞或其衍生物。

在一个实施方案中，本发明提供了具有支持PRRSV生长能力的本文 所述细胞的永生化细胞变体或衍生物。

在一个实施方案中，本发明提供了一种生成PRRS病毒子代的方法， 包括：

a)提供一种能够复制PRRS病毒的分离或纯化非猿猴细胞，其中所 述非猿猴细胞被培养至少5个传代；

b)将所述非猿猴细胞暴露于所述PRRS病毒；并且

c)使得所述PRRS病毒在所述细胞中复制；

从而生成PRRS病毒的子代。在一个实施方案中，所述非猿猴细胞获自 一个动物个体。在一个实施方案中，所述方法还包括收获所述培养的 PRRSV。

在一个实施方案中，本发明提供了一种产生PRRS疫苗的方法，包括 提供PRRSV的一种改良活病毒(MLV)毒株，并且在一种能够复制所述 PRRSV MLV株的分离或纯化非猿猴细胞中培养所述MLV毒株。在一个 实施方案中，所述非猿猴细胞为巨噬细胞、巨噬细胞系或其祖细胞。在一 个实施方案中，所述非猿猴细胞为猪细胞或其衍生物。在一个实施方案中， 所述非猿猴细胞为猪肺泡巨噬细胞。在一个实施方案中，所述非猿猴细胞 为猪肺泡巨噬细胞原代细胞、细胞群、其变体或衍生物。在所述方法的一 个实施方案中，所述细胞以被命名为ZMAC-1、FBAL-A的细胞或者以美 国标准生物品收藏中心指定为ATCC专利保藏编号PTA-8764的保藏物或 其衍生物为代表。

在一个实施方案中，本发明提供了一种组合物，包括被命名为 ZMAC-1或者以美国标准生物品收藏中心指定为ATCC专利保藏编号 PTA-8764的保藏物或其衍生物为代表的细胞或细胞系。在一个实施方案 中，本发明提供了一种包含被命名为FBAL-A的细胞或细胞系的组合物。

在一个实施方案中，本发明提供了一种从猪胎肺中分离细胞的方法， 包括提供一个猪胎儿受试材料；从所述受试材料中获得包含细胞的支气管 肺泡灌洗样品；并且从所述样品中分离细胞组分；从而分离所述细胞。在 一个实施方案中，所述包含细胞的样品为支气管肺泡灌洗样品。在一个实 施方案中，所述样品为任选地被浸软及/或匀浆化处理的经切割的组织样 品。

在一个实施方案中，本发明提供了一种培养病毒的方法，包括：(a) 从猪胎肺中分离细胞；(b)培养所述细胞；并且(c)将所述细胞与所述 病毒接触以使病毒复制；从而培养所述病毒。在一个实施方案中，所述病 毒为PRRS病毒。在一个实施方案中，所述病毒为减毒的PRRS病毒或 者PRRS病毒野分离株。在一个实施方案中，所述野分离株是强毒的或者 天然低毒或无毒的。在一个实施方案中，所述培养包括传代所述细胞至少 5个传代并且/或者连续培养所述细胞至少10天。

在一个实施方案中，本发明提供了一种培养并分离PRRSV的方法， 所述方法包括将所述病毒接种于含有血清的合适生长培养基中的非猿猴 细胞培养物上，并且孵育所述经接种的细胞直至生成PRRSV子代病毒材 料。在一个具体的实施方案中，所述PRRSV为ATCC-VR2332。在一个 具体的实施方案中，所述非猿猴细胞在之前已经在培养基中被培养至少5 个传代。在另一个具体的实施方案中，所述非猿猴细胞在之前已经被培养 至少10、20和/或50个传代。

在一个实施方案中，本发明提供了一种培养PRRSV的方法，包括(a) 将PRRSV接种于在之前已经被培养至少10、20和/或50个传代的非猿猴 细胞上；并且(b)孵育所述经接种的非猿猴细胞。在一个实施方案中， 所述非猿猴细胞为猪肺泡巨噬细胞。在一个实施方案中，所述非猿猴细胞 获自猪胎肺样品。在一个实施方案中，所述PRRSV来自感染该病毒的猪 组织匀浆。在一个实施方案中，所述方法包括孵育所述培养物直至一个固 定的时间段及/或直至出现细胞病变效应。在一个实施方案中，所述固定 的时间段为约16小时-约72小时。

在一个实施方案中，本发明提供了一种包含灭活PRRSV的免疫原性 组合物，其中所述灭活病毒通过这样的方法形成，即所述方法包括在非猿 猴细胞上培养PRRSV，之后灭活所述病毒，其中所述非猿猴细胞在之前 已经被培养至少10、20和/或50个传代。在一个实施方案中，培养病毒 包括：(a)将猪不育与呼吸综合征病毒接种于所述细胞上；并且(b)在 约34℃-约37℃下孵育所述接种的细胞。在一个实施方案中，培养所述病 毒涉及一种包含血清的生长培养基。在一个实施方案中，所述灭活病毒为 灭活的PRRSV毒株ATCC VR-2332。在一个实施方案中，所述免疫原性 组合物还包括佐剂和/或可药用的载体。

在一个实施方案中，本发明提供了一种包含培养于本发明细胞中的病 毒的组合物。在一个实施方案中，所述病毒为PRRS病毒(其可包括来自 PRRS病毒的病毒)。

在本发明方法的一个实施方案中，将本发明的细胞与生长因子组合 物相接触。在一个实施方案中，所述生长因子组合物包含巨噬细胞集落刺 激因子(MCSF)。在一个实施方案中，所述生长因子组合物包含粒细胞- 巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)。

在一个实施方案中，本发明提供了一种包含非猿猴细胞培养物中的或 来自非猿猴细胞培养物的PRRSV的组合物；其中所述非猿猴细胞在之前 已经被培养至少5、10、20和/或50个传代，并且/或者来自于源自胎猪肺 样品的猪肺泡巨噬细胞。在一个实施方案中，PRRSV为难养的、非红细 胞凝聚的包膜RNA病毒，并且能够使猪感染PRRS。在一个实施方案中， 所述组合物的病毒滴度为约10³-约10⁷TCID₅₀/ml。在一个实施方案中， 所述病毒滴度的上限至约10⁹ TCID₅₀/ml。在一个实施方案中，所述 PRRSV为MLV毒株。在一个实施方案中，所述PRRSV来自包含来自 于感染PRRS的猪的组织匀浆的接种物。在一个实施方案中，所述接种物 来自中和的组织匀浆，并且所述中和的组织匀浆的获得是通过以针对选自 以下猪病的抗体血清中和所述组织匀浆：嗜血杆菌(hemophilus)、布氏 菌病(brucellosis)、钩端螺旋体病(leptospira)、细小病毒病(parvovirus)、 伪狂犬病(pseudorabies)、脑心肌炎(encephalomyocarditis)、肠道病毒、 猪流感或它们的混合物。在一个实施方案中，所述接种物来自所述组织匀 浆的过滤匀浆，所述过滤的匀浆包含大小不大于约0.45微米的颗粒。

在一个实施方案中，本发明提供了一种非猿猴细胞，其中所述细胞为 猪细胞。在一个具体的实施方案中，所述细胞来自猪肺。在一个优选的实 施方案中，所述细胞来自猪胎肺。在一个具体的实施方案中，所述猪胎肺 来自约20日至约80日孕龄的猪胎。在一个特别优选的实施方案中，所述 猪胎具有约50日至约70日孕龄。在一个实施方案中，所述细胞获自猪胎 的肺灌洗液样品。在一个具体的实施方案中，所述细胞为猪肺泡巨噬细胞。

在一个实施方案中，优选地选择非粘附细胞及/或相对低粘附的细胞。 在一个实施方案中，从猪胎肺获得混合的细胞群。在一个实施方案中，在 所述混合细胞群中有至少两种细胞类型，包括巨噬细胞/单核细胞系的前 体细胞，这种细胞是自我更新的并且是相对低分化的或未分化的；以及巨 噬细胞/单核细胞系的分化细胞，这种细胞是相对高分化的。在一个实施 方案中，在所述混合细胞群中有至少第三种细胞类型，该类型为饲养细胞 类型/辅助细胞类型。在一个实施方案中，所述第三种细胞类型来自内源 性样品，或者是外源添加的。

在一个实施方案中，本发明的细胞和/或细胞群可以被描述为具有内 皮细胞前体的群，即所述内皮细胞前体可在合适的培养条件下产生内皮细 胞。例如，所述培养条件可以包括塑料器皿的类型及/或表面处理。

在一个实施方案中，可以有一部分细胞表达CD90和CD117。在一个 具体的实施方案中，该部分为约30％或至少30％。

在一个实施方案中，本发明的非猿猴细胞被用于产生抗猪繁殖与呼吸 综合征病毒(PRRSV)的疫苗。

在一个实施方案中，本发明的细胞或细胞系能够支持野生型或实验室 毒株型的PRRS病毒的生长。在一个优选的实施方案中，本发明支持PRRS 改良的活病毒的生长。在一个具体的实施方案中，所述病毒株对应于或来 自Boehringer Ingelheim的产品系列，例如PRRS和 PRRS猪疫苗。在一个具体的实施方案中，所述病毒株对应 于或来自Schehng-Ploug产品系列的PRRS疫苗。在一个具 体的实施方案中，所述病毒是用于美国兽医生物产品许可的代码为 19S5.20的猪繁殖与呼吸综合征疫苗(繁殖型、灭活病毒)的(United States Veterinary Biological Product License(03/29/96)for Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Vaccine，Reproductive Form， Killed Virus，Code 19S5.20)(1996年3月29)的分离株。在一个实施方 案中，所述PRRS病毒为减毒病毒。在一个实施方案中，所述PRRS病 毒为野分离株。在一个实施方案中，所述野分离株是强毒毒株或者天然低 毒或无毒的毒株。在一个实施方案中，本发明的组合物和方法适合于被用 于制造活疫苗、减毒疫苗或灭活疫苗的PRRS病毒材料的生长。

在本发明细胞或细胞系的一个实施方案中，用非永生的或已经永生化 的细胞或细胞系的起始材料可建立永生化的衍生物。在一个实施方案中， 使用一种或多种本领域已知的转化技术或其他永生化技术可建立永生化 的细胞系或细胞系。

在本发明细胞或细胞系的一个实施方案中，可建立一个或多个亚克 隆。例如，依照常规技术例如通过对培养物的有限稀释来分离并繁殖亚克 隆。

在本发明的一个实施方案中，将原代细胞或细胞系培养至少5个传 代。在另一个实施方案中，将原代细胞或细胞系培养至少10个传代、至 少20个传代及/或至少50个传代。在本发明的一个实施方案中，将原代 细胞或细胞系培养至少1周。在本发明的一个实施方案中，将原代细胞或 细胞系培养至少2周。在其他实施方案中，将原代细胞或细胞系培养至少 4周、至少8周及或至少16周。

在一个实施方案中，一种组合物例如细胞或细胞系被分离或被纯化。

在一个实施方案中，本发明提供了一种培养猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV)的方法，所述方法通过在组织培养物中培养所述病毒，至其 量足以保护动物免受PRRS、以诊断PRRS或者以识别PRRSV亚基或重 组体产物的分子结构，包括将PRRSV接种于非猿猴细胞或细胞系的组织 培养物上并收获所培养的病毒。在一个实施方案中，所述细胞或细胞系是 猪的。在一个实施方案中，所述细胞或细胞系为猪肺泡巨噬细胞。在一个 实施方案中，本发明提供了一种包含依照所述方法产生的PRRSV的组织 培养物。在一个实施方案中，本发明提供了一种制备用于保护猪免受 PRRS的有效疫苗的方法，包括提供如本文所述的PRRSV，从所述组织 培养细胞释放PRRSV，并且通过稀释、浓缩或提取来调节抗原量以产生 免疫有效量的抗原量，用于相对完整的产品、亚基产品或重组产品。

在一个实施方案中，本发明的非猿猴细胞或细胞系被用于产生活 PRRSV或灭活的(inactivated/killed)PRRSV。

在一个实施方案中，本发明提供了来自胎猪的巨噬细胞系的经纯化非 猿猴细胞或细胞系。在一个实施方案中，本发明提供了一种产生来自胎猪 的巨噬细胞系的经纯化非猿猴细胞或细胞系的方法。在一个实施方案中， 所述细胞或细胞系在体外培养至少3个、5个或10个传代。

不希望拘囿于任何具体理论，本文对涉及本发明的基本原理或机制的 意见或认识进行了讨论。应认识到不管任何解释或假设最后是否正确，但 本发明的实施方案都是可实施的和可用的。

附图说明

图1显示了两种PRRSV减毒毒株(PrimePac和Syva)在非猿猴细 胞UIMAC FBAL-A的培养物中的生长。

图2显示了UIMAC-FBAL-A细胞的表型，包括特征性巨噬细胞表 面标记物的表达。

图3显示了使用显微技术的FBAL-A细胞的形态学特征：A)吉姆 萨染色，以显示形态学表观(cytospin)；B)染色CD14的FBAL-A的共 聚焦显微镜检查；C)染色CD172的共聚焦荧光显微染色；以及D)染色 核壳抗原的PRRSV感染的FBAL-A，表明了N抗原至核的并且与核仁关 联的特征性定位。图3B和图3C显示了染色CD14或CD172的新鲜细胞 的真实形态，具有特征性的丝状伪足或板状伪足。

图4显示了ZMAC细胞的生长动力学数据(图4A)和使用该细胞 的PPRSV生长动力学数据(图4B)。

图5显示了以1MOI(图5A)和0.1MOI(图5B)的PRRS病毒 毒株NADC20感染20小时后的ZMAC细胞。将细胞固定并以对核壳(N) 蛋白特异的FITC标记的SDOW17mAb染色。

图6显示了在暴露于野生型PRRS病毒后猪体重变化的结果。

图7显示了在暴露于野生型PRRS病毒后猪病毒血症的程度和频率。

图8显示了在暴露于野生型PRRS病毒后来自猪支气管肺泡灌洗样品 中的病毒载量测量结果。

图9显示了ZMAC-1细胞在存在生长因子的条件下的生长。

具体实施方式

应用以下缩写：PRRS，猪繁殖与呼吸综合征；PRRSV，PRRS病毒； TCID₅₀，50％水平的组织培养感染剂量；ATCC，美国标准生物品收藏中 心；MOI，感染复数。

一般而言，本文使用的术语和短语具有本领域公认的含义，其可通过 参考本领域技术人员已知的标准教科书、期刊文献和背景而理解。下列定 义用于阐明其在本发明上下文中的具体用法。

本文使用的术语“细胞”可以指一种本领域所理解的生物学实体， 该术语意在涵盖可以被描述为原代细胞或细胞系的具体实体。如果本文 中使用了多个这些术语，本领域普通技术人员应了解这种用法仅仅是出 于强调熟知区别之目的。例如，短语“细胞或细胞系”可以强调原始的 原代分离株和永生化形式之间的差别，所述永生化形式可能是所述原始 的原代分离株的直接衍生物。

本文使用的术语“分离的”是指这样的操作状态，即该状态不同于 其天然状态以及/或者相对于起始材料是被改变的，在该情况下所述术语 的意义与概念“被纯化的”一致。例如，分离的原代细胞被从宿主生物 体的天然组织或其他来源剥离，并与原始的来源保持分开。又例如，细 胞组分可以被置于培养物中或者被进一步从基于肺灌洗液的样品中分 开，因此得到相对分离的细胞。

本文使用的术语“纯化的”是指这样的状态，即其中相对于起始材 料存在一种物质的相对的富集、分开以及/或者取出。该术语涵盖至少部 分纯化的状态，而不必指绝对的纯化态。例如，该术语可适用于能够繁 殖PRRS病毒并存在于混合的培养物中的细胞，并且可独立地应用于通 常所认为纯的培养物。该术语可适用于任选地为混合培养物的原代细胞 培养物。该术语可适用于细胞系。

在一个实施方案中，本发明提供了一个能够支持PRRSV生长的猪肺泡 巨噬细胞系。本发明的一种示例性组合物为一种非猿猴细胞系。本发明的 具体组合物包括获自猪胎肺样品的细胞或细胞群。另一个具体的组合物包 括胎猪肺泡巨噬细胞。在一个实施方案中，本发明提供了在非猿猴细胞或 细胞系中培养PRRSV的方法。

通过以下非限制性实施例可进一步理解本发明。

实施例1.非猿猴细胞分离株UIMAC FBAL-A能够支持PRRSV生 长。

猪肺泡巨噬细胞系UIMAC FBAL-A是通过以培养基对45日龄猪胎 的肺进行支气管肺泡灌洗而获得。最初的培养物在体外经过6个月的时间 从最初的数千细胞扩大至数百万细胞。在此时，进行实验以测量PRRS 病毒的生长。这些实验显示，FBAL-A细胞可支持该病毒的复制。该分离 株没有被特意地转化还证明了在培养物中生长并增殖的能力以及具有支 持PRRS病毒侵染性及生长的能力的表型。

细胞培养条件如下。培养基：补充L-谷酰胺和25mM HEPES的 RPMI 1640。该培养基补充有非必需氨基酸、丙酮酸钠、艮他霉素和10％ 胎牛血清。将细胞在37℃下于5％CO₂中在100％湿度下孵育。将组织培 养级6孔板用于培养物表面。使用4-6ml培养基/孔的培养物体积。选择 非粘附的或弱粘附的细胞用于进行传代。借助巴斯德吸管和橡胶球通过 在培养物流体中轻轻悬浮细胞并将1/3的孔体积转移至一个新孔中，每 3-4天将部分细胞从培养物中取出。向新孔和原孔进料新鲜培养基。

图1显示了两个PRRSV减毒毒株PrimePac和Syva在UIMAC FBAL-A中的生长。结果证明，所述猪细胞可用于产生其量足够进行疫 苗生产的PRRS疫苗病毒。

分离的猪细胞可以是通过表达某些表面分子而被识别并且/或者被 分离。所述表达的表面分子模式可作为针对支持PRRSV生长的能力的 潜在指示物，用于分离其他独立的猪细胞或者用于筛查细胞系。例如， 任选地筛查细胞CD163的表达。在一个具体的实施例中，借助细胞表 面分子对细胞或细胞系施以染色以及/或者分离技术。

图2显示了UIMAC-FBAL-A细胞的表型，包括特征的巨噬细胞表 面标记物的表达。FBAL-A细胞表达CD14、CD163和CD172。蛋白分 子CD163为单核细胞/巨噬细胞系的指示物，并与非洲猪瘟病毒感染的容 许性(permissiveness)有关。这些细胞还表达低水平的MHC II类分子。 朝向左侧的红线代表阴性对照样品的染色结果。可注意到，特定标记物(包 括本文中描述的这种)的表达可用于表征所述细胞，但还可以独立地用于 富集、分离(如通过分拣)及其他目的。在一个实施方案中，虽然本发明 的细胞例如巨噬细胞可能会不必表达一种或多种给定的特定标记物或者 其表达模式可能随时间变化，但是仍然能够复制PRRSV。

图3显示了使用显微技术观察到的FBAL-A细胞的形态学特征：A) 吉姆萨染色，以显示形态学表观(cytospin)；B)染色CD14的FBAL-A 的共聚焦显微镜检查；C)染色CD172的共聚焦荧光显微染色；以及D) 染色核壳抗原的PRRSV感染的FBAL-A，表明了N抗原至核并与核仁关 联的特征性定位。图3B和图3C显示了染色CD14或CD172的新鲜细胞 的真实形态，具有特征性的丝状伪足或板状伪足。

在镜检实验中，将细胞离心至载玻片上并用吉姆萨染色法染色。将未 固定的细胞与对SWC3或CD14特异的单克隆抗体孵育，然后暴露于 FITC-标记的山羊抗小鼠Ig。对于PRRSV核壳的检测，以PRRS病毒(毒 株VR-2332)感染细胞。在18h后，将细胞离心至载玻片上、以丙酮固 定并且与FITC-标记的抗PRRS病毒N蛋白mAb SDOW17孵育。未感 染的细胞不与mAb SDOW17反应。在生长动力学研究中，PRRSV分离 株VR2332被用于UIMAC-FBAL-A细胞中。在MARC-145细胞中滴定 获自巨噬细胞系的病毒产量。

不希望拘囿于理论的解释，对于某些组合物而言，本发明人认为本文 描述的来自猪胎肺的细胞可以包含自我再生的祖细胞。这些自我再生的祖 细胞可产生后代巨噬细胞，这些后代巨噬细胞抗原可以进一步分化；而且 所述自我再生的祖细胞可以具有产生另外的祖细胞使得增殖继续的能力。

实施例2.非猿猴细胞分离株ZMAC能够支持PRRSV生长。

除了形成FBAL-A细胞外，一项独立的成果形成了被命名为ZMAC 的第二细胞分离株。ZMAC细胞被表征并且被发现具有支持PRRSV侵染 及生长的能力。

在该独立的尝试中，在无菌条件下从母猪9688的子宫获取6只58日 龄胎猪，该母猪获自伊利诺伊大学兽医研究农场(University of Illinois Veterinary Medicine Research Farm)的猪群。这只母猪是具有以下血统 成份的杂种猪：17/32长白猪(Landrace)、13/32约克夏猪(Yorkshire) 和2/32杜洛克猪(Duroc)。将这些胎猪运输至细胞培育实验室，在生物 安全的橱柜内于无菌条件下将它们的肺切割。

将6只胎猪中每只肺气道中的细胞分别地通过支气管肺泡灌洗分离。 从每只胎猪的肺获得约100,000个细胞。来自每只胎猪的细胞被分开地培 养于6-孔组织培养板的不同孔中。在最初4天培养后，将细胞经 Ficoll-Hypaque密度梯度纯化。在一个实施方案中，可以在分离当天或者 在以后的时间，例如1周、2周或3周后通过Ficoll-Hypaque纯化细胞(公 认这可有利于除去存在于原始制品中的某些组分例如红细胞及可能的其 他材料)。在最初的培养物建立后20天内，细胞呈现出强劲的生长，将其 传代培养(split)至另外的6-孔板中。这些细胞被命名为ZMAC/FBAL-II， 并且被进一步指定为亚系1-6以标识从6个不同猪胎分离的细胞。随后大 约每4-5天将细胞传代培养。细胞强劲生长的证据在于存在这样的细胞簇， 即每簇中的细胞约每2.5天-3天出现倍增。至开始培养后60天时， ZMAC/FBAL-II.1和ZMAC/FBAL-II.2细胞呈现了比其他4个系更好的 生长。经过进一步传代，ZMAC/FBAL-II.1和ZMAC/FBAL-II.2系生长 得足够好，以至于可转移至75cm²组织培养烧瓶中。培养条件一般如上 述。在该实验中，使用Sarstedt烧瓶用于悬浮培养。

经过多次传代，所述细胞呈现了旺盛的生长；每10-12天能够收获数 百万个细胞。生长曲线表明，所述细胞和FBAL-1(FBAL-A)细胞均能 够复制PRRS病毒。在一项测定中，病毒的产量为约0.2 TCID₅₀/细胞。 在这些细胞中测试了两种类型的改良活PRRS病毒分离株的生长 (Schering-Plough的PrimePac毒株和欧洲Syva的西班牙疫苗分离株)。

五批细胞被冷冻并保存在液氮中。每批至少有10瓶，每瓶有2百万 个细胞。发现来自每批的代表性瓶在融化后具有＞80％的生存力，并在培 养起始后4天内呈现旺盛的生长。ZMAC群被已经发现对PRRS病毒的 感染是70％易感的，这通过在以0.01 MOI感染后18小时内对病毒蛋白 进行免疫荧光染色确定。在另一项评估中，本发明人已确定，ZMAC细 胞系对PRRS病毒的感染是100％易感的，这通过在以10MOI感染后12 小时内对病毒蛋白进行免疫荧光染色确定。

本发明人通过以0.02 MOI的PRRS病毒(PrimePac)感染ZMAC 细胞，还绘制了多步骤生长曲线。基于对感染细胞中病毒基因组表达的实 时PCR分析并且通过滴定所产生的病毒后代的量，本发明人已经确定 PRRS病毒的首轮复制在感染后9小时完成，并且病毒后代的产量的峰值 是在感染后18小时的第二轮复制时达到(图4B)。

在图4中，图4A示出ZMAC细胞的生长动力学结果。将确立的 ZMAC细胞培养物培养于75cm²培养烧瓶中，包含密度为2-3.2×10⁵细胞/ml的15ml细胞；向细胞进料等体积的新鲜培养基以得到1-1.6× 10⁵细胞/ml的细胞密度。在提供新鲜培养基后0天、3天和6天时计数细 胞。每个烧瓶每4天能够产生2-3×10⁶个细胞。

图4B显示了PRRS病毒在ZMAC细胞上的多步骤生长曲线。在这 些实验中，结果显示了PRRSV在ZMAC细胞上生长的病毒产量和动力 学。将1×10⁶/ml的ZMAC细胞悬浮物用减毒PRRS病毒分离株PrimePac 以0.02的MOI感染。在37℃下孵育1小时后，通过离心除去接种物，将 细胞以1×10⁶/ml悬浮。在感染后的指定时间取出0.1ml的体积，并且在 MARC-145细胞中确定TCID₅₀单位的数目。减毒的PRRS病毒株 PrimePac(可能适合作为疫苗材料)在ZMAC细胞系中生长良好。

图5显示了以1MOI(图5A)和0.1MOI(图5B)的PRRS病毒 株NADC20感染20小时后的ZMAC细胞。还观察了模拟感染细胞的一 个阴性对照(未显示)。细胞被固定并以对核壳(N)蛋白特异的FITC标 记的SDOW17mAb染色。还进行了相差显微镜检查来观察细胞。这些细 胞通常在感染后约28-36小时之前不出现CPE。然而，大量的病毒材料从 细胞中释放的时间要早得多，例如在感染后约18-20小时。

为了将病毒效价最大化及/或最优化，将细胞样品用于调整细胞生长 条件及病毒生长条件。PRRS病毒原种因此被产生，并可以被用于疫苗开 发及疫苗接种。

实施例3.能够支持PRRSV生长的永生化非猿猴细胞系

本发明的细胞或细胞系被建立为一种或多种自发的永生化变体、特意 转化的衍生物、其他变体或衍生物以及本文描述的原代细胞或细胞系的其 他永生化形式。

例如，技术被以本领域中理解的方式应用，例如涉及病毒转化技术； 与永生化配偶物融合；暴露于化学的/物理的条件，包括例如辐照；以及 与端粒酶功能操作相关的技术。在一种优选的方法中，tert系统(tert system)被用来确立能够避免、延迟或改变衰老的细胞或细胞系。见例如 Carrillo et al.，Veterinary Immunology and lmmunopathology 89(2002) 91-98；Kwak S et al.，2006 Animal Biotechnology，17：51-58； http://www.atcc.org/common/products/CellImmortProducts.cfm。

在永生化细胞的初步分离努力或下游开发中，诸如纯化及/或亚克隆 这样的方面得益于荧光活化细胞分拣技术或其他流式细胞分离或分析技 术的促进作用。其他技术如磁性细胞分离适合与本文的细胞和方法一块使 用。

实施例4.PRRS改良活疫苗的免疫原性及效力的测定

在该实施例中，使用猪巨噬细胞系产生的PRRS改良活疫苗的免疫原 性及效力被测定。一个猪肺泡巨噬细胞系被测试。在一种具体的情况下， 使用猪巨噬细胞原代细胞系UIMAC-FBAL-A和/或ZMAC。或者，可以 产生独立的起始材料和/或衍生物，例如根据本发明公开内容的转化体。

选择PRRS MLV候选物并用本文描述的细胞或细胞系进行生产，以 产生PRRS MLV材料用于临床试验评估。以32只4周龄猪进行疫苗接种 和激发研究，这些猪被随机分配至4组中，每组n＝8。这些猪获自伊利诺 伊大学兽医研究农场的无PRRS病毒的猪群，并且在开始研究之前在隔离 设施中适应一周。

在组1和2中动物的臀部区域用培养于UIMAC-FBAL-A细胞或 MARC-145细胞中的2ml MLV原种以5×10⁴TCID₅₀单位的剂量免疫一 次。将组3中的动物以2ml UIMAC-FBAL-A细胞的耗尽培养物上清液 和猿猴MARC-145细胞的耗尽培养物上清液的50∶50混合物注射。组4 中的动物不经处理，作为对照。作为病毒特异性免疫的一个量度，在免疫 后1周、2周、4周、6周和8周从每只动物收集外周血样品。从这些样 品获得血清和PBMC，并测量了体液和细胞介导的免疫反应的强度。分 别抗两个亲本PRRS病毒分离株FL-12和NEB-1、一种嵌合病毒(Kwon B，2006)及强毒的激发株VR2385(Opriessnig T，2002)的血清病毒-中和 抗体的效价以及PRRS病毒-特异性干扰素(IFN)γ-分泌细胞(SC)的 频率。

为了测量由疫苗材料诱导的保护性免疫的水平，组1-3中的动物是在 免疫后6周通过滴注2ml的强毒PRRS病毒毒株VR2385(每2ml 10⁵TCID₅₀的剂量，每鼻孔给予1ml的等份试样)进行激发。组4中的动物 保持不接种并且不被激发，目的是不仅确定正常肺表观而且确定正常临床 参数。将组3中未感染过PRRS病毒的动物作为激发对照，以确定激发的 严重度。由疫苗所诱发的保护性免疫程度的确立是基于以下因素，包括对 体温和体重变化的测量以及对临床症状例如抑郁和呼吸系统症状的观察。 每天监测这些参数至14天。病毒血症的水平、IFN-γ反应及体重在激发 后0天、4天、7天、10天和14天被确定。在激发后14天，动物被处以 安乐死，肺组织及支气管肺泡灌洗液中的病毒载量被测定。在宏观水平及 微观水平评估肺中的病理变化。

在另一项实验中，从ZMAC生成的生物材料的免疫原性和效力被评 价。将该ZMAC材料与相同的、但培养于MARC-145细胞中的疫苗病毒 比较。为了该目的，本发明人已经进行了PrimePac病毒毒株在ZMAC 细胞中的3次连续传代。该病毒在ZMAC细胞中的第3个传代被用于进 行该生物材料与培养于MARC-145细胞中的PrimePac病毒的比较疫苗接 种研究。培养于ZMAC细胞或MARC-145细胞中的PrimePac疫苗原种 被制备成10⁶TCID₅₀/ml的效价。将猪分组用2ml体积培养于 UIMAC-FBAL-A细胞或MARC-145细胞中的MLV原种以5×10⁴TCID₅₀剂量免疫。

实施例5.猪肺泡巨噬细胞系用于产生PRRS改良活病毒疫苗的用途

引言在1994年中期，第一种PRRS MLV疫苗(Ingelvac PRRS MLV) 面世。自此，使用减毒病毒作为疫苗在北美和欧洲变得很常规。普遍接受 的是，这些试剂可有效地赋予合适水平的同源保护性免疫，同时针对异源 株的激发提供不定水平的保护(Mengeling et al.，1996；Mengeling et al.， 1999)。因此有这样的动机及兴趣，即进一步发展另外的及改良的策略、 疫苗以及与之相关联的方法和工具。

在该研究中，猪肺泡巨噬细胞系(被命名为ZMAC-1)被用于产生 PRRS改良活病毒(MLV)疫苗。同时，将培养于这种猪宿主中的疫苗病 毒的效力与仅在起始该研究前已知支持PRRS病毒的生长的其他细胞系 (即猿猴细胞系MA-104及/或其衍生物MARC-145系)中繁殖的疫苗病 毒比较。

最初，ZMAC-1细胞被发现对MLV疫苗Prime Pac PRRS (Schering-Plough Animal Health)是十分易感的。而且，在该病毒在 ZMAC-1细胞中第3次传代以后，获得的产量与使用MARC-145细胞达 到的产量是相当的。为了评估以ZMAC-1细胞(和MARC-145细胞)培养 的病毒的疫苗潜力，进行了标准的免疫-激发研究。在这种案例中，将6 只8周龄的猪用培养于ZMAC-1细胞或MARC-145细胞中PrimePac疫 苗以等剂量疫苗注射，而另外两个3只动物的组不被兔疫。在4周后，将 所有接种组的及一个未感染过PRRS病毒的组以“非典型PRRS流产风暴 (atypical PRRS abortion storm)”病毒分离株NADC-20激发。该研究的 一个结果是，培养于两个细胞系中的Prime Pac MLV疫苗对于防止已于 7天前暴露于异源病毒的未感染过PRRS病毒的猪的体重减轻是同样有效 的。然而，与培养于MARC-145中的疫苗病毒相比，培养于ZMAC-1细 胞中的疫苗病毒对于分别在激发后7天和10天降低病毒血症的程度及消 除肺中的强毒病毒是显著更有效的。

观察到用于培养PRRS MLV疫苗的细胞系类型可提高由相同疫苗病 毒所激发的抗遗传分化的强毒PRRS病毒的保护性免疫水平，这样的结果 对于抗这种病原体的高效疫苗的开发前景有重要暗示。也就是说，该研究 的结果表明，PRRS MLV病毒疫苗的有效性不仅是如通常认为的由其与 激发病毒的遗传相似性确定，而是还受它是如何产生的影响。本研究结果 的重要意义在于证明了猪细胞可用于生成有效的抗PRRS病毒的MLV疫 苗。

摘要猪肺泡巨噬细胞系(被命名为ZMAC-1)被生成，并且其制造 有效的PRRS改良活病毒(MLV)疫苗的实用性被检测。该细胞系被发 现对于PRRS病毒的感染是100％易感的，这通过在感染20hr后对病毒 蛋白的成功免疫荧光染色证明。而且，基于多步骤生长曲线分析，第一轮 PRRS病毒复制被确定是在感染9hr后完成，并且在感染后19hr的第2 轮复制过程中产生病毒后代。

为了比较在ZMAC-1或猿猴细胞系MARC-145中制备的MLV疫苗 Prime Pac PRRS(Schering-Plough Animal Health)原种的效力，进行了 标准的免疫-激发研究。最初将6只8周龄的猪以等剂量的(10⁴TCID₅₀) 的培养于ZMAC-1细胞或MARC-145细胞中的Prime Pac疫苗通过肌肉 接种，而另外两个3只动物的组不被免疫。在4周后，将所有这些动物及 一个未接种的组以10⁴TCID₅₀的“非典型PRRS流产风暴”病毒分离株 NADC-20激发。虽然未接种动物在强毒病毒激发7天后表现出5±4Ib的 平均体重(BW)降低，但未感染过PRRS病毒的对照在该期间平均增加 了19.7±6Ib。相反，在激发后7天，以培养于ZMAC-1或MARC-145 细胞中的MLV病毒接种的动物分别表现出8.2±5.2和9.3±3.6的平均BW 增加。因此在统计学上，培养于两个细胞系中的Prime Pac MLV疫苗对 于降低因暴露于高毒的PRRS病毒而对猪生长的负面效应是同样有效的。 值得注意的是，对来自PRRS病毒免疫并激发的动物的血清和肺灌洗样品 中的病毒载量分析揭示，培养于ZMAC-1细胞中的疫苗病毒对于降低激 发后7天时的病毒血症的程度以及在激发后10天消除肺的强毒病毒是显 著(P＝0.015)更有效的。观察到用于培养PRRS MLV疫苗的细胞系类型 可提高由该产物所诱发的抗遗传分化的强毒PRRS病毒的保护性免疫水 平，这样的结果对于抗这种病原体的高效疫苗开发有重要暗示。也就是说， 该研究的结果表明，PRRS MLV病毒疫苗的有效性不仅是如通常认为的 由其与激发病毒的遗传相似性确定，而且还受它如何产生的影响。

本研究的目标至少部分地包括，确定(1)减毒PRRS病毒株在猪巨 噬细胞系ZMAC-1中的生长特性；以及(2)在猪巨噬细胞系ZMAC-1 中产生的PRRS改良活病毒疫苗的免疫原性及效力。

材料和方法

细胞例如如本文进一步描述的，从SPF(无特定病原体)母猪的58 日龄猪胎的肺灌洗液选择猪肺泡巨噬细胞。将该细胞培养于RPMI-1640 的培养基中，该培养基补充有10％胎牛血清、丙酮酸钠及非必需氨基酸， 并在37℃下保持于5％CO₂的空气中。被命名为ZMAC-1的细胞系在 2006年5月被建立，并且自此被连续地培养。代表不同时间分出的这种 细胞系的原种已经被冰冻保藏。

病毒将MLV疫苗Prime Pac PRRS(Schering-Plough Animal Health)在ZMAC-1细胞中连续传代3次。虽然在最初两次传代后效价 仅为10⁴TCID₅₀/ml，但该病毒在第3次传代中明显已经适应，因为效价 增加至10^6.25TCID₅₀/ml。因此将该后代用于接种。Prime Pac疫苗的原种 也如前述方法(Osorio et al.，2006)在MARC-145细胞中制备，达到10⁶TCID₅₀/ml的效价。将“非典型PRRS流产风暴”病毒分离株NADC-20 (Harms et al.，2001)在ZMAC-1细胞中培养，其呈现出10^7.6TCID₅₀/ml 的最大效价。

接种和激发研究：在伊利诺伊大学的生物防护设施(Biocontainment Facility)中，将18只8周龄SPF猪(无所有主要猪病原体，包括PRRS 病毒、支原体及环状病毒)随机地分配至一个套间的6个隔离隔间内(每 隔间3只)。将来自4个隔间的动物在臀部区域用包含5×10⁴TCID₅₀的 培养于ZMAC-1细胞或MARC-145细胞中的Prime Pac病毒的2ml溶液 注射一次，每种疫苗制剂对应共2个隔间(共6只猪)。其他2个隔间中 剩余的6只猪不被免疫，作为未接种的对照。在接种后4周，将所有免疫 的动物以及处于一个隔间中的3只对照猪以10⁴TCID₅₀的PRRS病毒株 NADC-20激发。未接种的及激发的动物被用作确立NADC-20PRRS病毒 的感染严重度，剩余隔间中未感染过PRRS病毒的猪被用于提供正常的生 长和健康临床参数。由该疫苗诱发的保护性免疫的程度是基于对体重 (BW)变化的比较以及抑郁和呼吸系统症状的出现来确定的。在激发后 每天监测这些参数至10天。在激发后0天、4天、7天和10天，通过测 量MARC-145细胞中的传染单元确定病毒血症水平。在激发后10天，将 动物处以安乐死，并使用实时PCR及以前述的病毒学方法(Zuckermann et al.，2007)确定支气管肺泡灌洗(BAL)液中的病毒载量。

统计分析。将方差分析用于确定各猪组之间体重增加的显著差异。利 用Stat View软件(SAS)通过费舍最小显著性差异(Fisher′s least significant difference)方法比较组平均值。为了使激发时动物之间的BW 重量差异效应最小化，数据被计算为激发时及7天后动物的BW之间的 差异。

结果

目标1确定减毒PRRS病毒株在猪巨噬细胞系ZMAC-1中的生长特 性。该目标是为了确定ZMAC-1细胞系的稳健性，以及其对PRRS病毒 感染的易感性。另外，本发明人试图确定减毒PRRS病毒在ZMAC-1细 胞中生长的最佳条件，并且试图证明在该细胞系中制备的MLV疫苗原种 可能被用于商业目的。

对猪肺泡巨噬细胞系ZMAC-1的表征。ZMAC-1巨噬细胞系已经表 现出了十分强劲的生长模式，具有约72小时的倍增时间(图B1；这对应 于图4A)。本发明人已经能够调整这些细胞，以将其培养于75cm²烧瓶 中并将这种类型的细胞培养物保持连续生产达至少15个月。迄今为止， 本发明人已经从最初的数千个的群开始生成了超过10亿个细胞。为了保 证这种有价值的细胞的永久保存，已经制备了超过100份冷冻的细胞原 种。每一批具有至少10个管，每管包含至少2-3百万个细胞。在融化每 批的代表性管时，本发明人已经确定这些管具有＞90％活细胞，所述活细 胞在从新起始它们的培养后4天内呈现出旺盛生长。通过群中的细胞与单 克隆抗体K252.1E4的100％反应性，这些细胞被确定是来自猪的，所述 K252.1E4对猪CD45是特异的(Schnitzlein and Zuckermann，1998； Zuckermann et al.，2001)。另外，ZMAC-1细胞表达以下细胞表面标记物： CD14、CD163、CD172、II类MHC，它们的存在是巨噬细胞的特征(图 2)。

图B1(对应于图4A).ZMAC-1细胞系的生长动力学。将在包含2-3.2 ×10⁵细胞/ml培养基的75cm²烧瓶中确立的ZMAC-1细胞的培养物与等 体积的新鲜培养基合并，以得到1-1.6×10⁵细胞/ml的细胞密度。在新鲜 培养基被送递至培养烧瓶后的第0天、3天和6天时计数细胞。

PRRS病毒在ZMAC-1细胞中的生长。ZMAC-1细胞系对PRRS病 毒的感染是100％易感的，这可通过在感染后20hr时对病毒蛋白的成功 免疫荧光染色证明(图B2；对应于图5A)。而且，本发明人已经确定， 第一轮PRRS病毒复制是在感染后9hr时完成(数据未显示)，并且在感 染后19hr时第2轮复制过程中达到病毒后代的峰产量(图B3；对应于 图4B)。

图B2(对应于图5A).PRRS病毒核壳蛋白在ZMAC-1细胞中的表 达。在以1MOI的PRRS病毒株NADC-20感染后20hr时，将细胞固定 并以FITC-标记的抗PRRS病毒核壳的mAb SDOW17染色。

图B3(对应于图4B).PRRS病毒在ZMAC-1细胞中的多步骤生长 曲线。将1×10⁶/ml的ZMAC-1细胞悬液以0.02 MOI的减毒PRRS病毒 分离株Prime Pac感染。在37℃下孵育1hr后，通过离心将接种物取出， 将细胞以1×10⁶/ml的浓度悬浮于培养基中。在感染后的指定时间将0.1ml 的等分试样取出，并且用于确定传染性病毒的存在(MARC-145细胞中 的TCID₅₀)。

目标2确定猪巨噬细胞系ZMAC-1中产生的PRRS改良活病毒疫苗 的免疫原性及效力。该目标是比较由在ZMAC-1细胞系或在MARC-145 细胞中产生的相同PRRS MLV疫苗(在该案例中为Prime Pac PRRS病 毒)诱发的保护性免疫的水平。

为了测试在ZMAC-1细胞或MARC-145细胞中制备的Prime Pac PRRS病毒疫苗的效力，将猪分组以来自两个细胞系之一的疫苗病毒免 疫，或者进行模拟处理。在免疫4周后进行激发时，本研究中所有18只 猪的平均体重(BW)为117±8.6lb。由于在接种动物和未接种动物的平 均BW之间没有出现显著差异，所以在ZMAC-1细胞或MARC-145细胞 中繁殖的MLV接种对动物生长没有明显的影响。相比之下，在以强毒 NADC-20分离株激发7天后，未接种猪具有的平均-5±4Ib的BW减轻， 而未激发的动物平均增加19.7±6Ib(图6)。之前已接受在ZMAC-1细胞 或MARC-145细胞中制备的MLV病毒疫苗的组分别出现8.2±5.2lb和 9.3±3.6Ib的增加，它们之间无显著差异。因此，与用于繁殖病毒的细胞 类型无关，Prime Pac MLV疫苗对于减少由强毒PRRS病毒暴露导致的 对生长的负效应是同样有效的，这被7天前已暴露于异源强毒病毒的未感 染过PRRS病毒猪的BW显著减轻证明。值得注意的是，对来自PRRS 病毒免疫和激发的动物的血清和肺灌洗样品中病毒载量的分析揭示，培养 于ZMAC-1细胞中的疫苗病毒对于降低激发后7天时的病毒血症的程度 (图7)以及在激发后10天消除肺的强毒病毒(图8)是显著(P＝0.015) 更有效的。

图6.在暴露于野生型PRRS病毒后猪的体重变化。就在以野生型 PRRS病毒分离株NADC-20激发之前及在该激发后7天，对未感染过 PRRS病毒的动物(n＝3)和被兔疫的动物(对于每种类型细胞产生的疫 苗n＝6)测量体重。在这些时间点还对未激发的、未感染过PRRS病毒的 动物(n＝3)进行测量。对每组的成员在7天的间隔中的体重变化取平均， 这些值±标准差被显示。星号(^＊)表示该组平均值与激发的、未感染过 PRRS病毒的对照动物是显著不同的(P＜0.01)。两个星号(^＊＊)被用于表 示该组平均值与未激发的、未感染过PRRS病毒的对照动物是显著不同的 (P＜0.01)。

图7.暴露野生型PRRS病毒后猪病毒血症的程度及频率。就在以野 生型PRRS病毒分离株NADC-20激发之前及在该激发后指定天数，从未 感染过PRRS病毒的动物和被免疫的动物收集血清样品。还在这些时间点 对未激发的、未感染过PRRS病毒的动物进行采样。血清中病毒载量的水 平是通过在MARC-145细胞中进行滴定来确定，然后取平均。数据代表 了每组病毒血症的平均水平。紧挨着这些符号的比例表示毒血症猪 (viremic pigs)的数目(分子)和每组中猪的总数(分母)。

图8.暴露于野生型PRRS病毒后猪支气管肺泡灌洗液中的病毒载 量。在以野生型PRRS病毒分离株NADC-20激发后10天时，从未感染 过PRRS病毒的猪和以前免疫过的猪的肺收集支气管肺泡灌洗液。在此时 还从未激发的、未感染过PRRS病毒的动物获取样品。每个动物的BAL 中的病毒载量水平的确定是通过在MARC-145细胞中进行滴定。

讨论

观察到用于培养相同PRRS MLV疫苗株的细胞系可以提高由该产物 所诱发的、抗遗传分化的强毒PRRS病毒的保护性免疫水平，这项发现对 于开发抗该病原体的高效疫苗具有重要意义。也就是说，这项研究的结果 表明，PRRS MLV病毒疫苗的效力不是如通常认为的仅由其与激发病毒 的遗传相似性确定，而且还受它如何产生影响。对于上述发现的一个合理 解释为，通过简单地培养于ZMAC-1细胞中，该疫苗病毒的生物学性质 被以积极的方式改良。结果是，在所述接种的动物中形成了更加有效的保 护性免疫反应。因此，该研究的结果可证明，可以创造一种更有效的抗 PRRS病毒的MLV疫苗。

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实施例6.细胞材料及细胞的生长。

细胞材料被命名为ZMAC-1的细胞被制备并且被按照布达佩斯条约 (Budapest Treaty)的要求保藏于公认的国际保藏授权机构——美国标准 生物品收藏中心(ATCC；10801University Boulevard，Manassas，Virginia， United States of America)。登记号为ATCC专利保藏号PTA-8764的细胞 的特征为源自Sus scrofa(猪)肺组织。根据日期为2007年12月7日的 ATCC保藏证书文件(国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条 约；国际表格；依照第7.3条发布原始保藏的接收以及依照第10.2条发布 存活声明)，专利保藏命名为PTA-8764的培养物接收日期为2007 年11月14日。

细胞生长在本发明的实施方案中，细胞例如ZMAC-1细胞被在体外 培养。通常应用哺乳动物细胞培养的原则。例如，细胞可以在存在抗生素 的情况下培养；艮他霉素可被使用但不是必需的。

细胞的制备如下(培养基：补充有10％胎牛血清、丙酮酸钠(1mM； Mediatech Cellgro，Cat.No.25-000-C1)、非必需氨基酸(1X；Mediatech Cellgro Cat.No.25-025-C1)及艮他霉素(50mcg/ml；Gibco，Cat.No. 15750-060)的RPMI-1640。将细胞保持在每ml约1-5×10e5个细胞的 细胞浓度。这些细胞一般悬浮生长。可以形成松散粘附细胞的不连续菌落， 但大多数细胞将悬浮生长。正常的培养物将产生漂浮的细胞簇。为了降低 粘附，优选类型的培养烧瓶为具有PE通气帽的用于悬浮细胞的Sarstedt Tissue Culture Flask(Cat.No.83.1813.502)。可以每4-5天对建立的烧瓶 进行收获，取出2/3的液体并添加新鲜培养基。通过在T25烧瓶中20ml 体积中添加至少3百万-6百万个细胞(最低1.5×10e5个细胞/ml)建立 新的烧瓶。可以通过添加2-10ng/ml的巨噬细胞集落刺激因子(小鼠； Sigma-Aldrich Product No.M9170)加强生长。细胞冷冻可以通过将等体 积的每ml中4百万-8百万个细胞的冰预冷细胞悬液与冰预冷的冰冻培养 基(90％血清，10％DMSO)混合来实现。将冷冻的冷冻管中充满悬浮 于冷冻培养基中的细胞，在处理过程中保持在冰冷却的温度下。

图9显示了ZMAC-1细胞在存在生长因子的情况下的生长。在无外 源生长因子或者存在所标定浓度巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)或粒细 胞-巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)的情况下，将每ml 1.2×10⁵个细 胞的ZMAC-1细胞培养8天。在培养的第4天和第8天借助血球计数器 确定细胞浓度。y-轴表示细胞/ml(×10⁵)。

在一个实施方案中，本发明的细胞以命名为ZMAC-1的细胞或者美 国标准生物品收藏中心指定为ATCC专利保藏编号PTA-8764的保藏物或 其衍生物为代表。

实施例7.细胞材料的生成及从胎猪样品分离的方法

又一些组合物和方法被开发。在一项独立的尝试中，材料源自于伊利 诺伊大学兽医研究农场的猪群(标识为母猪编号5850)的妊娠60天的母 猪。在安乐死之后，将子宫无菌地从腹腔中取出，并转移至细胞培养实验 室。操作通常是在生物安全的橱柜内于无菌条件下进行。从子宫中无菌地 收获6只胎儿，并置于塑料培养皿中。将肺器官与心脏、食管和其他膜分 开，保持气管完整且连接于肺上。以无菌的Hank′s平衡盐溶液(HBSS) 彻底地冲洗肺的外部，以去除任何可见的血液及其他污染的剩余组织。通 过将肺置于干净且无菌的培养皿中并以10ml无菌HBSS充填气道，通过 支气管肺泡灌洗分别从6只胎儿中每只的肺气道中分离细胞。借助10cc 的注射器和插入通过气管内腔的1英寸18g针头，将10ml的HBSS推入 肺中。将液体轻轻地推注通过气管，与之同时以镊子压住它，以阻止HBSS 倒流，导致肺明显地被液体充胀。然后，通过简单地放松对气管的按压， 使包含肺灌洗细胞的液体从肺中自排出。将在培养皿中收集的细胞悬浮物 转移至无菌的15ml锥形塑料管中，并以3-4ml的温Ficoll-Hypaque 1077 铺在下面。之后立即将细胞悬浮物经等密度离心纯化(室温下400g 30分 钟)。

在一个实施方案中，在分离当天或者在以后的时间例如1周、2周或 3周后，使用Ficoll-Hypaque 1077通过等密度离心将细胞纯化。应了解， 这种纯化步骤可能有利于除去某些组分例如红细胞及可能存在于原始制 品中的其他材料。收获离心后在Ficoll-Hypaque 1077和培养基之间的界 面处获得的细胞带，以HBSS洗涤2次并且每次均通过离心回收细胞。在 第二次离心后，将来自每只胎儿肺灌洗液的回收细胞沉淀悬浮于培养基 中：补充有10％胎牛血清、丙酮酸钠(1mM；Mediatech Cellgro，Cat.No. 25-000-C1)、非必需氨基酸(1X；Mediatech Cellgro Cat.No.25-025-C1) 的RPMI-1640，并独立地置于6-孔板(Sarstedt)的一个孔中用于进行悬 浮培养。将每个孔以1-6进行标记，以独立地标识从6只胎儿的每一只中 纯化的细胞。虽然在该次尝试中，在等密度离心步骤之后仅回收到很少量 且很小的细胞(＜100)，但是在初始培养物建立后14天内，在每个孔中都 出现了显著的生长。由于从胎儿肺中收获的巨噬细胞祖细胞明显非常小并 且能够具有超过1.077的密度(因此在等密度离心过程中通过高密度介质 至管底)，在胎儿#1的案例中，在等密度离心后获得的红细胞沉淀也被收 获，被置于培养物中并标记为P1。在该案例中，虽然在培养起始时的主 要细胞类型包括红细胞，但是出现了少量很小的单核细胞。在培养起始后 16天和24天时，来自胎儿#4的肺灌洗液的细胞表现出了显著的生长，足 以传代至6孔板的新孔中。来自该培养物中的细胞被命名为 ZMAC1107-4。类似地，在培养起始后36天时，来自红细胞沉淀的标记 为P1的孔中的生长是明显的，并且也被传代至2个孔中。来自该培养物 中的细胞被命名为ZMAC1107-P1。细胞生长明显存在细胞簇，每簇包含 2、4、8、16或更多细胞。

在ZMAC1107-4培养起始后37天时，向二个孔之一的该细胞系的培 养基中补充10ng/ml的巨噬细胞集落刺激因子(小鼠；Sigma-Aldrich Product No.M9170)。在7天后明显的是，在该培养的早期阶段， ZMAC1107-4细胞的生长已经因外源的生长因子补充而得到显著促进，此 后向所有培养物的培养基补充5-10ng/ml的MCSF。通过吸出半体积的细 胞培养物并将其替换为补充生长因子的新鲜培养基，每4-6天向培养物进 料。ZMAC 1107-4系和ZMAC 1107-P1系都强劲生长的证据是这样的细 胞集落的形成，即该细胞集落悬浮生长并松散地粘附于培养物表面。

在另一项独立的尝试中，又一些组合物和方法被开发。妊娠54天的 被标识为编号9093的母猪获自伊利诺伊大学兽医研究农场的猪群。在安 乐死之后，将子宫无菌地从腹腔中取出，并转移至细胞培养实验室。从此 刻开始的所有操作均在生物安全的橱柜内于无菌条件下进行。从子宫中无 菌地收获8只胎儿，并置于塑料培养皿中，并且将它们的肺和与心脏、食 管和其他膜分开，保持气管完整且连接于肺上。以HBSS彻底地冲洗肺的 外部，以去除任何可见的血液及其他污染的剩余组织。通过将肺置于干净 且无菌的培养皿中并以10ml无菌的Hank′s平衡盐溶液(HBSS)充填气 道，通过支气管肺泡灌洗分别从8只胎儿中的每只的肺气道中分离细胞。 借助10cc的注射器和插入通过气管内腔的1英寸18g针头，将10ml的 HBSS推入肺中。将液体轻轻地推注通过气管，与之同时以镊子压住它， 以阻止HBSS倒流，导致肺明显地被液体充胀。然后，通过简单地放松对 气管的按压，使包含肺灌洗细胞的液体从肺中自排出。在一些案例中，以 剪刀平端轻轻地将肺压下以协助剩余灌洗液的排出。将在培养皿中收集的 细胞悬浮物转移至无菌的15ml锥形塑料管中，并在台式临床离心机中以 1,500RPM离心10分钟。将来自每个胎儿肺灌洗液的回收细胞沉淀悬浮 于培养基中：补充有10％胎牛血清、丙酮酸钠(1mM；Mediatech Cellgro， Cat.No.25-000-C1)、非必需氨基酸(1X；Mediatech Cellgro Cat.No. 25-025-C1)的RPMI-1640，并独立地置于6-孔板(Sarstedt)的一个孔 中用于进行悬浮培养。将每个孔以1-8进行标记，以独立地标识从8只胎 儿的每一只中纯化的细胞。最初将来自每个胎儿肺灌洗液的大约10,000 个细胞置于培养物中。这些培养物的生长到第5天时显现。大块细胞出现 于来自胎儿#1、3、6、7和8的培养物中。

在培养起始后12天时，通过轻轻地吸入从所有8只胎儿肺灌洗细胞 培养物收获非粘附及松散粘附的细胞，并使用Ficoll-Hypaque 1077通过 等密度离心进行纯化。这一点的实现是通过，将细胞悬浮物转移至无菌的 15ml锥形塑料管中，所述锥形塑料管以3-4ml的温Ficoll-Hypaque 1077 铺在下面，然后在室温下400g离心30分钟。收获离心后在Ficoll-Hypaque 1077和培养基之间的界面处获得的细胞带，以HBSS洗涤2次并且每次 均通过离心回收细胞。在第二次离心后，将来自每只个体胎儿肺灌洗培养 物的回收细胞沉淀悬浮于3ml的培养基中：补充有10％胎牛血清、丙酮 酸钠(1mM；Mediatech Cellgro，Cat.No.25-000-C1)、非必需氨基酸(1X； Mediatech Cellgro Cat.No.25-025-C1)的RPMI-1640，并独立地置于6- 孔板(Sarstedt)的一个孔中以用于进行悬浮培养，并标记1-8，这直接对 应于培养物的原始标记。在5天后向所有细胞培养物进料2cc的新鲜培养 基。在9天后，悬浮细胞以及粘附细胞的显著生长出现于来自标记为3和 6的胎儿肺灌洗细胞培养物的培养物中，这表现为悬浮液中生长有显著数 量的巨噬细胞集落以及松散粘附的圆形巨噬细胞。出现了许多较大的球形 合体细胞，它们被较小的巨噬细胞包围形成一种表现为细胞冠(cellular crown)的结构。在培养开始后26天时，向该细胞培养物中进料补充5 ng/ml的MCSF(小鼠；Sigma-Aldrich Product No.M9170)的新鲜培养 基。在5天后，悬浮液中生长的巨噬细胞集落以及松散粘附于培养皿表面 的巨噬细胞集落的旺盛生长出现于源自胎儿#3、#6和#8的培养物中。这 些系分别被命名为ZMAC1207-3、ZMAC1207-6和ZMAC1207-8，并且 通过转移至T75烧瓶的补充有5-10ng/ml的MCSF培养基中在数天后被 扩大。

关于通过引用的方式纳入及变化方案的声明

本申请通篇所提到的所有参考文献，例如包括公开或授权的专利或同 等物的专利文献、专利申请公布文本、未公布的专利申请和非专利文献或 其他来源的资料，全部内容都通过引证的方式纳入本文，如它们被通过引 证的方式逐一纳入本文一样。假如引用的文献和本申请公开内容之间存在 任何不一致，则以本文公开内容为准。本文所提供的某些参考文献通过引 证的方式被纳入本文以提供信息，例如关于本发明的起始原料来源、其他 起始原料、其他试剂、其他合成方法、其他分析方法、其他生物材料、其 他细胞和其他用途的详细资料。

本文提到的所有专利和公布文本代表了本发明所属领域的技术人员 的技术水平。本文引用的参考文献可显示出到它们的公布日或提交日为止 的现有技术状态，而且如果需要，本文可意欲使用这一信息以排除处于现 有技术中的具体实施方案。例如，当本发明要求保护物质的组合物时，应 理解在本申请人的发明之前本领域已知的和可得到的化合物，包括本文引 用的文献中充分公开的化合物，不意欲包括在本发明要求保护的物质的组 合物中。

本文的任何附录都通过引证的方式作为说明书和/或附图的一部 分纳入本文。

本文中使用的词语“包括”、“包含”、“包含有”或“含有”应被理 解为说明存在所提到的特征、整体、步骤或组分，但不排除一种或多种其 他特征、整体、步骤、组分或其组合的存在或加入。因此本文所用的包括 是包含、含有、具有或特征为的同义词，而且是包含性的或开放式的。本 文所用的“由......组成”不包括权利要求的描述中未说明的任何元素、步 骤或成分等。本文所用的“主要由...组成”不排除对权利要求的基本特性 和新特性(如涉及活性成分)不会产生实质性影响的物质或步骤。在本文 的每种情况下，词语“包括”、“主要由...组成”和“由...组成”中的任一 个均可被其他两个词语中的任一个替换，从而公开了不同的不必同延的实 施方案和/或范围。在适当的情况下，本文中示例性描述的本发明可在缺 少本文未具体公开的任何一个或多个元素或者一个或多个限制的情况下 实施。

只要本文公开一个范围，如温度范围、时间范围、组分或浓度范围， 或者其他值的范围等，则该公开中意欲包括所有的居间范围和子范围以及 指定范围内的所有单个值。本发明不受限于所公开的实施方案，包括任何 在附图中显示或在说明书中示例的实施方案；那些所公开的实施方案以实 例或例证的方式给出，而且没有限制作用。应理解本发明说明书中所包括 的范围或子范围内的任何子范围或单个值均可被排除在本发明权利要求 之外。

已经根据多种具体的和/或优选的实施方案和技术对本发明进行描 述。但是，应理解只要保持在本发明的精神和范围之内，许多变化和修改 也是允许的。对本领域普通技术人员而言将会清楚的是，除了在本文中具 体指出的以外，还可以采用本文所广泛公开的其他组合物、方法、设备、 设备元件、材料、操作和技术用于实施本发明，而不需借助于过度实验； 除了具体示例性的那些以外，这可以延伸到例如，其他起始原料、生物材 料、试剂、合成方法、纯化方法、分析方法、试验方法和生物学方法。本 发明意欲包括本文前述内容(如组合物、方法、设备、设备元件、材料、 操作和技术等)的所有本领域已知功能等效物。所使用的术语和表达用于 描述而不作为限制，并且这些术语和表达的使用并不意欲排除所显示和描 述的特征或其部分的任何等效物，但是应认识到可在所要求保护的本发明 范围内做多种修改。因此，应理解尽管已通过实施方案、优选实施方案和 任选特征具体公开了本发明，但本领域技术人员可能采取本文所公开概念 的修改和变化；而且这些修改和变化应被认为是处在所附的权利要求书所 限定的本发明范围之内。

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