法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2017-05-10
未缴年费专利权终止 IPC(主分类):C12N15/52 授权公告日:20130703 终止日期:20160320 申请日:20080320
专利权的终止
2013-07-03
授权
授权
2010-04-28
实质审查的生效 IPC(主分类):C12N15/52 申请日:20080320
实质审查的生效
2010-03-10
公开
公开
相关申请的交叉引用
本申请要求2007年3月23日递交的、发明名称为“通过成熟淀粉酶蛋 白的N-末端添加提高淀粉酶产量”的美国临时专利申请系列号No. 60/907,174的优先权。
序列表
包括SEQ ID NO：1-12的序列表并入本文作为参考。
发明领域
本文公开编码具有淀粉酶活性的多肽的核酸，其中所述多肽由芽孢杆 菌属(Bacillus)的α-淀粉酶修饰而来，例如由地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的α-淀粉酶修饰而来。
背景技术
淀粉由直链淀粉(15-30％w/w)和支链淀粉(70-85％w/w)的混合物组 成。直链淀粉由分子量(MW)约60,000至约800,000的α-1，4-连接的葡萄糖 单元的线性链组成。支链淀粉是每24-30个葡萄糖单元含有一个α-1，6分支 点的分支聚合物；其MW可高达1亿。
目前，通过酶催化的方法自淀粉生产浓缩的葡萄糖浆形式的糖，该方 法包括：(1)用α-淀粉酶将固态淀粉液化(或降低粘度)为平均聚合度约7-10 的糊精，和(2)用淀粉葡萄糖苷酶(也称作葡糖淀粉酶或GA)将所得的液化 淀粉(即淀粉水解产物)糖化。所得的浆液具有高葡萄糖含量。多数商品化 生产的葡萄糖浆液随后被酶促异构化为称作异糖浆(isosyrup)的葡萄糖/果 糖混合物。
α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)通过随机切割内部的α-1-4-糖苷键而水解淀粉、 糖原和相关的多糖。此酶在诸如糖业、酿造业、酒业和纺织品工业中具有 多种重要的商业应用。α-淀粉酶可以分离自多种细菌、真菌、植物和动物 源。工业上，许多重要的α-淀粉酶分离自芽孢杆菌属。
多年来，α-淀粉酶已用于多种不同目的，包括淀粉液化、纺织品退浆、 纸业和纸浆业中的淀粉改性以及用于酿造。这些酶也可以用于在餐具洗涤 和衣物洗涤期间去除含淀粉的污渍。
地衣芽孢杆菌及其他芽孢杆菌属物种具有很高的分泌(异源)蛋白质(例 如淀粉酶、蛋白酶等)到生长培养基中的能力。为将这些蛋白质定向到细胞 外部，它们合成为具有氨基末端信号肽的前蛋白质。一般而言，信号肽通 常长18-35个氨基酸，不含严格的共有序列。然而，信号肽确实共有如下 形成的三联结构：(1)带正电荷的氨基末端(N-结构域)和较为极性的区域， (2)接着是疏水核心(H-结构域)，和(3)较为极性的区域，含信号肽切割位点 (C-结构域)。-3和-1位的氨基酸(相对于成熟蛋白质的起点而言)通常是具 有小型中性侧链的残基(如丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸)。在枯草芽孢杆菌(B. subtilis)中，成熟链的1位残基在多数情况下是丙氨酸(Tjalsma，1999， “Signal Peptidases of Bacillus subtilis：A Functional Analysis，”博士论文， University of Groningen，ISBN 90-367-1086-3)。有观察结果表明通过信号 肽酶加工前蛋白质，即切割信号肽，是一些蛋白质生产的分泌瓶颈(Bolhuis， 1999，“A Genetic Analysis of Determinants for Efficient Protein Secretion in Bacillus subtilis，”博士论文，University of Groningen，ISBN 90- 367-1055-3)。
因此，持续需要能够在生物体内以较大的量生产的α-淀粉酶。增加产 量将会降低成本、改善成本边际(cost margins)、节省工厂设备能力及产生 更高活性的产品等。
发明概述
因此，一方面涉及α-淀粉酶变体，其能够以增加的量和较低的成本来 生产。这些变体能够用于使用α-淀粉酶的多种组合物和方法中。
一方面考虑包含SEQ ID NO：1或无信号肽的SEQ ID NO：1中所示基 序的分离的多肽，例如成熟α-淀粉酶或变体。因此，一方面考虑包含SEQ ID NO：20、21或25的SEQ ID NO：1。另一方面考虑包含SEQ ID NO：2 和21两者的SEQ ID NO：1。另一方面考虑包含SEQ ID NO：2(信号肽) 的SEQ ID NO：1。另一方面考虑无信号肽的SEQ ID NO：1，其中所述无 信号肽的SEQ ID NO：1包含SEQ ID NO：9、10、11、12、20、21、22、 24、25或27。另一方面考虑包含SEQ ID NO：13、14、15、16、17、18、 19、23、26或28的SEQ ID NO：1。因此，所考虑的多肽序列可以具有信 号肽，为前蛋白质的形式，或作为成熟蛋白质。前蛋白质可以包含来自生 产α-淀粉酶的相同物种的信号肽，或者可以与成熟蛋白质异源(即，其中 信号肽与成熟蛋白质来源于不同于的微生物)。
另一实施方案考虑编码任何上述分离的多肽序列的核酸序列。
又另一方面提供含有任何编码所述多肽序列的所述核酸序列的载体。
再一方面考虑包含任何前述核酸序列或包含含有任何前述核酸序列的 载体的分离的细胞。所述分离的细胞可以是微生物。所述微生物可以是细 菌或真菌。示例细菌包括但不限于：选自枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、 迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、短芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B. stearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(B. amyloliquefaciens)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、环状芽孢杆菌(B. circulans)、灿烂芽孢杆菌(B.lautus)、苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)、 变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)或鼠灰链霉菌(S.murinus)的革兰氏阳 性菌；或革兰氏阴性菌，其中所述革兰氏阴性菌为大肠杆菌(Escherichia coli)。
还考虑上述多肽在用于洗涤(在手洗或机洗制剂中)、餐具洗涤(在手洗 或机洗制剂中)、纺织品退浆、水解生物膜、糖化淀粉、液化淀粉或自甘蔗 糖加工淀粉的组合物中的用途。
另一方面考虑包含任何上述多肽的洗涤剂添加剂，其中所述洗涤剂添 加剂任选地为无粉尘颗粒、稳定的液体或受保护的酶的形式。所述洗涤剂 添加剂可以进一步包含纤维素酶、蛋白酶或淀粉酶或其组合。所述淀粉酶 可以是α-淀粉酶、β-淀粉酶或葡糖淀粉酶或其组合。
又再一方面考虑包含任何上述多肽的洗涤剂组合物。可选地，所述洗 涤剂组合物可以包含上述洗涤剂添加剂。所述洗涤剂组合物可以进一步包 含酶，其中所述酶是蛋白酶、脂肪酶、过氧化物酶、淀粉酶、纤维素酶、 甘露聚糖酶、果胶酸裂合酶或所述酶的组合。
另一方面考虑包含任何上述多肽的手工或自动餐具洗涤剂组合物。所 述手工或自动餐具洗涤剂可以进一步包含酶，其中所述酶为蛋白酶、脂肪 酶、过氧化物酶、淀粉酶、纤维素酶、甘露聚糖酶、果胶酸裂合酶或所述 酶的组合。
又另一实施方案考虑包含任何上述多肽的手工或自动洗衣洗涤组合 物。考虑所述手工或自动洗衣洗涤组合物可以进一步包含酶，其中所述酶 为蛋白酶、脂肪酶、过氧化物酶、淀粉酶、纤维素酶、甘露聚糖酶、果胶 酸裂合酶或所述酶的组合。
另一实施方案考虑于水性溶液中包含任何上述多肽且任选地包含酶的 退浆组合物。
另一方面考虑于水性溶液中包含任何上述多肽的淀粉加工组合物。所 述淀粉加工组合物可以进一步包含葡糖淀粉酶、异淀粉酶、普鲁兰酶 (pullulanase)或其组合。所述淀粉加工组合物可以用于加工淀粉的方法， 包括施用所述组合物足以液化所述淀粉、或糖化所述淀粉、或既液化又糖 化所述淀粉的一段时间。
又再一方面提供包含任何上述多肽的生物膜水解组合物，其中所述组 合物处于溶液或凝胶中，且任选地进一步包含纤维素酶、半纤维素酶、木 聚糖酶、脂肪酶、蛋白酶、果胶酶、抗微生物剂或其组合。还考虑水解生 物膜的方法，包括施用所述组合物足以部分或全部水解所述生物膜的一段 时间。
附图简述
附图并入本说明书中并构成其一部分，用于举例说明实施方案。其中：
图1比较两个批次的A1T和FRED在地衣芽孢杆菌中的 生产能力。
图2A为pICatH-FREDori 1的示意图。图2B为 pICatH-FRED(A1T)ori1的示意图。
图3显示表达A1T α-淀粉酶变体(底部)的枯草芽孢杆菌菌株相对于表 达FRED(FRED)α-淀粉酶的菌株在消化直链淀粉方面的HI琼 脂试验的结果。在A1T变体中直链淀粉的消化看起来提高了。
图4图示了当在pH 5.8进行测定时FRED与A1T变体相 比的DE进程。
图5图示了在pH 5.8不加钙时FRED与A1T变体相比的 DE进程。
图6.在pH 5.4不加钙时FRED(野生型)与A1T变体的比 较。
发明详述
本申请涉及通过修饰成熟α-淀粉酶的多肽序列来提高芽孢杆菌属物 种(Bacillus sp.)α-淀粉酶的量的方法。可选地，所述方法可用于任何野生 型或重组芽孢杆菌属物种α-淀粉酶。以下提供了关于这如何能够实现的细 节，以及由此产生的α-淀粉酶变体的组合物和用途。
1.定义和缩写
在此发明详述中，应用下面的缩写和定义。必须注意，如本文所使用， 除非上下文另有明确指明，否则单数形式“一”、“一个”和“该”涵盖对复数 形式的提及。因此，例如，提及“一种酶”包括多种此类酶，而提及“该制剂” 包括一种或多种制剂以及本领域技术人员已知的其等同制剂，等等。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本领域普通 技术人员通常所理解的含义。下面提供如下的术语。
1.1定义
术语“淀粉酶”旨在包括任何淀粉酶，例如葡糖淀粉酶、α-淀粉酶、β- 淀粉酶、芽孢杆菌属物种如地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的野生型α-淀粉 酶。示例生产菌株有用于KLM3’蛋白、谷物加工用淀粉酶(SGA)以及织物 和家居清洁用淀粉酶的菌株。“淀粉酶”应指这样的酶，其能够催化淀粉的 降解等。淀粉酶是切割淀粉中α-D-(1→4)O-糖苷键的水解酶。通常，将α- 淀粉酶(EC 3.2.1.1；α-D-(l→4)-葡聚糖葡聚糖水解酶)定义为以随机方式切 割淀粉分子内α-D-(1→4)O-糖苷键的内切酶。与此不同，外切淀粉水解酶 如β-淀粉酶(EC 3.2.1.2；α-D-(1→4)-葡聚糖麦芽糖水解酶)和一些产物特异 性淀粉酶如产麦芽糖(maltogenic)α-淀粉酶(EC 3.2.1.133)从底物的非还原 末端开始切割淀粉分子。β-淀粉酶、α-葡糖苷酶(EC 3.2.1.20；α-D-葡糖苷葡 糖水解酶)、葡糖淀粉酶(EC 3.2.1.3；α-D-(1→4)-葡聚糖葡糖水解酶)，以及 产物特异性淀粉酶可以从淀粉产生特定长度的低聚麦芽糖。
“α-淀粉酶变体”、“α-淀粉酶变体多肽”和“变体酶”指已经通过替代成 熟α-淀粉酶蛋白氨基末端的氨基酸残基而修饰的α-淀粉酶蛋白。如本文所 使用，“亲本酶”、“亲本序列”、“亲本多肽”、“野生型α-淀粉酶蛋白”和“(复 数形式的)亲本多肽”应指α-淀粉酶变体多肽所衍生自的酶和多肽。亲本酶 可以是野生型酶或者是之前已经被重组改造过的α-淀粉酶。α-淀粉酶变体 还可以在α-淀粉酶亲本多肽的信号序列中或在α-淀粉酶亲本多肽的别处 包括突变。因此，α-淀粉酶多肽可以是重组改造后的酶。
α-淀粉酶变体也可以是含有相对于地衣芽孢杆菌或SEQ ID NO：1序 列而言非内源的多肽序列的融合蛋白或“杂合蛋白”或“嵌合蛋白”。在一个 实施方案中，所述多肽序列有助于纯化所表达的蛋白质。另一方面，所述 异源序列为来源于不同于地衣芽孢杆菌的属或种的α-淀粉酶多肽。例如， α-淀粉酶变体可以包含与另一芽孢杆菌α-淀粉酶(例如但不限于嗜热脂肪 芽孢杆菌)的信号肽相连的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶变体。可选地，α-淀粉酶 蛋白可以包含与另一芽孢杆菌α-淀粉酶的成熟蛋白质相连的地衣芽孢杆 菌(LAT)信号肽，其中所述融合蛋白还具有发生在成熟蛋白质X2残基处的 提高酶产量的突变。这些可以包括在X2处用除丙氨酸或缬氨酸残基之外的 任何氨基酸取代。在X2位除取代丙氨酸的残基之外还可以具有额外氨基 酸。术语“变体”可与术语“突变体”互换使用。变体应包括多肽以及核酸。 变体应包括插入；这些变体还可以在一个或多个位置上含有其它的替代、 插入、颠换、截短和/或倒位。变体可以包括与能够同本文所示核苷酸序列 杂交的序列相互补的序列。例如，变体序列可以与能够在严紧条件(例如 50℃和0.2X SSC{1X SSC＝0.15M NaCl，0.015M柠檬酸三钠，pH 7.0}) 下同本文所示核苷酸序列杂交的序列互补。术语变体涵盖与能够在高严紧 条件(例如65℃和0.1XSSC{1XSSC＝0.15M NaCl，0.015M柠檬酸三钠， pH 7.0})下同本文所示核苷酸序列杂交的序列相互补的序列。变体可以包 含1、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、60或70(或是其间的任何 整数)个氨基酸取代、缺失或插入，只要变体保留α-淀粉酶活性即可。变 体的表面电荷也可以进行任何数目的改变。例如，酶表面带正电荷的氨基 酸残基的数目可以减少1、2、3、4、5、6、7或8个。预期这样的氨基酸 取代会改变变体的等电点(pI)等等。如本文所述的那样，变体的其他特性 可以有别于野生型酶。
“分离的”指序列至少基本上不含有与该序列天然相伴且天然存在的至 少一种其它组分。
“纯化的”指物质处于相对纯的状态，例如至少约90％纯的，或至少约 95％纯的，或至少约98％纯的。
“热稳定的”指酶在暴露于升高的温度后保留活性的能力。可以以酶的 半衰期来测量酶如α-淀粉酶的热稳定性。半衰期(t1/2)是在规定的条件下丧 失一半酶活性的时间(以分钟、小时或天计)。通过测量残留淀粉酶活性来 计算半衰期值。
“pH范围”指酶在酸性到碱性条件(跨越5个或更多个pH单位)下呈现 催化活性的能力。
如本文所使用，“pH稳定的”指酶在广的pH范围内保留活性的能力。
如本文所使用，“食品”应当既包括准备好的食品，又包括食品配料， 如面粉。
如本文所使用，“食品配料”应当包括添加到或能够添加到功能食品或 食料中的制剂，并且包括在广泛种类的需要例如酸化或乳化的产品中以低 水平使用的制剂。食品配料可以为溶液的形式或作为固体，这取决于用途 和/或应用模式和/或施用模式。
如本文所使用，“功能食品”指不仅能够提供营养功效和/或味觉满足， 而且能够为消费者提供其它有益功效的食品。
如本文所使用，“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白质”同义。 一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“肽”同义。一些情况下，术语“氨基 酸序列”与术语“酶”同义。
如本文所使用，“核苷酸序列”或“核酸序列”指寡核苷酸序列或多核苷 酸序列，及其变体、同源物、片段和衍生物(例如其部分)。核苷酸序列可 以是基因组的或合成的或重组的来源，并且可以是双链或单链(代表正义或 反义链)。如本文所使用，术语核苷酸序列包括基因组DNA、cDNA、合成 的DNA和RNA。DNA包括编码α-淀粉酶变体多肽的cDNA序列。
“同源物”和“同源”应指与主题氨基酸序列和主题核苷酸序列具有一定 程度同一性的实体。同源序列旨在包括与主题序列具有至少75％、80％、 85％或90％同一性、至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基 酸序列。通常，同源物将包括与主题氨基酸序列相同的活性位点。
如本文所使用，“杂交”应包括核酸链通过碱基配对与互补链结合的过 程，以及如在聚合酶链式反应(PCR)技术中进行的扩增过程。α-淀粉酶变 体核酸可以以单链或双链DNA或RNA、RNA/DNA异源双链体或 RNA/DNA共聚物形式存在。
如本文所使用，“共聚物”指包括核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸两者的 单个核酸链。α-淀粉酶变体核酸甚至可以经密码子优化以进一步增加表达。
如本文所使用，“合成的”应指通过体外化学或酶促合成而产生的。其 包括，但不限于，制备的、对于宿主生物(如甲基营养酵母毕赤酵母 (Pichia)、汉逊酵母(Hansenula)、链霉菌(Streptomyces)、里氏木霉 (Trichoderma reesei)或其他所选表达宿主如芽孢杆菌)而言具有最佳密码 子使用的α-淀粉酶变体核酸。
如本文所使用，“转化的细胞”应包括通过重组DNA技术的应用而已 被转化的细胞。转化通常通过向细胞中插入一种或多种核苷酸序列而发生。 插入的核苷酸序列可以是异源核苷酸序列(即，对于待转化的细胞而言，非 天然的序列，例如编码融合蛋白的序列)。
如本文所使用，“有效连接的”应指所述及的组分之间的关系将允许它 们以它们期望的方式发挥功能。与编码序列有效连接的调控序列将如此连 接，以致所述编码序列能够在与该控制序列相容的条件下获得表达。
如本文所使用，“生物活性的”应指与天然存在序列具有相似的结构功 能(但不必是相同的程度)和/或相似的调控功能(但不必是相同的程度)和/或 相似的生化功能(但不必是相同的程度)的序列。
1.2缩写
除非另有说明，否则适用下面的缩写：
A1T 芽孢杆菌属α-淀粉酶1位(X2)的丙氨酸为苏氨酸所取代
(或A1→T)
AE 醇乙氧基化物
AEO 醇乙氧基化物
AEOS 醇乙氧基硫酸盐
AES 醇乙氧基硫酸盐
AFAU 酸性真菌α-淀粉酶单位
AGU 葡糖淀粉酶活性单位
AOS α-烯烃磺酸盐
AS 醇硫酸盐
BSA 牛血清白蛋白
cDNA 互补DNA
CMC 羧甲基纤维素
DNA 脱氧核糖核酸
DP3 具有3个亚单位的聚合度
DPn 具有n个亚单位的聚合度
DS或ds 干固形物
DTMPA 二乙基三胺五乙酸
EC 酶学委员会
EDTA 乙二胺四乙酸
EO 环氧乙烷
F&HC 织物和家居护理
FAU 真菌淀粉酶单位
GA 葡糖淀粉酶
HFCS 高果糖玉米糖浆
HFSS 高果糖淀粉基糖浆
IPTG 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷
LAS 线性烷基苯磺酸盐
LAT 属于地衣芽孢杆菌淀粉酶
LU Liquiphon单位
MW 分子量
NOBS 壬酰基氧基苯磺酸盐
NTA 次氮基三乙酸
OxAmHPAM 5000L
PCR 聚合酶链式反应
PEG 聚乙二醇
PVA 聚乙烯醇
PVP 聚乙烯吡咯烷酮
RNA 核糖核酸
SAS 仲烷基磺酸盐
TAED 四酰基乙二胺
TCA 三氯乙酸
w/v 重量/体积
w/w 重量/重量
wt 野生型
2.α-淀粉酶变体
淀粉酶变体可创建自任何的芽孢杆菌属淀粉酶，包括野生型形式以及 改造过的形式，后者已为增强的比活、pH曲线、热稳定性和温度范围曲 线、钙离子需求以及其他增进的特性而进行过改造。本文所述的变体具有 提高的生产能力，其中与亲本株的生产相比，有更多的蛋白质可以分泌到 细胞培养基中。
这些变体的基序如下：
NH2-X1-X2-X3-X4-Y-COOH(SEQ ID NO：1)
其中X1为18-35个氨基酸大小的信号肽中最后的氨基酸；其中所述信 号肽在性质上是三联的，具有氨基末端的荷电部分，疏水的H-结构域，和 荷电的羧基结构域；且其中X2域可以来源于相同的亲本α-淀粉酶，或可 以是异源或嵌合蛋白；
X1为信号序列中最后的氨基酸；
X2为A’-B’，其中当X2为丙氨酸时，A’为除丙氨酸或缬氨酸之外的任 何氨基酸，而B’为任何氨基酸或无氨基酸残基；当X2为缬氨酸、组氨酸 或天冬氨酸时，A’为任何氨基酸，而B’为任何氨基酸或无氨基酸残基；
X3为天冬酰胺、丙氨酸、组氨酸或甘氨酸；
X4为亮氨酸、甘氨酸、脯氨酸或天冬酰胺；和
Y为成熟细菌α-淀粉酶或α-淀粉酶变体的剩余部分。一方面，X2具 有A’为苏氨酸，而B’无氨基酸，或者B’为不超过5个残基的任何一个或 多个氨基酸。成熟蛋白可以最初为与来源于另一芽孢杆菌属物种或来源于 与亲本序列相同的物种的信号肽融合的融合蛋白形式。这些可以是野生型 芽孢杆菌属α-淀粉酶或重组α-淀粉酶，如Teramyl样α-淀粉酶，以及美 国专利No.6,979,731；6,338,959；6,638,748；6,440,716；5,989,169；6,022,724； 6,197,565；6,887,986；6,162,628；6,482,622；6,876,932；6,093,562；6,297,038； 6,867,031；5,824531；5,856,164；6,939,703；6,218,164；6,432,689；5,316,691； 5,429,766；6,197,565；6,617,143；6,916,645，6,403,355；6,982,159；7,005,289； 7,041,488；7,045,332；6,001639；6,387,690；6,855,531；5,912,157；6,117,664； 美国公开No.2005176000；2005181493；2005250663；2005261156； 2005261158；2006014265；2006019856；2006051849；2005214920；国际 PCT申请WO 06/002643；WO 94/02597；WO 94/18314；WO 96/23873； WO 97/43424；WO 97/41213；WO 99/19467；WO 95/26397；WO 99/19467； 以及欧洲专利No.1050579；EP 1131418；EP 1226236；EP 1307547；EP 815209；EP 753057；EP 772684；EP 850307和EP 749473中所描述的那 些。也考虑编码各种α-淀粉酶变体的核酸，例如但不限于：芽孢杆菌属物 种A7-7(DSM12368)α-淀粉酶，α-淀粉酶，芽孢杆菌属物种 AA560α-淀粉酶(美国专利No.6,528,298的SEQ ID NO：24)，盐敏芽孢杆 菌(B.halmapalus)α-淀粉酶(美国专利No.6,093,562的SEQ ID NO：2， )，芽孢杆菌物种no.707α-淀粉酶，芽孢杆菌属物种KSM-AP 1378α-淀粉酶(GenBank登录号AX428291和EP 1199356的SEQ ID NO： 3)，芽孢杆菌属物种KSM-K38α-淀粉酶(美国专利No.6,403,355的SEQ ID NO：4)，芽孢杆菌属物种KSM-K36α-淀粉酶(美国专利No.6,403,355的 SEQ ID NO：2；GenBank登录号AAN18957)，克劳氏芽孢杆菌(B.clausii) KSM-K16α-淀粉酶，耐碱芽孢杆菌(B.halodurans)α-淀粉酶，克劳氏芽孢 杆菌BT-21α-淀粉酶(GenBank登录号AX037557)，解淀粉芽孢杆菌α-淀 粉酶，美国专利No.5,856,164的SEQ ID NO：2，α-淀粉酶， 和嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶。
为在地衣芽孢杆菌中分泌蛋白质，常常使用地衣芽孢杆菌α-淀粉酶 (LAT)的信号肽。不过，也可以替换为来自其他芽孢杆菌属α-淀粉酶的信 号蛋白。LAT信号肽的氨基酸序列为： MKQQKRLYARLLTLLFALIFLLPHSAASA(SEQ ID NO：2)。
此信号肽的一个切割位点与上文所述的一般基序匹配： Ala-Ser-Ala/Ala。通过用苏氨酸取代+1位(X2)的丙氨酸，观察到FRED(一种地衣芽孢杆菌α-淀粉酶突变体)的产量/分泌提高20％以上。因 此，由LAT信号肽转运的蛋白质的分泌瓶颈部分通过将切割位点由 Ala-Ser-Ala/Ala改变成Ala-Ser-Ala/Thr而得以克服。因此一方面提供了 X2为除丙氨酸或缬氨酸之外的任何氨基酸的重组蛋白质。例如，X2可以是 苏氨酸。另一方面考虑在位置X2处具有两个氨基酸取代，其中X2为A-B， 其中A为除丙氨酸或缬氨酸之外的任何氨基酸，而B为包括丙氨酸在内的 任何氨基酸。“B”也可以无残基，而“A”为除丙氨酸或缬氨酸之外的任何氨 基酸。例如，位于信号肽和成熟链接合处的序列可以是： Ala-Ser-Ala/Thr-Ala，其中Thr-Ala为在X2处引入的A-B。这种情况下的 切割位点与通过用Thr取代+1位的丙氨酸所获得的切割位点是一样的： Ala-Ser-Ala/Thr。可以考虑向芽孢杆菌属α-淀粉酶(如FRED) 或由LAT信号肽转运的任何其他异源蛋白质的成熟链的N-末端侧添加苏 氨酸残基(或除Ala之外的其他残基)，以导致产量/分泌增加。
2.1α-淀粉酶变体表征
酶变体可以通过核酸和多肽序列、通过其二级、三级和/或四级结构、 和/或通过其比活来表征。α-淀粉酶变体的另外特征包括稳定性、钙离子 (Ca+2)依赖性、pH范围、氧化稳定性和热稳定性。产量提高的α-淀粉酶变 体可以与亲本蛋白质具有基本上相同的特性，例如相同的比活。
一方面，突变(包括为增加蛋白质产量而取代或添加的氨基酸之外的氨 基酸取代和缺失)对于实现改变的稳定性，特别是在尤其高的温度(即 70-120℃)和/或极端pH(即低或高pH，即分别为pH 4.0-6.0或pH 8.0-11.0) 以及低于60ppm的钙浓度(即非结合的，因此处于溶液中)下改善的稳定 性(即更高或更低)，可以很重要。
改变的Ca2+稳定性意味着酶在Ca2+耗竭条件下的稳定性已经得到改 善，即更高或更低的稳定性。重要的突变(除了在成熟蛋白质氨基末端位置 X2处引入的Thr-Ala或A-B)可以是那些实现改变的Ca2+稳定性、特别是 在尤其高pH(即pH 8.0-10.5)下改善的Ca2+稳定性(即更高或更低的稳定性) 的突变。
另一方面，重要的突变(包括氨基酸取代和缺失)涉及获得如下变体， 所述变体，除通过X2突变获得提高的生产能力外，还呈现出，尤其是在 10-60℃、20-50℃和30-40℃的温度下，改变的比活、特别是增加或降低的 比活，用于清洁组合物中。用于烘焙产品的比活温度范围可以更高。
与亲本α-淀粉酶相比，α-淀粉酶变体也可以具有改变的氧化稳定性， 特别是更高的氧化稳定性。增加的氧化稳定性在例如洗涤剂组合物方面有 利，而降低的氧化稳定性可以在淀粉液化用组合物方面有利。
α-淀粉酶变体也可以具有用于热稳定性的突变。这样的α-淀粉酶变体 能够用于烘焙或需要升高温度的其他条件。例如，该α-淀粉酶变体能够在 约55℃至约80℃或更高的温度降解淀粉。该α-淀粉酶变体能够在暴露于 高达约95℃的温度后保留其活性。
本文所述的α-淀粉酶变体多肽也可以具有在约55℃至约95℃或更高 的升高的温度(例如约80℃或更高)使其半衰期相对于亲本酶延长例如 10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％ 或更多的突变。例如，α-淀粉酶变体能够在80℃或更高温度加热约1-10 分钟。
α-淀粉酶变体多肽与其衍生自的亲本序列可以具有相同的多肽稳定 性。然而，预期会提高酶稳定性以及提高酶产量的其它突变可以与本文所 述用于位置X2处的那些突变组合。
因此，编码α-淀粉酶变体多肽的核酸也可以包含除上文所述那些之外 的一种或多种突变。也可以按照需要包括在非X2的一个或多个位置上的其 他突变，如缺失、插入、取代、颠换、转换和倒位，以具有一种或多种上 述特征。同样，由所述核酸编码的多肽也可以缺少至少一种上文所述的取 代。
由所述核酸编码的α-淀粉酶变体多肽可以与亲本序列具有相同的pH 稳定性或者不同。例如，变体还可以具有赋予更大pH稳定性范围、或将 pH范围迁移至对于酶的终端商业目的而言期望的范围的突变。变体可以 在约5.0至约10.5的pH降解淀粉。具体pH条件可以是从pH 5.0到pH 10.5 的任何pH。由所述核酸编码的α-淀粉酶变体多肽与完全相同条件下的亲 本多肽相比时可以具有更长的半衰期或更高的活性(取决于测定法)，或者 可以具有与亲本多肽相同的活性。α-淀粉酶变体多肽与完全相同pH条件 下的其亲本多肽相比时也可以具有约10％、20％、30％、40％、50％、60％、 70％、80％、90％、100％、200％或更长的半衰期。可选地，或另外地， 酶变体与完全相同pH条件下的亲本多肽相比时可以具有更高的活性。
在其他实施方案中，提供了与编码任何本文所述α-淀粉酶变体的核酸 相互补的核酸。另外，还提供了能够与所述互补物杂交的核酸。另一方面， 本文提供了能够与任何上文所述核酸特异性杂交的编码功能等同体的核酸 及其互补物。
在另一实施方案中，用于本文所述方法和组合物的序列为合成序列。 其包括但不限于制备的、对于宿主生物——如甲基营养酵母毕赤酵母和汉 逊酵母--中的表达而言具有最佳密码子使用的序列。
3.α-淀粉酶变体的制备
可以使用通常包括编码适宜的启动子、操纵基因、核糖体结合位点、 翻译起始信号、和任选的阻遏基因或多种激活物基因的控制序列的表达载 体，以酶的形式，表达由本文所述方法或由任何本领域已知的替代方法产 生的编码酶变体的DNA序列。
携带编码α-淀粉酶变体的DNA序列的重组表达载体可以是任何可方 便地进行重组DNA操作的载体，并且载体的选择通常将取决于其待引入 的宿主细胞。因此，载体可以是自主复制载体，即以染色体外实体形式存 在的载体，其复制与染色体复制无关，例如质粒、噬菌体或染色体外元件、 微染色体或人工染色体。或者，载体可以是当被引入到宿主细胞中后整合 到宿主细胞基因组中并与其所整合到的染色体一起复制的载体。该整合的 基因也可以通过使用可扩增构建体来扩增，以在染色体中产生该基因的多 个拷贝，所述可扩增构建体可以由抗生素选择或者其它选择压力(例如必需 调控基因)来驱动，或者可以利用必需代谢途径基因的剂量效应通过互补作 用来驱动。
载体中，该DNA序列应与适宜的启动子序列有效连接。启动子可以 是任何在所选宿主细胞中显示转录活性的DNA序列，并且可源自编码与 宿主细胞同源或异源的蛋白质的基因。可用于指导编码α-淀粉酶变体的 DNA序列转录(尤其在细菌宿主中)的适宜启动子的实例有大肠杆菌lac操 纵子的启动子、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)琼脂糖酶基因dagA 或celA启动子、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)的启动子、嗜热脂肪 芽孢杆菌产麦芽糖淀粉酶基因(amyM)的启动子、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉 酶(amyQ)的启动子、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因的启动子等。对于真 菌宿主中的转录，有用的启动子的实例是源自编码米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白水解 酶、黑曲霉(Aspergillusniger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、 黑曲霉葡糖淀粉酶、米黑根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸 丙糖异构酶或构巢曲霉(A.nidulans)乙酰胺酶的基因的那些启动子。当在诸 如大肠杆菌的细菌物种中表达编码α-淀粉酶变体多肽的基因时，可以例如 从噬菌体启动子(包括T7启动子和λ噬菌体启动子)选择适宜的启动子。适 于在酵母物种中表达的适宜启动子的实例包括但不限于酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)的Gal 1和Gal 10启动子和巴斯德毕赤酵母 (Pichia pastoris)的AOX1或AOX2启动子。对于在里氏木霉中的表达，也 可使用CBHII启动子。表达载体也可包括与编码α-淀粉酶变体的DNA序 列有效连接的适宜转录终止子以及，在真核生物中，多腺苷酸化序列。终 止序列和多腺苷酸化序列可与启动子源自相同的来源。
载体还可包括使载体能够在所讨论的宿主细胞中复制的DNA序列。 此类序列的实例是质粒pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1、 pICatH、pHPLT(Genencor International，Inc.)和pIJ702的复制起点。
载体也可包括选择标记，例如其产物能在宿主细胞中弥补缺陷的基因， 例如来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或者赋予抗生素抗性 (例如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性)的基因。此外，载体 可包括曲霉属(Aspergillus)选择标记，例如amdS、argB、niaD和xxsC， 产生潮霉素抗性的标记，或者可通过诸如本领域已知的共转化实现选择。 参见例如，国际PCT申请WO 91/17243。
虽然细胞内表达或固态发酵在一些方面可能是有益的，例如当使用某 些细菌或真菌作为宿主细胞时，但一般所述变体表达于细胞外且进入培养 基。一般，本文述及的芽孢杆菌属α-淀粉酶包括前蛋白质形式，允许所表 达的蛋白酶分泌到培养基中。如果期望，这种前蛋白质肽可由不同的前肽 或信号序列代替，这可以通过编码相应前蛋白质的DNA序列的替代而方 便地实现。所述前蛋白质典型地被表征为具有三个结构域，即，N-末端结 构域、H-结构域和C-末端结构域，且长度范围在18-35个残基。
表达载体通常包括克隆载体的组分，例如允许载体在所选的宿主生物 中自主复制的元件和一或多个用于选择目的的表型可检测的标记。表达载 体通常包括控制核苷酸序列，例如编码启动子、操纵基因、核糖体结合位 点、翻译起始信号和任选的阻遏基因或者一种或多种激活物基因。通常利 用信号序列将物质靶向至细胞培养基，以易于酶收集和任选地纯化。
用于分别连接编码α-淀粉酶变体的DNA构建体、启动子、终止子和 其他元件，以及用于将它们插入到含有复制所需信息的适宜载体中的方法 是本领域技术人员公知的(参见例如，Sambrook等人，MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，第二版，Cold Spring Harbor， 1989，和第三版2001)。
有益地，将含有DNA构建体或表达载体的分离的细胞用作重组生产α- 淀粉酶变体的宿主细胞。可用编码变体的DNA构建体，方便地通过将该 DNA构建体(以一个或多个拷贝)整合到宿主染色体中，而转化细胞。通常 认为这种整合是有利的，因为DNA序列更可能稳定地维持在细胞中。可 以根据常规方法，例如通过同源或异源重组，实现DNA构建体向宿主染 色体的整合。或者，可以用上述有关不同类型宿主细胞的表达载体转化细 胞。
适宜的细菌宿主生物的实例为革兰氏阳性细菌物种，例如芽孢杆菌科 (Bacillaceae)，包括枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短芽孢 杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、凝结芽胞杆 菌、灿烂芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)和苏云金芽孢杆菌； 链霉菌属物种如鼠灰链霉菌；乳酸细菌物种，包括乳球菌属物种 (Lactococcus spp.)，如乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)；乳杆菌属物种 (Lactobacillus spp.)，包括罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)；明串珠菌属 物种(Leuconostoc spp.)，片球菌属物种(Pediococcus spp.)和链球菌属物种 (Streptococcus spp.)。或者，可以选择属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)(包 括大肠杆菌)或者属于假单胞菌科(Pseudomonadaceae)的革兰氏阴性细菌 物种的菌株作为宿主生物。适宜的酵母宿主生物可以选自生物技术相关酵 母物种，例如但不限于酵母物种，如毕赤酵母属物种、汉逊酵母属物种、 或克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、耶氏酵母属(Yarrowinia)物种，或酵母属 (Saccharomyces)物种，包括酿酒酵母；或属于裂殖酵母属 (Schizosaccharomyces)的物种，如粟酒裂殖酵母(S.pombe)物种。甲基营养 酵母物种巴斯德毕赤酵母的菌株可以用作宿主生物。或者，宿主生物可以 是汉逊酵母属物种。丝状真菌中适宜的宿主生物包括曲霉属物种，例如黑 曲霉、米曲霉、塔宾曲霉(Aspergillus tubigensis)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)或构巢曲霉。或者，镰孢霉属(Fusarium)物种，如尖镰孢(Fusarium oxysporum)或根毛霉属(Rhizomucor)物种，如米黑根毛霉，可以用作宿主 生物。其他适宜的菌株包括嗜热丝孢菌属(Thermomyces)和毛霉属(Mucor) 物种。
考虑的酵母物种包括但不限于酵母属或裂殖酵母属的物种，例如酿酒 酵母。丝状真菌可以有利地属于曲霉属的物种，例如米曲霉或黑曲霉。真 菌细胞可以通过包括原生质体形成、原生质体转化、接着再生细胞壁的方 法以其本身已知的方式进行转化。转化曲霉属宿主细胞的适宜操作包括例 如EP238023中所述的那些。
再又一方面，提供了生产α-淀粉酶变体的方法，包括在有利于变体生 产的条件下培养上述宿主细胞，并从该细胞和/或培养基中回收变体。
用于培养细胞的培养基可以是任何适于生长所讨论宿主细胞和获得 α-淀粉酶变体表达的常规培养基。适宜的培养基和培养基组分可获自商品 供应商或可根据公开的配方(例如按美国典型培养物保藏中心的目录所述) 制备。示例培养基包括但不限于在下文提供的实施例中使用的、用于在三 千升(3,000L)搅拌发酵罐中进行补料分批发酵的那些培养基。所用的培养 基可以是最适合于正在使用的宿主细胞的培养基，例如下文所讨论的用于 培养地衣芽孢杆菌的培养基。该情况下生长培养基可以包括玉米浆固形物 和大豆粉作为有机化合物的来源，连同无机盐作为钠、钾、磷酸、镁和硫 酸的来源，以及微量元素。通常，碳水化合物来源如葡萄糖也是初始培养 基的一部分。一旦培养物自身已经建立并开始生长，则可以如本领域已知 的那样向罐中定量供应碳水化合物，以便维持培养物。定期从发酵罐中取 样，以便利用例如比色测定法来测量酶滴度。根据测量，当酶生产速率停 止增加时，终止发酵过程。
可通过公知的方法从培养基中方便地回收分泌自宿主细胞的α-淀粉 酶变体，包括通过离心或过滤从培养基中分离细胞，通过诸如硫酸铵的盐 沉淀培养基中的蛋白质组分，随后使用诸如离子交换色谱、亲和色谱等的 色谱方法。
通常，载体中的多核苷酸有效连接于能够造成宿主细胞表达该编码序 列的控制序列，即载体是表达载体。可例如通过添加其它转录调控元件而 修饰控制序列，以使得由该控制序列指导的转录的水平更易于响应转录调 控因子。控制序列尤其可包括启动子。
可在允许α-淀粉酶变体蛋白质表达的适宜条件下培养宿主细胞。蛋白 质的表达可以是组成型的，从而它们可以连续生产，或可以是诱导型的， 从而需要刺激来起始表达。在诱导型表达的情况下，可以在需要时通过例 如向培养基中加入诱导物(例如地塞米松或IPTG或Sepharose)来起始蛋白 质生产。也可以在体外无细胞体系(例如TnTTM(Promega)兔网织红细胞体 系)中重组生产多肽。
也可以在有氧条件下，于对宿主适合的培养基中培养表达α-淀粉酶变 体的宿主。可以提供振荡或搅拌及通风的组合，在对于该宿主适合的温度 例如约30℃至约75℃进行生产，这取决于宿主的需要以及生产期望α-淀 粉酶变体的需要。可以培养约12至约100小时或更长(以及其间的任何时 间值)或例如24-72小时。通常，培养物肉汤在约5.5至约8.0的pH，这也 取决于相对于α-淀粉酶变体的生产，宿主细胞所需的培养条件。
4.α-淀粉酶变体的纯化
发酵、分离和浓缩技术是本领域公知的并且可以使用常规方法以制备 浓缩的含有α-淀粉酶变体的溶液。
发酵后，获得发酵肉汤，可以通过常规分离技术除去微生物细胞和各 种悬浮的固形物(包括残留的发酵原料)以便获得淀粉酶溶液。通常使用过 滤、离心、微量过滤、转鼓真空过滤、随后超滤、提取或色谱法等。
为优化回收，浓缩含α-淀粉酶变体的溶液可能是期望的。为收集纯化 的含α-淀粉酶变体的沉淀物，使用未浓缩的溶液需要增加的孵育时间。
可以使用常规浓缩技术将含有α-淀粉酶变体的溶液浓缩为浓缩溶液， 直到获得期望的酶水平。可通过上文讨论的任何技术实现含酶变体溶液的 浓缩。例如可以应用超滤。
可以将酶变体溶液浓缩为浓缩的酶变体溶液，直到所述浓缩的含α-淀 粉酶变体的溶液的酶变体活性大致为约4g/L或更高(例如，25g/L或4-25 g/L之间的任何量)。浓度仅受能够溶解在溶液中的酶量的限制。
用于纯化目的的“沉淀剂”是指有效从浓缩的酶变体溶液中以固体形式 (不管其性质如何，即晶体、无定形或两者混合物)沉淀α-淀粉酶变体的化 合物。
可以使用例如金属卤化物沉淀剂进行沉淀。金属卤化物沉淀剂包括： 碱金属氯化物、碱金属溴化物和这些金属卤化物中两种或更多种的混合物。 金属卤化物可以是氯化钠、氯化钾、溴化钠、溴化钾中的任何一种和可以 是这些金属卤化物中两种或更多种的混合物。例如，可以从氯化钠和氯化 钾中选择金属卤化物。在氯化钠的情况下，其也可以用作防腐剂。
以有效沉淀α-淀粉酶变体的量，使用金属卤化物沉淀剂。在常规试验 后，本领域普通技术人员可以显而易见地至少选择出能够有效地造成酶变 体沉淀的金属卤化物的有效量和最佳量、以及实现最大回收的沉淀条件， 包括孵育时间、pH、温度和α-淀粉酶变体的浓度。
通常，向浓缩的酶变体溶液中加入至少约5％w/v(重量/体积)至约 25％w/v的金属卤化物，且通常是至少8％w/v。通常，向浓缩的酶变体溶 液中加入不超过约25％w/v的金属卤化物，且通常是不超过20％w/v。金 属卤化物沉淀剂的最适浓度将取决于例如具体的α-淀粉酶变体的性质以 及其在浓缩的α-淀粉酶变体溶液中的浓度等。
另一可选的实现酶沉淀的方法是应用有机化合物，其可以添加到浓缩 的酶变体溶液中。有机化合物沉淀剂可以包括：4-羟基苯甲酸、4-羟基苯 甲酸的碱金属盐、4-羟基苯甲酸的烷基酯、以及这些有机化合物中两种或 更多种的混合物。所述有机化合物沉淀剂的添加可以在金属卤化物沉淀剂 的添加之前、与其同时或在其后发生，并且两种沉淀剂(有机化合物和金属 卤化物)的添加都可顺序进行或同时进行。
有关进一步的说明，参见例如美国专利No.5,281,526。通常，有机化 合物沉淀剂选自4-羟基苯甲酸的碱金属盐(例如钠或钾盐)，以及4-羟基苯 甲酸的线性或分支的烷基酯(其中烷基含有1-12个碳原子)，以及这些有机 化合物中两种或更多种的混合物。有机化合物沉淀剂可以是例如4-羟基苯 甲酸的线性或分支的烷基酯(其中烷基含有1-10个碳原子)，以及这些有机 化合物中两种或更多种的混合物。例如，有机化合物可以是4-羟基苯甲酸 的线性烷基酯(其中烷基含有1-6个碳原子)，以及这些有机化合物中两种或 更多种的混合物。也可以使用4-羟基苯甲酸的甲基酯、4-羟基苯甲酸的丙 基酯、4-羟基苯甲酸的丁基酯、4-羟基苯甲酸的乙基酯以及这些有机化合 物中两种或更多种的混合物。其它有机化合物还包括但不限于4-羟基苯甲 酸甲酯(称为甲基PARABEN)、4-羟基苯甲酸丙酯(称为丙基PARABEN)， 它们也是淀粉酶防腐剂。
所述有机化合物沉淀剂的添加提供了沉淀条件高度灵活性的优势(就 pH、温度、α-淀粉酶变体浓度、沉淀剂浓度和孵育时间而言)。
可以以有效提高金属卤化物沉淀剂引起的酶变体沉淀的量使用有机化 合物沉淀剂。基于本发明公开，在常规试验后，本领域普通技术人员将可 以显而易见地至少选择出有机化合物沉淀剂的有效量和最佳量、以及用于 实现最大回收的沉淀条件，包括孵育时间、pH、温度和酶变体浓度。
通常，向浓缩的酶变体溶液中加入至少0.01％w/v的有机化合物沉淀 剂，且通常至少0.02％w/v。通常向浓缩的酶变体溶液中加入不多于0.3％ w/v的有机化合物沉淀剂，且通常不多于0.2％w/v。
可以调整含有金属卤化物沉淀剂和，例如，有机化合物沉淀剂的浓缩 酶变体溶液的pH，该pH必然地将取决于待纯化的酶变体。通常，将pH 调整至淀粉酶等电点附近。通常，将pH调整至位于如下范围内：低于等 电点(pI)大约2.5个pH单位至高于等电点约2.5个pH单位。为举例说明 目的，当酶变体为源自地衣芽孢杆菌的α-淀粉酶变体时，通常将浓缩的酶 变体溶液调整至约5.5-9.7的pH或约6.5-9.0的pH。对于其他芽孢杆菌属 α-淀粉酶变体，可以类似地实施pH改变。
获得纯化的酶变体沉淀物所需的孵育时间取决于具体酶变体的性质、 酶浓度、以及具体的沉淀剂(一种或多种)及其浓度。通常，有效沉淀酶变 体的时间为约1至约30小时；通常不超过约25小时。在有机化合物沉淀 剂存在下，孵育时间还可以减至小于约10小时，且在大多数情况下甚至是 约6小时。
通常，孵育期间的温度为约4℃至约50℃。通常，在约10℃至约45℃ 或约20℃至约40℃的温度进行所述方法。用于诱导沉淀的最佳温度根据溶 液条件和酶变体或所用沉淀剂而变化。
可以通过搅拌包括酶变体、添加的金属卤化物和添加的有机化合物的 溶液，来提高纯化的酶变体沉淀物的总回收率以及该方法的实施效率。可 以在添加金属卤化物和有机化合物期间，以及在随后的孵育期均进行搅拌 步骤。适宜的搅拌方法包括机械搅拌或振荡、强有力的通风或任何类似的 技术。
孵育期后，可以通过常规分离技术，例如过滤、离心、微量过滤、旋 转真空过滤、超滤、压滤、交叉膜微量过滤(cross membrane microfiltration)、交叉流膜微量过滤等，自解离的色素以及其他杂质中分 离和收集纯化的酶变体。交叉膜微量过滤可以是一种应用方法。可以通过 用水洗涤沉淀物获得对纯化的酶变体沉淀物的进一步纯化。例如，用含有 金属卤化物沉淀剂的水，或例如用含有金属卤化物和有机化合物沉淀剂的 水来洗涤纯化的酶变体沉淀物。
培养期间，热稳定的淀粉酶胞外累积在培养物肉汤中。为了分离和纯 化期望的α-淀粉酶变体，离心或过滤培养物肉汤以除去细胞，并利用所得 的无细胞液体进行酶纯化。在一个实施方案中，使用约70％饱和度的硫酸 铵对无细胞肉汤进行盐析；然后将该70％饱和度-沉淀级分溶解在缓冲液 中并施加到诸如Sephadex G-100柱等柱中，然后洗脱以回收酶变体活性级 分。为了进一步的纯化，可使用诸如离子交换色谱等常规方法。
纯化的酶变体可用于通常利用酶变体的所有应用中。例如，它们可以 用于洗衣洗涤剂和除斑剂，用于食品工业，用于淀粉加工和烘焙，且可作 为消化助剂用于药物组合物。可以将它们制成液体(溶液，浆液)或固体(颗 粒，粉末)终产物。
可选地，可以回收酶产物，并向培养基中加入絮凝剂，以通过过滤或 离心除去细胞和细胞碎片，而无需进一步纯化酶。
5.包括α-淀粉酶变体的组合物
α-淀粉酶变体拥有允许进行多种工业应用的有价值的性能。酶变体可 以用作洗涤、餐具洗涤和硬表面清洁洗涤剂组合物的组分。众多变体尤其 可用于由淀粉生产增甜剂和乙醇，和/或用于织物退浆。用于常规淀粉转换 过程，包括淀粉液化和/或糖化过程的条件描述在例如美国专利No. 3,912,590和欧洲专利公开No.252,730和63,909中。
在药学应用中，α-淀粉酶变体通常例如通过冻干进行干燥。
5.1清洁和餐具洗涤组合物及用途
可以将本文讨论的α-淀粉酶变体配制在用于清洁餐具的洗涤剂组合 物中或其他清洁组合物中。这些组合物可以是粉末或液体。组合物可以包 括单独的α-淀粉酶变体、其他淀粉分解酶、其它清洁酶以及清洁组合物常 用的其他组分。
因此，餐具洗涤洗涤剂组合物可以包括表面活性剂。表面活性剂可以 是阴离子型、非离子型、阳离子型、两性离子型或这些类型的混合。洗涤 剂可以含有按重量计0％至约90％的非离子表面活性剂，例如低或无泡沫 乙氧基化丙氧基化直链醇。
在洗涤剂应用中，通常将α-淀粉酶变体用于含有丙二醇的液体组合物 中。例如通过在含有10％氯化钙的25％体积/体积丙二醇溶液中循环，使 α-淀粉酶变体溶解于丙二醇。
洗涤剂组合物可含有无机和/或有机类型的洗涤剂助剂盐。洗涤剂助剂 可细分为含磷和不含磷的类型。洗涤剂组合物通常含有约1％至约90％的 洗涤剂助剂。当存在含磷的无机碱性洗涤剂助剂时，其实例包括水溶性盐， 尤其是碱金属焦磷酸盐、正磷酸盐和聚磷酸盐。当存在含磷的有机碱性洗 涤剂助剂时，其实例包括水溶性膦酸盐。当存在不含磷的无机助剂时，其 实例包括水溶性碱金属碳酸盐、硼酸盐和硅酸盐以及多种类型的水不溶性 晶体或无定形硅铝酸盐，其中沸石是最为公知的代表。
适宜的有机助剂的实例包括碱金属；铵和取代的铵；柠檬酸盐；琥珀 酸盐；丙二酸盐；脂肪酸磺酸盐；羧基甲氧基琥珀酸盐；聚乙酸铵；羧酸 酯；聚羧酸酯；氨基聚羧酸酯；聚乙酰基羧酸酯；和多羟基磺酸酯 (polyhydroxsulphonates)。
其它适宜的有机助剂包括已知具有助剂性能的较高分子量的聚合物和 共聚物，例如适当的聚丙烯酸、聚马来酸和聚丙烯酸/聚马来酸共聚物，及 它们的盐。
清洁组合物可含有氯/溴类型或氧类型的漂白剂。无机氯/溴类型漂白 剂的实例是锂、钠或钙的次氯酸盐和次溴酸盐，以及氯化磷酸三钠。有机 氯/溴类型漂白剂的实例是杂环N-溴和N-氯酰亚胺类，如三氯异氰脲酸、 三溴异氰脲酸、二溴异氰脲酸、和二氯异氰脲酸，及其与水增溶性阳离子(如 钾和钠)的盐。乙内酰脲化合物也是适宜的。
清洁组合物可含有氧漂白剂，例如以无机过酸盐的形式，与例如漂白 前体一起，或以过氧酸化合物的形式。适宜的过氧漂白化合物的典型实例 是碱金属过硼酸盐(四水合物和一水合物)，碱金属过碳酸盐、过硅酸盐和 过磷酸盐。示例性的活性剂材料是TAED，和三乙酸甘油酯。酶促漂白活 化体系也可以存在，例如过硼酸盐或过碳酸盐、三乙酸甘油酯和过水解酶 (perhydrolase)，如国际PCT申请WO 2005/056783中所公开的那样。
可使用常规用于酶的稳定剂来稳定清洁组合物，该稳定剂例如多元醇 例如丙二醇、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物(例如芳族硼酸酯)。
清洁组合物也可含有其它常规洗涤剂成分，例如反絮凝剂材料、填充 剂材料、消泡剂、防腐蚀剂、悬污剂、多价螯合剂、防污垢再沉积剂、脱 水剂、染料、杀菌剂、荧光剂、增稠剂和香料。
最后，α-淀粉酶变体可用于常规餐具洗涤洗涤剂中，例如用于任何如 下专利公开中描述的任何洗涤剂中(考虑该修饰的α-淀粉酶是在SEQ ID NO：1的X2处修饰以提高产量的芽孢杆菌属α-淀粉酶，或者是除本文公开 α-淀粉酶变体之外还使用的所列专利和专利申请中的α-淀粉酶)：CA 2006687、GB 2200132、GB 2234980、GB 2228945、DE 3741617、DE 3727911、DE 4212166、DE 4137470、DE 3833047、DE 4205071、WO 93/25651、WO 93/18129、WO 93/04153、WO 92/06157、WO 92/08777、 WO 93/21299、WO 93/17089、WO 93/03129、EP 481547、EP 530870、 EP 533239、EP 554943、EP 429124、EP 346137、EP 561452、EP 318204、 EP 318279、EP 271155、EP 271156、EP 346136、EP 518719、EP 518720、 EP 518721、EP 516553、EP 561446、EP 516554、EP 516555、EP 530635、 EP 414197、美国专利No.5,112,518、美国专利No.5,141,664和美国专利 No.5,240,632。
5.2洗衣洗涤剂组合物及用途
根据该实施方案，通常一种或多种α-淀粉酶变体可为洗涤剂组合物的 组分。如此，其可以以无粉尘颗粒、稳定的液体或受保护的酶的形式包括 在洗涤剂组合物中。可以例如，按美国专利No.4,106,991和4,661,452(均 属于Novo Industri A/S)所公开的那样来生产无粉尘颗粒，并且可任选地由 本领域已知的方法进行包衣。蜡质包衣材料的实例是平均分子量为1,000 至20,000的聚(环氧乙烷)产物(聚乙二醇，PEG)；具有16-50个环氧乙烷单 元的乙氧基化壬基酚；乙氧基化脂肪醇，其中醇含有12-20个碳原子，且 其中有15-80个环氧乙烷单元；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的甘油单酯 和甘油二酯及甘油三酯。例如英国专利No.1483591给出了适于通过流化 床技术应用的成膜包衣材料的实例。可例如通过加入多元醇诸如丙二醇、 糖或糖醇、乳酸或硼酸，按照已建立的方法来稳定液态酶制品。其它酶稳 定剂是本领域公知的。可按照例如EP 238,216公开的方法来制备受保护的 酶。长期以来多元醇被公认为蛋白质的稳定剂，和用于提高蛋白质的溶解 性，参见例如，J.K.Kaushik等人，“Why is trehalose an exceptional protein stabilizer？An analysis of the thermal stability of proteins in the presence of the compatible osmolyte trehalose”J.Biol.Chem.278：26458-65(2003) 以及其中引用的参考文献；和M.Conti等人“Capillary isoelectric focusing： the problem of protein solubility，”J.Chromatography 757：237-245(1997)。
洗涤剂组合物可以是任何便利的形式，例如粉末、颗粒、糊剂或液体。 液体洗涤剂可以是水性的，通常含有高达约70％的水和0％至约30％的有 机溶剂，其也可以是只含有约30％水的压缩凝胶(compact gel)类型的形式。
洗涤剂组合物可以包括一种或多种表面活性剂，其中每种都可以是阴 离子型、非离子型、阳离子型或两性离子型。洗涤剂将通常包含0％至约 50％的阴离子表面活性剂，例如线性烷基苯磺酸盐(LAS)；α-烯烃磺酸盐 (AOS)；烷基硫酸盐(脂肪醇硫酸盐)(AS)；醇乙氧基硫酸盐(AEOS或AES)； 仲烷基磺酸盐(SAS)；α-磺基脂肪酸甲酯；烷基或烯基琥珀酸；或皂。组合 物也可包含0％至约40％的非离子表面活性剂，例如醇乙氧基化物(AEO 或AE)、羧化的醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、烷基多苷、烷基二甲 基胺氧化物、乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺、脂肪酸单乙醇酰胺、或多羟基 烷基脂肪酸酰胺(如例如在WO 92/06154中所述)。
洗涤剂组合物可另外包括一种或多种其他酶，例如脂肪酶、角质酶、 蛋白酶、纤维素酶、过氧化物酶、和/或漆酶的任何组合。
洗涤剂可含有约1％到约65％的洗涤剂助剂或络合剂，如沸石、二磷 酸盐、三磷酸盐、膦酸盐、柠檬酸盐、次氮基三乙酸(NTA)、乙二胺四乙 酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTMPA)、烷基或烯基琥珀酸、可溶性 硅酸盐或层状硅酸盐(例如，来自Hoechst的SKS-6)。洗涤剂也可以是未 加强的，即基本上不含洗涤剂助剂。可以在与酶的稳定性兼容的任何组合 物中使用酶。通常可以用已知的包囊化形式(例如通过造粒或隔离在水凝胶 中)来保护酶免于遭遇有害组分。具有或不具有淀粉结合结构域的酶(尤其 是α-淀粉酶)不局限于洗衣和餐具洗涤应用，而是可以用于表面清洁剂以及 用于由淀粉或生物质(biomass)生产乙醇。
洗涤剂可包括一种或多种聚合物。实例包括羧甲基纤维素(CMC)、聚 乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯如聚丙 烯酸酯、马来酸/丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。
洗涤剂可含有漂白体系，这可包括H2O2来源(例如过硼酸盐或过碳酸 盐)，其可以与形成过酸的漂白活性剂，如四乙酰基乙二胺(TAED)或壬酰 基氧基苯磺酸盐(NOBS)联用。或者，漂白体系可包括过氧酸(例如酰胺、 亚胺或砜类过氧酸)。漂白体系也可以是酶促漂白体系，其中过水解酶活化 过氧化物，例如国际PCT申请WO 2005/056783中所述的那些。
可使用常规稳定剂来稳定洗涤剂组合物中的酶，稳定剂例如多元醇如 丙二醇或甘油；糖或糖醇；乳酸；硼酸或硼酸衍生物如硼酸芳香酯；并且 可按例如WO 92/19709和WO 92/19708所述配制组合物。
洗涤剂也可含有其它常规洗涤剂成分，例如织物调理剂，包括粘土、 增泡剂、抑泡剂、防腐蚀剂、悬污剂、抗污垢再沉积剂、染料、杀细菌剂、 荧光增白剂或香料。pH(在使用浓度下于水性溶液中测量)通常是中性或碱 性，例如pH约7.0至约11.0。
α-淀粉酶变体可以按常规用于洗涤剂中的浓度掺入。目前认为在洗涤 剂组合物中可以按相当于每升洗液0.00001-1.0mg(按纯酶蛋白质计算)α- 淀粉酶变体的量加入α-淀粉酶变体。包括α-淀粉酶变体的洗涤剂组合物可 以配制成的具体形式包括：
1)具有体积密度(bulk density)为至少600g/L的颗粒剂形式的洗涤剂 组合物，包括约7％至约12％的线性烷基苯磺酸盐(按酸计算)；约1％至约 4％的醇乙氧基硫酸盐(例如C12-18醇，1-2环氧乙烷(EO))或烷基硫酸盐(例 如C16-18)；约5％至约9％的醇乙氧基化物(例如C14-15醇，7EO)；约14％至 约20％的碳酸钠(例如Na2CO3)；约2％至约6％的可溶性硅酸盐(例如Na2O， 2SiO2)；约15％至约22％的沸石(例如NaAlSiO4)；0％至约6％的硫酸钠(例 如Na2SO4)；约0％至约15％的柠檬酸钠/柠檬酸(例如C6H5Na3O7/C6H8O7)； 约11％至约18％的过硼酸钠(例如NaBO3H2O)；约2％至约6％的TAED； 0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；0-3％的聚合物(例如马来酸/丙烯酸共 聚物，PVP，PEG)；0.0001-0.1％蛋白质的酶(按纯酶计算)；和0-5％次要 成分(例如抑泡剂、香料、荧光增白剂、光漂白剂)。
2)具有体积密度为至少600g/L的颗粒剂形式的洗涤剂组合物，包括 约6％至约11％的线性烷基苯磺酸盐(按酸计算)；约1％至约3％的醇乙氧 基硫酸盐(例如C12-18醇，1-2EO)或烷基硫酸盐(例如C16-18)；约5％至约9％ 的醇乙氧基化物(例如C14-15醇，7EO)；约15％至约21％的碳酸钠(例如 Na2CO3)；约1％至约4％的可溶性硅酸盐(例如Na2O，2SiO2)；约24％至 约34％的沸石(例如NaAlSiO4)；约4％至约10％的硫酸钠(例如Na2SO4)； 0％至约15％的柠檬酸钠/柠檬酸(例如C6H5Na3O7/C6H8O7)；0％至约2％的 羧甲基纤维素(CMC)；1-6％的聚合物(例如马来酸/丙烯酸共聚物，PVP， PEG)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；0-5％的次要成分(例如抑泡 剂、香料)。
3)具有体积密度为至少600g/L的颗粒剂形式的洗涤剂组合物，包括 约5％至约9％的线性烷基苯磺酸盐(按酸计算)；约7％至约14％的醇乙氧 基化物(例如C12-15醇，7EO)；约1％至约3％的皂如脂肪酸(例如C16-22脂肪 酸)；约10％至约17％的碳酸钠(如Na2CO3)；约3％至约9％的可溶性硅 酸盐(例如Na2O，2SiO2)；约23％至约33％的沸石(如NaAlSiO4)；0％至约 4％的硫酸钠(例如Na2SO4)；约8％至约16％的过硼酸钠(例如NaBO3H2O)； 约2％至约8％TAED；0％至约1％的膦酸盐(例如EDTMPA)；0％至约2％ 的羧甲基纤维素(CMC)；0-3％的聚合物(例如马来酸/丙烯酸共聚物，PVP， PEG)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；0-5％的次要成分(例如抑泡 剂、香料、荧光增白剂)。
4)具有体积密度为至少600g/L的颗粒剂形式的洗涤剂组合物，包括 约8％至约12％的线性烷基苯磺酸盐(按酸计算)；约10％至约25％的醇乙 氧基化物(例如C12-15醇，7EO)；约14％至约22％的碳酸钠(如Na2CO3)； 约1％至约5％的可溶性硅酸盐(例如Na2O，2SiO2)；约25％至约35％的沸 石(例如NaAlSiO4)；0％至约10％的硫酸钠(例如Na2SO4)；0％至约2％的 羧甲基纤维素(CMC)；1-3％的聚合物(例如马来酸/丙烯酸共聚物，PVP， PEG)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-5％的次要成分(例如抑 泡剂、香料)。
5)水性液体洗涤剂组合物，包括约15％至约21％的线性烷基苯磺酸盐 (按酸计算)；约12％至约18％的醇乙氧基化物(例如C12-15醇，7EO或C12-15醇，5EO)；约3％至约13％的皂如脂肪酸(例如油酸)；0％至约13％的烯基 琥珀酸(C12-14)；约8％至约18％的氨基乙醇；约2％至约8％的柠檬酸；0％ 至约3％的膦酸盐；0％至约3％的聚合物(例如PVP，PEG)；0％至约2％ 的硼酸盐(例如B4O7)；0％至约3％的乙醇；约8％至约14％的丙二醇； 0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-5％的次要成分(例如分散剂、 抑泡剂、香料、荧光增白剂)。
6)水性结构型液体洗涤剂组合物，包括约15％至约21％的线性烷基苯 磺酸盐(按酸计算)；3-9％的醇乙氧基化物(例如C12-15醇，7EO或C12-15醇，5 EO)；约3％至约10％的皂如脂肪酸(例如油酸)；约14％至约22％的沸石(如 NaAlSiO4)；约9％至约18％的柠檬酸钾；0％至约2％的硼酸盐(例如B4O7)； 0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；0％至约3％的聚合物(例如PEG， PVP)；0％至约3％的锚定聚合物(anchoring polymer)(例如甲基丙烯酸月 桂酯/丙烯酸共聚物；摩尔比25∶1，MW 3800)；0％至约5％的甘油； 0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-5％的次要成分(例如分散剂、 抑泡剂、香料、荧光增白剂)。
7)具有体积密度为至少600g/L的颗粒剂形式的洗涤剂组合物，包括 约5％至约10％的脂肪醇硫酸盐；约3％至约9％的乙氧基化脂肪酸单乙醇 酰胺；0-3％的皂如脂肪酸；约5％至约10％的碳酸钠(例如Na2CO3)；约 1％至约4％的可溶性硅酸盐(例如Na2O，2SiO2)；约20％至约40％的沸石 (例如NaAlSiO4)；约2％至约8％的硫酸钠(例如Na2SO4)；约12％至约18％ 的过硼酸钠(例如NaBO3H2O)；约2％至约7％的TAED；约1％至约5％ 的聚合物(例如马来酸/丙烯酸共聚物，PEG)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白 质计算)；和0-5％的次要成分(例如荧光增白剂，抑泡剂、香料)。
8)颗粒剂形式的洗涤剂组合物，包括约8％至约14％的线性烷基苯磺 酸盐(按酸计算)；约5％至约11％的乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺；0％至约 3％的皂如脂肪酸；约4％至约10％的碳酸钠(例如Na2CO3)；约1％至约 4％的可溶性硅酸盐(Na2O，2SiO2)；约30％至约50％的沸石(例如 NaAlSiO4)；约3％至约11％的硫酸钠(例如Na2SO4)；约5％至约12％的 柠檬酸钠(例如C6H5Na3O7)；约1％至约5％的聚合物(例如PVP，马来酸/ 丙烯酸共聚物，PEG)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-5％的 次要成分(例如抑泡剂、香料)。
9)颗粒剂形式的洗涤剂组合物，包括约6％至约12％的线性烷基苯磺 酸盐(按酸计算)；约1％至约4％的非离子表面活性剂；约2％至约6％的 皂如脂肪酸；约14％至约22％的碳酸钠(例如Na2CO3)；约18％至约32％ 的沸石(例如，NaAlSiO4)；约5％至约20％的硫酸钠(例如Na2SO4)；约3％ 至约8％的柠檬酸钠(例如C6H5Na3O7)；约4％至约9％的过硼酸钠(例如 NaBO3H2O)；约1％至约5％的漂白活性剂(例如NOBS或TAED)；0％至 约2％的羧甲基纤维素(CMC)；约1％至约5％的聚合物(例如聚羧酸酯或 PEG)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-5％的次要成分(例如， 荧光增白剂、香料)。
10)水性液体洗涤剂组合物，包括约15％至约23％的线性烷基苯磺酸 盐(按酸计算)；约8％至约15％的醇乙氧基硫酸盐(例如C12-15醇，2-3EO)； 约3％至约9％的醇乙氧基化物(例如C12-15醇，7EO或C12-15醇，5EO)；0％ 至约3％的皂如脂肪酸(例如月桂酸)；约1％至约5％的氨基乙醇；约5％ 至约10％的柠檬酸钠；约2％至约6％的助水溶物(例如甲苯磺酸钠)；0％ 至约2％的硼酸盐(例如B4O7)；0％至约1％的羧甲基纤维素；约1％至约 3％的乙醇；约2％至约5％的丙二醇；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计 算)；和0-5％的次要成分(例如聚合物、分散剂、香料、荧光增白剂)。
11)水性液体洗涤剂组合物，包括约20％至约32％的线性烷基苯磺酸 盐(按酸计算)；6-12％的醇乙氧基化物(例如C12-15醇，7EO或C12-15醇，5 EO)；约2％至约6％的氨基乙醇；约8％至约14％的柠檬酸；约1％至约 3％的硼酸盐(例如B4O7)；0％至约3％的聚合物(例如马来酸/丙烯酸共聚 物，锚定聚合物例如甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物)；约3％至约8％的 甘油；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-5％的次要成分(例如助 水溶物、分散剂、香料、荧光增白剂)。
12)具有体积密度为至少600g/L的颗粒剂形式的洗涤剂组合物，包括 约25％至约40％的阴离子表面活性剂(线性烷基苯磺酸盐、烷基硫酸盐、α- 烯烃磺酸盐、α-磺基脂肪酸甲酯、烷基磺酸盐、皂)；约1％至约10％的非 离子表面活性剂(例如醇乙氧基化物)；约8％至约25％的碳酸钠(例如 Na2CO3)；约5％至约15％的可溶性硅酸盐(例如Na2O，2SiO2)；0％至约 5％的硫酸钠(例如Na2SO4)；约15％至约28％的沸石(NaAlSiO4)；0％至约 20％的过硼酸钠(例如NaBO3·4H2O)；约0％至约5％的漂白活性剂(TAED 或NOBS)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；0-3％的次要成分(例如 香料、荧光增白剂)。
13)如上面组合物1)-12)所述的洗涤剂组合物，其中所有或者部分的线 性烷基苯磺酸盐被(C12-C18)烷基硫酸盐代替。
14)具有体积密度为至少600g/L的颗粒剂形式的洗涤剂组合物，包括 约9％至约15％的(C12-C18)烷基硫酸盐；约3％至约6％的醇乙氧基化物； 约1％至约5％的多羟基烷基脂肪酸酰胺；约10％至约20％的沸石(例如 NaAlSiO4)；约10％至约20％的层状焦硅酸盐(例如来自Hoechst的SK56)； 约3％至约12％的碳酸钠(例如Na2CO3)；0％至约6％的可溶性硅酸盐(例 如Na2O，2SiO2)；约4％至约8％的柠檬酸钠；约13％至约22％的过碳酸 钠；约3％至约8％的TAED；0％至约5％的聚合物(例如聚羧酸酯和PVP)； 0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-5％的次要成分(例如荧光增白 剂、光漂白剂、香料、抑泡剂)。
15)具有体积密度为至少600g/L的颗粒剂形式的洗涤剂组合物，包括 约4％至约8％的(C12-C18)烷基硫酸盐；约11％至约15％的醇乙氧基化物； 约1％至约4％的皂；约35％至约45％的沸石MAP或沸石A；约2％至约 8％的碳酸钠(如Na2CO3)；0％至约4％的可溶性硅酸盐(例如Na2O，2SiO2)； 约13％至约22％的过碳酸钠；1-8％的TAED；0％至约3％的羧甲基纤 维素(CMC)；0％至约3％的聚合物(例如聚羧酸酯和PVP)；0.0001-0.1％的 酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-3％的次要成分(例如荧光增白剂、膦酸盐、 香料)。
16)上面1)-15)所述的洗涤剂制剂，其含有被稳定化的或囊化的过酸作 为额外组分或者作为已经述及的漂白体系的替代物。
17)上面1)、3)、7)、9)和12)所述的洗涤剂组合物，其中过硼酸盐被过 碳酸盐代替。
18)上文1)、3)、7)、9)、12)、14)和15)所述的洗涤剂组合物，还含 有锰催化剂。
19)配制成非水性洗涤剂液体的洗涤剂组合物，包括液态非离子表面活 性剂，例如，线性烷氧基化伯醇、助洗剂体系(例如磷酸盐)、酶和碱。该 洗涤剂也可包括阴离子表面活性剂和/或漂白体系。
α-淀粉酶变体可以按常规采用的浓度掺入洗涤剂中。目前认为在洗涤 剂组合物中可以按相当于每升洗液0.00001-1.0mg(按纯酶蛋白质计算)α- 淀粉酶变体的量加入α-淀粉酶变体。
另一方面，可将2，6-β-D-果聚糖水解酶掺入洗涤剂组合物中并用于家 居和/或工业纺织品/衣物上存在的生物膜的去除/清洁。
例如，可以将洗涤剂组合物配制成手洗或机洗的洗衣洗涤剂组合物， 包括适于预处理污染的织物的洗衣添加剂组合物和漂洗添加的织物软化剂 组合物，或者配制成用于一般的家居硬表面清洁操作的洗涤剂组合物，或 者配制以用于手洗或机洗的餐具洗涤操作。
一个具体的方面，洗涤剂组合物可以包括2，6-β-D-果聚糖水解酶，一 种或多种α-淀粉酶变体，和一种或多种其它清洁酶，例如蛋白酶、脂肪酶、 角质酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯聚糖酶、半乳聚 糖酶、木聚糖酶、氧化酶、漆酶和/或过氧化物酶和/或其组合。
通常，所选酶的特性应与选择的洗涤剂兼容(例如最适pH、与其他酶 和非酶成分的兼容性等)，且所述酶应以有效量存在。
蛋白酶：适宜的蛋白酶包括动物、植物或微生物来源的那些。示例蛋 白酶包括源于微生物的那些。包括经化学修饰或蛋白质改造的突变体。蛋 白酶可以是丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶、碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样 蛋白酶。碱性蛋白酶的实例是枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)，尤其是源自芽 孢杆菌属的那些，例如枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、 枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168(参见例 如，WO 89/06279)。胰蛋白酶样蛋白酶的实例是胰蛋白酶(例如源于猪或牛) 和镰孢霉属蛋白酶(参见例如，WO 89/06270和WO 94/25583)。有用的蛋 白酶的实例也包括但不限于WO 92/19729、WO 98/20115、WO 98/20116 和WO 98/34946中所述的变体。市售可得的蛋白酶包括PrimaseTM、DuralaseTM、和KannaseTM(Novo Nordisk A/S)；MaxacalTM、MaxapemTM、Purafect OxPTM、FN2TM和FN3TM(Genencor International， Inc.)。
脂肪酶：适宜的脂肪酶包括细菌或真菌来源的那些。包括经化学修饰 或蛋白质改造的突变体。有用的脂肪酶的实例包括但不限于来自腐质霉属 (Humicola)(与嗜热丝孢菌属同义)的脂肪酶，例如来自疏毛腐质霉(H. lanuginose)(疏棉状嗜热丝孢菌(T.lanuginosus))(参见例如，EP 258068和 EP 305216)、来自特异腐质霉(H.insolens)(参见例如，WO 96/13580)；假 单胞菌属(Pseudomonas)脂肪酶(例如来自产碱假单胞菌(P.alcaligenes)或 类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)；参见例如EP 218272)，洋葱假单 胞菌(P.cepacia)(参见例如EP 331376)、斯氏假单胞菌(P.stutzeri)(参见例 如GB 1,372,034)、荧光假单胞菌(P.fluorescens)、假单胞菌属菌株SD 705 (参见例如，WO 95/06720和WO 96/27002)、P.wisconsinensis(参见例如 WO 96/12012)的脂肪酶；芽孢杆菌属脂肪酶(例如来自枯草芽孢杆菌；参见 例如Dartois等人，Biochemica et Biophysica Acta，1131：253-360(1993))， 嗜热脂肪芽孢杆菌(参见例如JP 64/744992)或短小芽孢杆菌(B.pumilus)(参 见例如WO 91/16422)的脂肪酶。其它可以考虑在制剂中使用的脂肪酶变体 包括例如在WO 92/05249、WO 94/01541、WO 95/35381、WO 96/00292、 WO 95/30744、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/22615、WO 97/04079、 WO 97/07202、EP 407225和EP 260105中描述的那些。一些市售可得的 脂肪酶包括和Ultra(Novo Nordisk A/S)。
聚酯酶：适宜的聚酯酶包括但不限于在国际PCT申请WO 01/34899 和WO 01/14629中描述的那些，并且可以与本文描述的其他酶以任意组合 包括在组合物中。
淀粉酶：组合物可以与其它α-淀粉酶组合，例如非产量提高型的α- 淀粉酶。这些可以包括市售可得的淀粉酶，例如但不限于和BANTM(Novo Nordisk A/S)；和 (来自Genencor International，Inc.)。
纤维素酶：可以向组合物中加入纤维素酶。适宜的纤维素酶包括细菌 或真菌来源的那些。包括经化学修饰的或蛋白质改造的突变体。适宜的纤 维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰孢霉属、梭孢壳 属(Thielavia)、枝顶孢属(Acremonium)的纤维素酶，例如如美国专利No. 4,435,307；5,648,263；5,691,178；5,776,757和WO 89/09259公开的自特异 腐质霉、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)和尖镰孢产生的真菌纤维 素酶。可以考虑使用的示例性纤维素酶为对于纺织品具有颜色护理益处的 那些。此类纤维素酶的实例是例如EP 0495257、EP 0531372、WO 96/11262、 WO 96/29397和WO 98/08940中描述的纤维素酶。其它实例是纤维素酶变 体，例如WO 94/07998；WO 98/12307；WO 95/24471；PCT/DK98/00299； EP 531315；美国专利No.5,457,046；5,686,593和5,763,254中描述的那些。 市售可得的纤维素酶包括和(Novo Nordisk A/S)； ClazinaseTM和HA(Genencor International，Inc.)；以及 KAC-500(B)TM(Kao Corporation)。
过氧化物酶/氧化酶：考虑用于该组合物的适宜过氧化物酶/氧化酶包 括植物、细菌或真菌来源的那些。包括经化学修饰的或蛋白质改造的突变 体。有用的过氧化物酶的实例包括来自鬼伞属(Coprinus)，例如来自灰盖鬼 伞(C.cinereus)的过氧化物酶，及其变体如在WO 93/24618、WO 95/10602 和WO 98/15257中所述的那些。市售可得的过氧化物酶包括例如 GuardzymeTM(Novo Nordisk A/S)。
可通过添加含有一种或多种酶的分开的添加剂，或通过添加包括所有 这些酶的组合的添加剂而在洗涤剂组合物中包括洗涤剂酶。可以将洗涤剂 添加剂，即分开的添加剂或组合的添加剂配成例如颗粒、液体、浆液等。 示例性的洗涤剂添加剂制剂是颗粒，尤其是无粉尘颗粒；液体，尤其是稳 定的液体或浆液。
可例如按照美国专利No.4,106,991和4,661,452所公开来生产无粉尘 颗粒，并且可任选地用本领域已知的方法进行包衣。蜡质包衣材料的实例 是平均分子量为1,000至20,000的聚环氧乙烷(聚乙二醇，PEG)；具有16-50 个环氧乙烷单元的乙氧基化壬基酚；乙氧基化脂肪醇，其中醇含有12-20 个碳原子且其中有15-80个环氧乙烷单元；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸 的甘油单酯和甘油二酯及甘油三酯。例如GB 1483591给出了适于通过流 化床技术应用的成膜包衣材料的实例。可例如通过加入多元醇诸如丙二醇、 糖或糖醇、乳酸或硼酸，按照已建立的方法来稳定液态酶制品。可按照如 EP 238,216公开的方法来制备受保护的酶。
洗涤剂组合物可以是任何便利的形式，例如棒、片、粉末、颗粒、糊 或液体。液体洗涤剂可以是水性的，通常含有高达约70％的水，和0％至 约30％的有机溶剂。也可以考虑含有约30％或更少水的压缩(compact)洗 涤剂凝胶。洗涤剂组合物可以包括一种或多种表面活性剂，该表面活性剂 可以是非离子型，包括半极性，和/或阴离子型和/或阳离子型和/或两性离 子型。表面活性剂一般按以重量计约0.1％-60％的水平存在。
当包括在洗涤剂中时，洗涤剂典型地将含有约1％至约40％的阴离子 表面活性剂，例如线性烷基苯磺酸盐、α-烯烃磺酸盐、烷基硫酸盐(脂肪醇 硫酸盐)、醇乙氧基硫酸盐、仲烷基磺酸盐、α-磺基脂肪酸甲酯、烷基或烯 基琥珀酸、或皂。
当包括在洗涤剂中时，洗涤剂通常将含有约0.2％至约40％的非离子 表面活性剂，如醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、烷基多苷、烷基二甲 基胺氧化物、乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺、脂肪酸单乙醇酰胺、多羟基烷 基脂肪酸酰胺、或葡糖胺的N-酰基-N-烷基衍生物(“葡糖酰胺”)。
洗涤剂可含有0％至约65％的洗涤剂助剂或络合剂(complexing agent)，例如沸石、二磷酸盐、三磷酸盐、膦酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐、 次氮基三乙酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸、烷基或烯基 琥珀酸、可溶性硅酸盐或层状硅酸盐(例如来自Hoechst的SKS-6)。
洗涤剂可包括一种或多种聚合物。实例有羧甲基纤维素(CMC)、聚乙 烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚(乙烯基吡啶-N- 氧化物)、聚乙烯基咪唑、聚羧酸酯(如聚丙烯酸酯、马来酸/丙烯酸共聚物) 和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。
洗涤剂可含有漂白体系，这可包括H2O2来源(例如过硼酸盐或过碳酸 盐)，其可以与形成过酸的漂白活性剂(如四乙酰基乙二胺或壬酰基氧基苯 磺酸盐)联用。或者，漂白体系可包括过氧酸(例如酰胺、酰亚胺或砜类过 氧酸)。漂白体系也可以是酶促漂白体系。
可使用常规的稳定剂来稳定洗涤剂组合物中的酶，稳定剂例如：多元 醇(如丙二醇或甘油)、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物(例如，硼酸芳 族酯)、或苯基硼酸衍生物(例如4-甲酰基苯基硼酸)。可按照WO 92/19709 和WO 92/19708所述配制所述组合物。
洗涤剂也可含有其它常规洗涤剂成分，例如织物调理剂，包括粘土、 增泡剂、抑泡剂、防腐蚀剂、悬污剂、抗污垢再沉积剂、染料、杀细菌剂、 荧光增白剂、助水溶物、晦暗抑制剂或香料。
目前认为在洗涤剂组合物中，尤其是酶变体可以按相当于每升洗液约 0.01至约100mg酶蛋白质(例如每升洗液约0.05至约5.0mg酶蛋白质，特 别是每升洗液约0.1至约1.0mg酶蛋白质)的量加入。
5.3评估洗涤剂组合物的方法
存在众多α-淀粉酶清洁测定法。检测清洁的示例性描述包括如下内 容。
“样片”(swatch)是一块材料，诸如其上施有污渍的织物。该材料可以 是例如由棉、聚酯或天然和合成纤维的混合物制成的织物。样片还可以是 纸，例如滤纸或硝化纤维素，或者是一块硬材料，例如陶瓷、金属或玻璃。 对于淀粉酶，污渍是基于淀粉的，但是也可以包括血液、乳、墨水、草、 茶、酒、菠菜、肉汁、巧克力豆、奶酪、粘土、色素、油或这些化合物的 混合物。
“小样片”是自样片上用单孔穿孔装置切下的部分，或者用定制的96 孔穿孔装置(该多孔穿孔模式与标准96孔微滴定板匹配)切下的部分，或者 是以其它方式自样片上取下的部分。样片可以是纺织品、纸、金属或其他 适宜的材料。小样片可以在放入24孔、48孔或96孔微滴定板孔之前或之 后被污物固着。“小样片”也可以通过向小块材料施加污物而制成。小样片 可以是直径为5/8″或更小的污染的织物片，例如直径0.25″的样片。定制 的穿孔机经设计可以同时将96个样片递送至96孔板的所有孔中。该装置 可以通过简单地向同一96孔板多次上样，而向每孔递送一个以上的样片。 可以想到将多孔穿孔装置用于向任何格式的板(包括但不限于24孔、48孔 和96孔板)同时递送多个样片。另一可想到的方法中，污染的测试平台可 以是由金属、塑料、玻璃、陶瓷，或其他适宜材料形成的、被污物载污体 包覆的珠。然后将一个或多个污物包覆的珠放入含有适宜缓冲液和酶的96 孔、48孔或24孔板的孔中或更大格式的板的孔中。这种情况下，可以通 过直接吸光度测量或在二级生色反应后在上清液中检测释放的污物。也可 以通过质谱分析来进行释放的污染物的分析。另一微量筛选试验可以将样 片(例如靛蓝染色的粗斜棉布)递送并固定到多孔板的孔中，并且加入颗粒 诸如沙或更大的颗粒(例如经过筛滤以包括6-8或9号(gauge)颗粒的石榴 石)，并搅动多孔板以便由加入的颗粒造成样片磨损。这一试验可用于例如 在石洗应用中评价纤维素酶。可以通过释放到反应缓冲液中的颜色(例如， 释放的靛蓝溶解到二甲基亚砜中并测量A600nm的吸光度)或通过对磨损的 样片测量反射率来判断酶的效力。
例如，当在无漂白的洗涤剂中洗涤未处理的BMI(血液/乳/墨水)样片 时，即使不借助于蛋白酶也释放出大部分的墨水。加入蛋白酶导致墨水释 放的小量增加，这在大背景下可能难于量化。本发明提供了允许人们控制 污渍固着程度的处理方法。结果是，可以产生例如当在不存在被检测的酶 的情况下进行洗涤时能释放出不等量的污渍的样片。固着的样片的使用导 致在洗涤试验中信噪比的显著提高。此外，通过改变固着程度，可以产生 在不同清洁条件下给出最佳结果的污渍。
在多种材料类型上具有已知“强度”的污渍的样片是市售可得的 (EMPA，St.Gallen，Switzerland；wfk-Testgewebe GmbH，Krefeld Germany；或Center for Test Materials，Vlaardingen，The Netherlands)和/ 或可以由从业者制得(Morris和Prato，Textile Research Journal 52(4)：280 286(1982))。示例样片有含棉织物上的血液/乳/墨水(BMI)污渍、含棉织物 上的菠菜污渍、或含棉织物上的草、以及含棉织物上的巧克力/乳/烟灰。
一方面，可以用0.0003％至0.3％的过氧化氢将BMI污渍固着在棉上。 其他组合包括用0.001％-1％戊二醛固着的草或菠菜、用0.001％-1％戊二 醛固着的明胶和考马斯染料、或用0.001％-1％戊二醛固着的巧克力、乳和 烟灰。
也可以在用酶和/或洗涤剂制剂孵育期间搅拌样片。洗涤性能数据取决 于孔中，尤其是在96孔板中的样片的取向(水平对垂直)。这表明在孵育期 间混合是不充分的。尽管存在许多方式来保证孵育期间充分的搅拌，但可 以构建将微滴定板夹在两个铝板之间的板夹。这可以简单地例如在孔上方 放置粘性板密封物，然后用任何类型的适合的、市售可得的夹子将两个铝 板与96孔板夹紧而实现。然后可以将它放到商品化的孵育摇床中。将摇床 设定为约400rpm可以导致非常有效的混合，而板夹有效地阻止了泄漏或 交叉污染。
可以使用三硝基苯磺酸(TNBS)来量化洗液中的氨基基团浓度。这可以 用作从样片中去除的蛋白质量的量度(参见例如Cayot和Tainturier，Anal. Biochem.249：184-200(1997))。然而，如果洗涤剂或酶样品导致异乎寻常 小的肽片段的形成(例如，因样品中存在肽酶所致)，那么人们将获得较大 的TNBS信号，即更多“噪音”。
另一用于测量对血液/乳/墨水的洗涤性能的手段是基于墨水的释放。 样片上蛋白质的蛋白质水解导致墨水颗粒的释放，这可以通过测量洗液的 吸光度而量化。可以在350和800nm之间的任何波长测量吸光度。另一 方面，可以在410nm或620nm处测量波长。也可以检查洗液以确定对于 含有草、菠菜、明胶或考马斯染料的污渍的洗涤性能。对于这些污渍，示 例性的波长包括对于菠菜或草的670nm和对于明胶或考马斯染料的620 nm。例如，移出等份试样的洗液(例如，通常来自96孔微板的100-150μL) 并放到小杯或微孔微板中。然后将它放到分光光度计中并在适当的波长读 取吸光度。
也可以使用该体系，例如通过使用在诸如布、塑料或陶瓷的适宜载污 体上的血液/乳/墨水污渍，来测定用于餐具洗涤的酶和/或洗涤剂组合物。
一方面，可以通过在25℃将0.3％过氧化氢施加到BMI/棉样片上30 分钟或通过在60℃将0.03％过氧化氢施加到BMI/棉样片上30分钟，在棉 上固着BMI污渍。从BMI/棉样片上切下约0.25″的小样片并放入96孔微 滴定板的孔中。向各孔中放入已知的洗涤剂组合物和酶如变体蛋白质的混 合物。向微滴定板顶部放置粘性板密封物后，将微滴定板与铝板夹在一起， 并在定轨摇床上以约250rpm搅拌约10-60分钟。这个时间结束后，将上 清液转移到新的微滴定板的孔中并测量620nm的墨水吸光度。这可以类 似地用通过在25℃向菠菜/棉样片或草/棉样片施加0.01％戊二醛30分钟而 固着在棉上的菠菜污渍或草污渍来进行检测。这也可以用巧克力、乳和/ 或烟灰污渍完成。关于血液/乳/墨水试验的其他变通形式和条件，请参见 美国专利No.7,122,334(Genencor International，Inc.)。
5.4 纺织品退浆组合物及用途
还考虑使用一种或多种酶变体处理织物(例如，使纺织品退浆)的组合 物和方法。酶变体可以用于本领域众所周知的任何织物处理方法中，参见 例如美国专利No.6,077,316。例如，一方面，可以通过包括将织物与酶变 体溶液接触的方法，改善该织物的触感和外观。一方面，该织物可以用该 溶液在压力下处理。
一方面，在纺织品纺织期间或之后、或在退浆阶段或者一个或多个其 他织物加工步骤的过程中施加酶。在纺织品纺织期间，纺线暴露于相当大 的机械张力。在机械织机上纺织之前，径纱通常涂上淀粉或淀粉衍生物浆 料，以增加其抗张强度并防止断裂。可以施加酶以除去这些淀粉或淀粉衍 生物浆料。在纺织品织成之后，织物可以进入退浆阶段。这之后可接着一 个或多个其他织物加工步骤。退浆是从纺织品中除去浆料的行为。纺织后 必须除去浆料涂层，之后再进一步加工织物，以确保均一和耐洗效果。本 文还提供了包括通过酶变体的作用来酶促水解上浆料的退浆方法。
酶变体可以单独或与其他退浆化学试剂和/或退浆酶一起用作为洗涤 剂添加剂，在例如水性组合物中，使织物(包括含棉织物)退浆。酶变体也 可用于在靛蓝染色的粗斜棉布织物和衣服上产生石洗外观的组合物和方法 中。为生产衣服，织物可以剪裁并缝纫成衣服或衣物，之后进行整理 (finish)。特别是，为生产粗斜棉布牛仔服，已研发了不同的酶促整理方法。 粗斜棉布衣服的整理通常始于酶促退浆步骤，在此期间淀粉分解酶作用于 衣服，以使织物柔软，并使该棉布更易于接受随后的酶促整理步骤。酶变 体可用于整理粗斜棉布衣服(例如“生物打磨法”(bio-stoning))、酶促退浆 及为织物提供柔软度，和/或整理的方法中。
5.5淀粉加工组合物及用途
另一方面，可利用具有所公开的α-淀粉酶变体的组合物进行淀粉液化 或糖化。
一方面是由淀粉生产增甜剂的组合物及组合物的用途。将淀粉转换为 果糖糖浆的“传统”方法通常包括三个连续的酶促步骤，即，液化步骤，接 着是糖化步骤，以及异构化步骤。在液化步骤中，在约5.5至约6.2的pH 值、约95℃至约160℃的温度，通过为期约2个小时的α-淀粉酶变体作用， 使淀粉降解为糊精。为确保这些条件下的最佳酶稳定性，可以添加1mM 的钙(40ppm游离钙离子)。淀粉加工可用于生产醇(例如，谷物液化用于燃 料和饮用酒、酒类酿造)、淀粉液化用于增甜剂生产、蔗糖加工及其他食品 相关的淀粉加工目的。对于不同的α-淀粉酶变体，可应用其他条件。
液化步骤后，可以通过添加葡糖淀粉酶(例如AMGTM)和脱支酶(如异 淀粉酶或普鲁兰酶(例如))，将糊精转换为葡萄糖。普鲁兰酶 的一个实例是源于BML 780的在地衣芽孢杆菌139株中产生的普鲁兰酶 (Δamy基因；位于cat基因座上、具有catR标记、来自B.deramificans的 可扩增PU基因；Δspo II AC；Δapr L；和Δendo-glu C，其为缺失掉以防 止普鲁兰酶水解的两个蛋白酶基因)。在此步骤之前，将pH降至低于约4.5 的值，维持高温(高于95℃)，并变性液化α-淀粉酶变体的活性。使温度降 至60℃，可以加入葡糖淀粉酶和脱支酶。糖化过程通常进行约24至约72 小时。
糖化步骤之后，将pH升至处于约6.0至约8.0范围的值(例如pH 7.5)， 并通过离子交换除去钙。然后利用例如固定化的葡萄糖异构酶(如 )将葡萄糖浆转化为高果糖糖浆。
此过程可以进行至少一种酶促改进：降低液化α-淀粉酶变体的钙依赖 性。为了确保α-淀粉酶变体足够高的稳定性，需要添加游离的钙，但是游 离的钙强烈抑制葡萄糖异构酶的活性，故而需要通过昂贵的单元操作去除， 达到游离钙的水平降至低于3-5ppm的程度。如果能够避免这样的操作， 且液化过程无需添加游离钙离子即能进行，则可以获得费用的节约。
例如，可在组合物和操作中利用钙依赖性较小的α-淀粉酶变体，其在 低浓度游离钙(＜40ppm)时稳定且具有高活性。这样的α-淀粉酶变体应当 具有位于pH范围约4.5至约6.5(例如，范围约4.5至约5.5)中的最适pH。
可利用α-淀粉酶变体在实验室及工业设置中水解淀粉或任何含麦芽 糊精的化合物以用于多种目的。这些α-淀粉酶变体可以单独使用以提供特 异性水解，或者可以与其他淀粉酶组合以提供具有广谱活性的“混合物”。 示例用途包括从生物学、食品、动物饲料、药学或工业样品中去除或部分 或完全水解淀粉或任何含麦芽糊精的化合物。
一种示例用途是发酵方法，其中淀粉底物在酶变体的存在下液化和/ 或糖化以产生葡萄糖和/或麦芽糖，其适于由发酵生物如酵母转换为发酵产 品。此类发酵方法包括用于生产燃料乙醇或饮用乙醇(饮用酒)的方法，生 产饮料的方法，生产期望有机化合物(例如柠檬酸、衣康酸、乳酸、葡糖酸、 葡萄糖酸钠、葡萄糖酸钙、葡萄糖酸钾、葡萄糖酸δ内酯或异抗坏血酸钠)、 酮、氨基酸(例如谷氨酸、单谷氨酸钠)、以及更为复杂的化合物(例如抗生 素，如青霉素、四环素)、酶、维生素(例如核黄素、维生素B 12、β-胡罗 卜素)和激素(它们难于合成生产)的方法。
待加工的淀粉可以具有高度精制的淀粉质量，例如至少90％、至少 95％、至少97％或至少99.5％纯。或者，淀粉可以是较为粗制的含淀粉材 料，其可以含有碾磨过的整个谷粒，包括非淀粉级分如胚残留物和纤维。 碾磨原料如整个谷粒的目的是打开其结构，从而允许进一步加工。可以使 用两种碾磨方法：湿磨法和干磨法。此外，可以使用玉米渣和碾磨过的玉 米渣。
干磨的谷粒除淀粉外还将包含显著量的非淀粉糖类化合物。当通过喷 射蒸煮加工这样的异质原料时，往往仅能实现淀粉的部分糊化。由于酶变 体对未糊化的淀粉具有高活性，酶变体应用在包括液化和/或糖化喷射蒸煮 的干磨淀粉的方法中具有优势。
此外，由于酶变体优越的水解活性，极大地降低了糖化步骤期间对葡 糖淀粉酶的需求。这允许糖化作用在极低水平葡糖淀粉酶活性下进行，葡 糖淀粉酶活性要么不存在，要么存在的话，其存在量也可以仅仅是或者甚 至低于0.5AGU/g DS(每克干固形物(DS)的GU活性)；仅仅是或者甚至低 于0.4AGU/g DS；仅仅是或者甚至低于约0.3AGU/g DS；以及低于0.1 AGU，例如仅仅是或者甚至低于约0.05AGU/g DS的淀粉底物。以mg酶 蛋白质表达，具有葡糖淀粉酶活性的酶要么不存在，要么其存在量仅仅是 或者甚至低于约0.5mg EP/g DS(每克干固形物的酶蛋白质)；仅仅是或者 甚至低于约0.4mg EP/g DS；仅仅是或者甚至低于约0.3mg EP/g DS；以 及仅仅是或者甚至低于约0.1mg EP/g DS，例如仅仅是或者甚至低于约 0.05mg EP/g DS，或者仅仅是或者甚至低于0.02mg EP/g DS的淀粉底物。 葡糖淀粉酶可以源自曲霉属、篮状菌属(Talaromyces sp.)、Pachykytospora sp.或栓菌属(Trametes sp.)的菌株，其中示例性的实例为黑曲霉、埃默森篮 状菌(Talaromyces emersonii)、瓣环栓菌(Trametes cingulata)或 Pachykytospora papyracea。
以mg酶蛋白质表达，酶变体的投料量可以仅仅是或者甚至低于0.5 mg EP/g DS；仅仅是或者甚至低于0.4mg EP/g DS；仅仅是或者甚至低于 0.3mg EP/g DS；或仅仅是或者甚至低于0.1mg EP/g DS，例如仅仅是或 者甚至低于0.05mg EP/g DS，或者仅仅是或者甚至低于0.02mg EP/g DS 的淀粉底物。第一方面的酶变体可以以0.05-10.0 AFAU/g DS，例如0.1-5.0 AFAU/g DS，例如0.25-2.5AFAU/g DS淀粉的剂量使用。
方法可以包括a)使淀粉底物与包含具α-淀粉酶活性的催化模块和碳水 化合物结合模块的酶变体(例如第一方面的多肽)接触；b)使所述淀粉底物 与所述酶变体在足以实现至少90％或至少92％、至少94％、至少95％、 至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％w/w所述淀粉 底物转换为可发酵糖的温度和一段时间内一起孵育；c)发酵以生产发酵产 品；和d)任选地回收发酵产品。在方法步骤b)和/或c)期间，具有葡糖淀 粉酶活性的酶不存在，或者其存在量为0.001-2.0AGU/g DS、0.01-1.5 AGU/g DS、0.05-1.0AGU/g DS、0.01-0.5AGU/g DS。具有葡糖淀粉酶活 性的酶可以不存在，或者其存在量仅仅是或者甚至低于0.5AGU/g DS；仅 仅是或者甚至低于0.4AGU/g DS；仅仅是或者甚至低于0.3AGU/g DS； 仅仅是或者甚至低于0.1AGU/g DS，例如仅仅是或者甚至低于0.05AGU/g DS淀粉底物。以mg酶蛋白质表达，具有葡糖淀粉酶活性的酶或者不存在， 或者其存在量仅仅是或者甚至低于0.5mg EP/g DS；仅仅是或者甚至低于 0.4mg EP/g DS；仅仅是或者甚至低于0.3mg EP/g DS；或者仅仅是或者 甚至低于0.1mg EP/g DS，例如仅仅是或者甚至低于0.05mg EP/g DS，或 者仅仅是或者甚至低于0.02mg EP/g DS淀粉底物。方法步骤a)、b)、c) 和/或d)可以分开或同时进行。
另一方面，方法可以包括：a)使淀粉底物与经转化以表达包含具α-淀 粉酶活性的催化模块和碳水化合物结合模块的酶变体(例如第一和/或第二 方面的多肽)的酵母细胞接触；b)使所述淀粉底物与所述酵母在足以实现至 少90％w/w所述淀粉底物转换为可发酵糖的温度和一段时间内一起孵育； c)发酵以生产乙醇；和d)任选地回收乙醇。步骤a)、b)和c)可以分开或同 时进行。
再另一方面，方法包括水解糊化的淀粉或颗粒淀粉的浆液，特别是在 低于所述颗粒淀粉的初始糊化温度的温度将颗粒淀粉水解成可溶淀粉水解 物。除了与包含具α-淀粉酶活性的催化模块和碳水化合物结合模块的多肽 (例如第一方面的多肽)接触，淀粉还可以与选自真菌α-淀粉酶(EC 3.2.1.1) 以及一种或多种如下酶：β-淀粉酶(EC 3.2.1.2)和葡糖淀粉酶(EC 3.2.1.3)的 酶接触。在一实施方案中，可向α-淀粉酶变体中进一步添加其他淀粉水解 酶或脱支酶，例如异淀粉酶(EC 3.2.1.68)或普鲁兰酶(EC 3.2.1.41)。
在一实施方案中，所述方法在低于初始糊化温度的温度实施。此类方 法时常在至少30℃、至少31℃、至少32℃、至少33℃、至少34℃、至少 35℃、至少36℃、至少37℃、至少38℃、至少39℃、至少40℃、至少41℃、 至少42℃、至少43℃、至少44℃、至少45℃、至少46℃、至少47℃、至 少48℃、至少49℃、至少50℃、至少51℃、至少52℃、至少53℃、至少 54℃、至少55℃、至少56℃、至少57℃、至少58℃、至少59℃或至少60℃ 实施。实施所述方法的pH可以处于约3.0至约7.0、或约3.5至约6.0、或 约4.0至约5.0的范围。一方面考虑包括发酵的方法，例如，在32℃左右(例 如30-35℃)的温度，例如利用酵母生产乙醇。
另一方面，所述方法包括同时进行的糖化和发酵，例如，在30-35℃(例 如32℃左右)的温度，例如利用酵母生产乙醇或者利用其他适宜的发酵生 物生产期望的有机化合物，
在上述发酵方法中，乙醇含量达到至少约7％、至少约8％、至少约 9％、至少约10％、至少约11％、至少约12％、至少约13％、至少约14％、 至少约15％，例如至少约16％乙醇。
在上述任何方面中使用的淀粉浆可以具有约20％至约55％的干固形 物颗粒淀粉，或约25％至约40％的干固形物颗粒淀粉，或约30％至约35％ 的干固形物颗粒淀粉。在与酶变体接触之后，酶变体将颗粒淀粉中的可溶 性淀粉以至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少 90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、 至少97％、至少98％或至少99％的量转化成可溶性淀粉水解物。
在另一实施方案中，在用于液化、糖化糊化的淀粉(例如但不限于通过 喷射蒸煮进行的糊化)的方法中使用包含具α-淀粉酶活性的催化模块和碳 水化合物结合模块的酶变体(例如第一方面的多肽)。所述方法可以包括发 酵以生产发酵产物例如乙醇。通过发酵由含淀粉原料生产乙醇的此类方法 包括：(i)用包含具α-淀粉酶活性的催化模块和碳水化合物结合模块的多肽 (例如第一方面的多肽)来液化所述含淀粉原料；(ii)糖化所得的液化醪；和 (iii)在发酵生物的存在下发酵步骤(ii)所得的物质。任选所述方法还包括回 收乙醇。所述糖化和发酵的方法可以作为同时糖化和发酵法(SSF法)实施。 发酵期间，乙醇含量达到至少约7％、至少约8％、至少约9％、至少约10％， 例如至少约11％、至少约12％、至少约13％、至少约14％、至少15％， 例如至少16％乙醇。
在上述方面的方法中待加工的淀粉可以特别地来自块茎、根、茎、豆 类、谷物或整个谷粒。更具体地，颗粒淀粉可以获自玉米、玉米芯、小麦、 大麦、黑麦、买罗高梁、西米、木薯、木薯粉、高粱、稻、豌豆、豆、香 蕉或马铃薯。具体考虑的有蜡质及非蜡质类型的玉米和大麦。
上文所述的组合物可用于液化和/或糖化糊化的或颗粒淀粉以及部分 糊化的淀粉。部分糊化的淀粉是在某种程度上糊化的淀粉，即，其中部分 淀粉已经不可逆地溶胀和糊化，而部分淀粉仍以颗粒状态存在。
上文所述的组合物可以包括以0.01-10.0AFAU/g DS、或0.1-5.0 AFAU/g DS、或0.5-3.0AFAU/AGU或0.3-2.0AFAU/g DS的量存在的酸 性α-淀粉酶变体。所述组合物可以应用于任何上文所述的淀粉加工方法 中。
如本文所用，名词或动词形式的术语“液化”表示将淀粉转化为链长较 短且粘性较小的糊精的过程。通常，此过程包括淀粉的糊化，同时或之后 添加α-淀粉酶变体。也可以任选地添加其他液化诱导酶。
如本文所用，术语“初次液化(primary liquefaction)”是指浆液温度升至 或接近其糊化温度时的液化步骤。继温度升高之后，使浆液传送通过热交 换器或喷射蒸煮器达到温度200-300°F，例如220-235°F。继应用热交换器 或喷射器温度之后，使浆液在该温度保持为期3-10分钟。这种保持浆液处 于200-300°F的步骤为初次液化。
如本文所用，术语“二次液化”是指继初次液化(加热至200-300°F)之 后，当浆液被允许冷却至室温时的液化步骤。此冷却步骤可以是30分钟至 180分钟(3小时)，例如90分钟至120分钟(2小时)。
如本文所用，术语“二次液化的分钟数”是指自二次液化开始时起所过 去的时间，即测量DE的时间。
另一方面考虑在包含α-淀粉酶变体的组合物中额外应用β-淀粉酶，β- 淀粉酶(EC 3.2.1.2)是外切产麦芽糖淀粉酶，其催化直链淀粉、支链淀粉以 及相关的葡萄糖聚合物中的1，4-α-糖苷键水解，由此释放麦芽糖。
已经从多种植物和微生物中分离到β-淀粉酶(W.M.Fogarty和C.T. Kelly，PROGRESS IN INDUSTRIAL MICROBIOLOGY，15卷，112-115 页，1979)。这些β-淀粉酶的特征在于具有处于40℃至65℃范围内的最适温 度，以及处于约4.5至约7.0范围内的最适pH。考虑的β-淀粉酶包括但不 限于：来自大麦的β-淀粉酶BBA 1500、DBA， OptimaltTM ME、OptimaltTM BBA(Genencor International，Inc.)；以及 NovozymTM WBA(Novozymes AJS)。
考虑应用在组合物中的另一种酶是葡糖淀粉酶(EC 3.2.1.3)。葡糖淀粉 酶来源于微生物或植物。示例性葡糖淀粉酶为真菌或细菌来源。示例性细 菌葡糖淀粉酶有曲霉属葡糖淀粉酶，特别是黑曲霉G1或G2葡糖淀粉酶 (Boel等人(1984)，EMBO J.3(5)：1097-1102)或其变体，例如WO 92/00381 和WO 00/04136中所公开的；泡盛曲霉葡糖淀粉酶(WO 84/02921)；米曲 霉葡糖淀粉酶(Agric.Biol.Chem.(1991)，55(4)：941-949)或其变体或片段。
其他考虑的曲霉属葡糖淀粉酶变体包括增强热稳定性的变体：G137A 和G139A(Chen等人(1996)，Prot.Eng.9：499-505)；D257E和D293E/Q (Chen等人(1995)，Prot.Eng.8：575-582)；N182(Chen等人(1994)， Biochem.J.301：275-281)；二硫键A246C(Fierobe等人(1996)， Biochemistry，35：8698-8704)；以及在A435和S436位置中引入Pro残基(Li 等人(1997)Protein Eng.10：1199-1204。其他考虑的葡糖淀粉酶包括篮状 菌属葡糖淀粉酶，特别是来源于埃默森篮状菌(WO 99/28448)、Talaromyces leycettanus(美国专利No.RE 32,153)、杜邦篮状菌(Talaromyces duponti)、 嗜热篮状菌(Talaromyces thermophilics)(美国专利No.4,587,215)。考虑的 细菌葡糖淀粉酶包括来自梭菌属(Clostridium)，特别是C. thermoamylolyticum(EP 135138)和C.thermohydrosulfuricum(WO 86/01831)的葡糖淀粉酶。示例性葡糖淀粉酶包括来源于米曲霉的葡糖淀粉 酶，例如与WO 00/04136中SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列具有50％、 55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或甚至90％同源性的葡糖淀 粉酶。还考虑商业葡糖淀粉酶，例如AMG 200L；AMG 300L；SANTMSUPER和AMGTM E(来自Novozymes)；300(来自Genencor International，Inc.)；AMIGASETM和AMIGASETM PLUS(来自DSM)； G900(来自Enzyme Bio-Systems)；G990ZR(黑曲 霉葡糖淀粉酶且低蛋白酶含量)。
可按0.02-2.0AGU/g DS，例如0.1-1.0AGU/g DS或例如0.2AGU/g DS 的量添加葡糖淀粉酶。
也可以考虑在组合物中包括其他酶变体。两种或多种α-淀粉酶变体可 以单独或与本文讨论的其他酶组合使用。例如，第三种酶可以是其他α-淀 粉酶(例如酵母α-淀粉酶)或其他α-淀粉酶变体。这些可以是芽孢杆菌属或 非芽孢杆菌属α-淀粉酶。
可以任选加入的另一种酶是脱支酶，例如异淀粉酶(EC 3.2.1.68)或普 鲁兰酶(EC 3.2.1.41)。异淀粉酶水解支链淀粉和β-极限糊精中的α-1，6-D- 糖苷分支键，并且通过异淀粉酶不能攻击普鲁兰及其对α-极限糊精的有限 作用而能够与普鲁兰酶区别开来。可以按本领域技术人员熟知的有效量加 入脱支酶。
所述方法的产物的确切组成取决于所应用的酶组合以及所加工的颗粒 淀粉的类型。可溶水解产物可以是纯度为至少约85％、至少约90％、至少 约95.0％、至少约95.5％、至少约96.0％、至少约96.5％、至少约97.0％、 至少约97.5％、至少约98.0％、至少约98.5、至少约99.0％或至少约99.5％ 的麦芽糖。可溶淀粉水解产物也可以是葡萄糖，或者淀粉水解物具有至少 94.5％、至少95.0％、至少95.5％、至少96.0％、至少96.5％、至少97.0％、 至少97.5％、至少98.0％、至少98.5、至少99.0％或至少99.5％的DX(葡 萄糖占总溶解的干固形物的百分比)。然而同等考虑的是其产物为特制糖浆 的方法，例如含有葡萄糖、麦芽糖、DP3和DPn的混合物的、用于生产冰 激凌、蛋糕、糖果、罐头水果的特制糖浆。
所考虑的两种碾磨方法包括：湿磨法和干磨法。在干磨法中，碾磨和 使用整个谷粒。湿磨法提供胚芽和粗磨粉(淀粉颗粒和蛋白质)的良好分离， 且除少数例外情况，一般应用在淀粉水解产物用于生产糖浆的场所。干磨 法和湿磨法均为淀粉加工领域公知，且同等地考虑与所公开的组合物和方 法一起使用。所述方法可在超滤体系中进行，其中保留物在酶、粗淀粉和 水的存在下保持再循环，且其中透过物为可溶淀粉水解产物。同等考虑的 是在具有超滤膜的连续膜反应器中进行的方法，其中保留物在酶、粗淀粉 和水的存在下保持再循环，且其中透过物为可溶淀粉水解产物。同样考虑 的是在具有微过滤膜的连续膜反应器中进行的方法，其中保留物在酶、粗 淀粉和水的存在下保持再循环，且其中透过物为可溶淀粉水解产物。
一方面，将该方法的可溶淀粉水解产物转化为基于淀粉的高果糖糖浆 (HFSS)，例如高果糖玉米糖浆(HFCS)。这种转化可利用葡萄糖异构酶(例 如固定在固相支持物上的酶)实现。所考虑的异构酶包括商品IT(Novozymes AJS)；IMGI和G993，G993，G993液体和IGI。
另一方面，所生产的可溶淀粉水解产物出产燃料或饮用乙醇。在第三 方面的方法中，发酵可以与颗粒淀粉浆的水解同时或分开/相继进行。当发 酵与水解同时进行时，温度可以是30℃-35℃，或31℃-34℃。该方法可以 在超滤体系中进行，其中保留物在酶、粗淀粉、酵母、酵母营养物和水的 存在下保持再循环，且其中透过物为含乙醇的液体。同等考虑的是在具有 超滤膜的连续膜反应器中进行的方法，其中保留物在酶、粗淀粉、酵母、 酵母营养物和水的存在下保持再循环，且其中透过物为含乙醇的液体。
所述方法的可溶淀粉水解产物也可以用于发酵产品的生产，包括将所 处理的淀粉发酵成发酵产品，例如柠檬酸、谷氨酸单钠、葡糖酸、葡萄糖 酸钠、葡萄糖酸钙、葡萄糖酸钾、葡萄糖酸内酯或异抗坏血酸钠。
α-淀粉酶变体的淀粉水解活性可以利用马铃薯淀粉作为底物来测定。 此方法基于该酶对改性马铃薯淀粉的降解，且反应后接着将淀粉/酶溶液样 品与碘溶液混合。最初形成黑蓝色，但是在淀粉降解期间，蓝色变弱，逐 渐变成红棕色，将其与有色玻璃标准进行比较。
5.7生物膜去除组合物及用途
组合物可以包括一种α-淀粉酶变体作为主要的酶组分，例如单组分组 合物，用于去除生物膜。或者，组合物可以包括多种酶活性，例如多种淀 粉酶，或酶混合物，包括氨肽酶、淀粉酶(β-或α-或葡糖-淀粉酶)、糖酶、 羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、 脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α- 葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、卤代过氧化物酶(haloperoxidase)、转化酶、 漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶裂解酶、肽谷氨酰胺酶 (peptidoglutaminase)、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、 核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶和/或木聚糖酶，或其任意组合，用于去除生物 膜。其他酶可通过属于如下属或种的微生物生产：曲霉属，例如棘孢曲霉 (Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉、黑曲霉或米曲霉；或木霉属；腐质霉属， 例如特异腐质霉(Humicola insolens)；或镰孢霉属，例如杆孢状镰孢 (Fusarium bactridioides)、Fusarium cerealis、Fusarium crookwellense、大 刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾本科镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤 镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusarium heterosporum)、合欢木镰 孢(Fusarium negundi)、尖镰孢、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰 孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢 (Fusarium sarcochroum)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、Fusarium toruloseum、拟丝孢镰孢(Fusarium trichothecioides)或Fusarium venenatum。
包括α-淀粉酶变体的组合物可以按照本领域已知的方法制备，并且可 以是液体或干组合物的形式。例如，含α-淀粉酶变体的组合物可以是颗粒 或微颗粒的形式。欲包括在组合物中的多肽可以按照本领域已知的方法稳 定化。
下文给出了多肽组合物用途的实例。含α-淀粉酶变体组合物的用量及 组合物使用的其他条件可以基于本领域已知的方法来确定。
还考虑α-淀粉酶变体与2，6-β-D-果聚糖水解酶或其变体一起用在组合 物中。
一种方法是瓦解和/或去除生物膜。如本文所用的术语“瓦解”应理解为 水解生物膜基质中的多糖，该多糖在生物膜中将个体微生物细胞连接并结 合在一起，由此所述微生物细胞能够从生物膜中释放并除去。生物膜存在 于表面，故生物膜的瓦解可以通过用含有α-淀粉酶变体或一种或多种其他 负责降解生物膜的酶(例如但不限于2，6-β-D-果聚糖水解酶)的水性介质接 触表面(例如通过浸没、覆盖或喷洒表面)而实现。组合物可用于水解例 如纸浆业和纸业白水中的腐浆(slime)。
α-淀粉酶变体的存在量可以是0.0001-10,000mg/L，或0.001-1000 mg/L，或0.01-100mg/L，或甚至是0.1-10mg/L。其他酶及酶变体可以以 相似或更低的量存在，这取决于用途以及酶在最终溶液中的溶解度。
该方法可以适宜地在室温至约70℃的温度进行。示例性的温度范围为 约30℃至约60℃，例如约40℃至约50℃。
用于水解生物膜的适宜pH处在约3.5至约8.5的范围内。示例性的范 围包括pH约5.5至约8，例如约6.5至约7.5。用于酶变体有效去除生物 膜的接触时间或反应时间可以变化相当大，这取决于生物膜的特性以及表 面用酶变体单独或组合其他酶如2，6-β-D-果聚糖水解酶处理的频率。例如， 适宜的反应时间为约0.25至约25小时，例如约1至约10小时，例如约2 小时。
可与α-淀粉酶变体和2，6-β-D-果聚糖水解酶组合的其他酶包括但不限 于：纤维素酶，半纤维素酶，木聚糖酶，其他淀粉酶，包括其他α-淀粉酶， 脂肪酶，蛋白酶和/或果胶酶。
所述酶还可以与抗微生物剂组合，例如酶的或非酶的生物杀灭剂。酶 生物杀灭剂可以是例如包括氧化还原酶，例如漆酶或过氧化物酶，特别是 卤代过氧化物酶，和任选的增强剂，例如丁香酸烷基酯，的组合物，例如 专利申请WO 97/42825和DK 97/1273中所描述的那样。
待去除和/或清除生物膜的表面可以是硬表面，其定义涉及基本上微生 物不能透过的任何表面。表面的实例是由金属例如不锈钢合金、塑料/合成 聚合物、橡胶、板材、玻璃、木材、纸、纺织品、混凝土、岩石、大理石、 石膏及陶瓷材料制成的表面，其任选地以例如油漆、珐琅、聚合物等包覆。 从而，表面可以是容纳、运输、处理或接触水性溶液的系统(如供水系统、 食品处理系统、冷却系统、化学处理系统或药物处理系统)的构件。提供了 组合物和使用该组合物在木材加工业如纸浆和/或纸业去除生物膜的方法。 因此，酶变体和含有酶变体的组合物可用于常规的就地清洗(C-I-P)系统。 表面可以是系统单元(如管道、罐、泵、膜、滤器、热交换器、离心机、蒸 发器、混合器、喷雾塔、阀门和反应器)的一部分。表面也可以是医学科学 和工业所用的器具(如污染的内窥镜、假体装置或医学内植物)或其部分。
用于生物膜去除的组合物也可以考虑用于防止当金属表面例如管道受 微生物生物膜攻击时发生的所谓生物腐蚀，即通过瓦解生物膜，由此防止 生物膜中的微生物细胞建立起腐蚀其所附着的金属表面的生物膜环境。
抗生物膜组合物的另一应用是口腔护理。不过，表面还可以是生物来 源的，如粘膜、皮肤、牙齿、毛发、指甲等。
具有牙菌斑的牙齿(例如通过将酶变体掺入牙膏中)以及污染的隐形眼 镜包括在表面内。因此，变体酶可用在组合物和方法中用于制备瓦解人或 动物牙齿上的菌斑的含酶变体药物。另一用途是自粘膜瓦解生物膜，例如 患有囊性纤维化的患者肺中的生物膜。
因此，又另一方面涉及口腔护理组合物，包括纯化的基本上不含任何 活性污染物的重组酶变体。口腔护理组合物可以适宜地包括一定量的重组 酶变体。
用于口腔护理组合物的其他酶包括但不限于口腔护理组合物中的 2，6-β-D-果聚糖水解酶活性。所考虑的酶活性包括选自如下的酶的活性：葡 聚糖酶；齿斑葡聚糖酶(mutanase)；氧化酶，例如葡糖氧化酶，L-氨基酸 氧化酶，过氧化物酶，例如WO 95/10602中所述的鬼伞属过氧化物酶(来 自Novo Nordisk A/S)或乳过氧化物酶，卤代过氧化物酶，特别是衍生自弯 孢霉属(Curvularia sp.)、特别是糙壁弯孢(C.verruculosa)和不等弯孢(C. inaequalis)的卤代过氧化物酶；漆酶；蛋白酶例如木瓜蛋白酶，酸性蛋白 酶(例如WO 95/02044(Novo Nordisk A/S)中所述的酸性蛋白酶)，内切糖苷 酶，脂肪酶，淀粉酶，包括淀粉葡糖苷酶，如AMG(来自Novo Nordisk A/S)； 抗微生物酶，以及它们的混合物。
口腔护理组合物可以具有任何适宜的物理形式(即，粉末、糊、凝胶、 液体、膏、片等)。“口腔护理组合物”包括可用于维持或改善人和动物口中 口腔卫生的组合物，预防龋齿、预防牙菌斑和牙垢形成、去除牙菌斑和牙 垢、预防和/或治疗牙科疾病等。至少在该情况下，口腔护理组合物的确也 包括用于清洁假牙、人工牙齿等的产品。此类口腔护理组合物的实例包括 牙膏、牙霜、凝胶或牙粉、漱牙漱口水、刷牙前后的嗽洗制剂、口香糖、 锭剂和糖果。牙膏和牙凝胶一般包括磨擦抛光材料、发泡剂、矫味剂、保 湿剂、粘合剂、增稠剂、甜味剂、增白剂/漂白剂/去渍剂、水和任选地酶。
嗽口水，包括菌斑去除液体，一般包括水/醇溶液、香料、保湿剂、增 甜剂、发泡剂、着色剂和任选地酶。
磨擦抛光材料也可以掺入到口腔护理组合物如牙粉(膏)中。
从而，磨擦抛光材料可以包括铝及其水合物，例如三水α-氧化铝(alpha alumina trihydrate)；三硅酸镁；碳酸镁；高岭土；铝硅酸盐，例如煅烧硅 酸铝和硅酸铝；碳酸钙；硅酸锆；还有粉状塑料，例如聚氯乙烯；聚酰胺； 聚甲基丙烯酸甲酯；聚苯乙烯；苯酚甲醛树脂；蜜胺甲醛树脂；脲甲醛树 脂；环氧树脂；粉状聚乙烯；氧化硅干凝胶；水凝胶和气凝胶等。同样适 合作为磨料的有焦磷酸钙；水不溶性碱性偏磷酸盐；磷酸二钙和/或其二水 合物，正磷酸二钙；磷酸三钙；羟基磷灰石颗粒等。还可以采用这些物质 的混合物。
根据口腔护理组合物的不同，磨擦产品可以以重量计约0％至约70％， 例如约1％至约70％存在。对于牙膏，磨料含量一般处于以最终牙膏重量 计10％-70％的范围内。
采用保湿剂以防止例如牙膏的水分流失。适合用于口腔护理组合物的 保湿剂包括如下化合物及其混合物：甘油；多元醇；山梨糖醇；聚乙二醇 (PEG)；丙二醇；1，3-丙二醇；1，4-丁二醇；氢化的部分水解多糖等。保湿 剂一般以重量计0％至约80％，例如约5％至约70％存在于牙膏中。
二氧化硅、淀粉、黄芪胶、黄原胶、爱尔兰苔(Irish moss)提取物、藻 酸盐、果胶、纤维素衍生物如羟乙基纤维素、羧甲基纤维素钠和羟丙基纤 维素钠；聚丙烯酸及其盐、聚乙烯吡咯烷酮，可提及作为适宜增稠剂和粘 合剂的实例，它们有助于稳定牙粉(膏)产品。增稠剂在牙膏乳剂和凝胶中 的存在量可以是以终产品重量计约0.1％至约20％，而粘合剂达到约0.01 至约10％的程度。
可以使用阴离子、阳离子、非离子、兼性和/或两性离子表面活性剂作 为发泡剂皂。这些可以以终产品重量计0％至约15％、或约0.1至约13％ 或约0.25％至约10％的水平存在。
表面活性剂仅在其不对本发明的酶施加失活效应的程度上是适宜的。 表面活性剂包括脂肪醇硫酸盐，磺化甘油单酯或具10-20个碳原子的脂肪 酸的盐，脂肪酸-白蛋白缩合产物，脂肪酸酰胺和牛磺酸的盐和/或脂肪酸 羟乙基磺酸酯的盐。
适宜的增甜剂包括制剂用糖精。
香料例如留兰香通常以低含量存在，例如以重量计约0.01％至约5％， 尤其是约0.1％至约5％。
增白剂/漂白剂包括H2O2，且可以以终产品重量计低于约5％，或约 0.25％至约4％的量添加。
增白剂/漂白剂可以是酶，例如氧化还原酶。适宜的牙齿漂白酶的实例 为例如WO 97/06775(来自Novo Nordisk AJS)中描述的那些。
水通常以赋予例如牙膏可流动形式的量添加。
也可以包括其它水溶性抗菌剂，例如二葡萄糖酸氯己定，氨己嘧啶 (hexetidine)，双胍啶(alexidine)，三氯生季铵抗菌化合物， 以及水溶性的某些金属离子源，例如锌、铜、银和锡源(例如，氯化锌、氯 化铜和氯化亚锡，以及硝酸银)。
也可以考虑添加能够用作为氟化物源的化合物、色素/着色剂、防腐剂、 维生素、pH调节剂、防龋剂、脱敏剂等。
可用于口腔护理组合物的其他组分是如上文所述的酶。酶是生命体系 中化学反应的生物催化剂。酶与其作用底物结合在一起形成酶-底物复合物 中间体。这种复合物随之转变为反应产物和释放的酶，该释放的酶继续其 特异性酶促功能。
当酶用于清洁口腔时可提供若干益处。蛋白酶降解唾液蛋白质，这些 蛋白质吸附在牙齿表面并形成薄膜(pellicle)，即所致菌斑的第一层。蛋白 酶连同脂肪酶一起通过裂解构成细菌细胞壁和膜的结构组分的蛋白质和脂 质而破坏细菌。
葡聚糖酶及其他糖酶如2，6-β-D-果聚糖水解酶可以降解细菌所产生的 形成细菌粘附基质的有机骨架结构。蛋白酶和淀粉酶不仅防止牙菌斑形成， 而且还可以通过降解结合钙的糖-蛋白质复合物防止矿化，从而阻止牙垢发 展。
牙膏一般可以包括如下成分(以最终牙膏组合物的重量百分比计)：磨 料至约70％；保湿剂：0％至约80％；增稠剂：约0.1％至约20％；粘合 剂：约0.01％至约10％；增甜剂：约0.1％至约5％；发泡剂：0％至约15％； 增白剂：0％至约5％；和酶：约0.0001％至约20％。
在一个具体实施方案中，牙膏具有在约6.0至约8.0范围内的pH，且 包括：a)约10％至约70％的磨料；b)0％至约80％的保湿剂；c)0.1％至约 20％的增稠剂；d)0.01％至约10％的粘合剂；e)约0.1％至约5％的增甜剂； f)0％至约15％的发泡剂；g)0％至约5％的增白剂；i)约0.0001％至约20％ 的酶。
i)中所述及的酶包括α-淀粉酶变体，单独或组合其他酶如2，6-β-D-果聚 糖水解酶，和任选地已知用于牙膏中的上述其他类型的酶等。
漱口剂一般可以包括如下成分(以最终漱口剂组合物的重量百分比 计)：0％至约20％的保湿剂；0％至约2％的表面活性剂；0％至约5％的 酶；0％至约20％的乙醇；0％至约2％的其他成分(例如香料，增甜剂活性 成分，如氟化物)。组合物还可以含有约0％至约70％的水。
漱口剂组合物可以用适当的缓冲剂进行缓冲，例如pH约6.0至约7.5 的柠檬酸钠或磷酸钠。
漱口剂可以是非稀释的形式(即，用前必须稀释)。
口腔护理组合物可以利用任何口腔护理领域已知的常规方法来生产。
对于本领域技术人员显而易见的是，可以对所述组合物和方法进行多 种改动和变动而不偏离目的用途的精神或范围。因此，所述改变和变动及 其等同体落在所附权利要求书范围内。
实施例
实施例1、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶FRED的A1T变体
来自地衣芽孢杆菌菌株BML 612的FRED为Δamy基因，可扩增 FRED基因位于cat基因座上(具有catR标记)，和Δspo II AC。
为从表达质粒pHPLT(参见例如公开的美国申请No.2006/0014265和 国际PCT申请WO 2005/111203)表达FREDα-淀粉酶，利用引 物LAT(PstI)_FW和LAT(HpaI)_RV通过PCR(聚合酶链式反应)扩增 FREDα-淀粉酶基因：
LAT(PSTI)_FW
5’-GAATGTCTGCAGCTTCAGCAGCAAATCTTAATGGGACGCTGATGCAG-3’(SEQ ID NO：3)
LAT(HPAI)_RV
5’-CCCGGGGTTAACTCATCTTTGAACATAAATTGAAACCGACCCGCCG-3’(SEQ ID NO：4)
PCR在热循环仪上用高保真白金Taq聚合酶(Invitrogen，Carlsbad， Calif.USA)按照生产商的说明进行(退火温度为55℃)。所得的PCR片段用 限制性酶PstI和HpaI消化，并按照厂商(Invitrogen，Carlsbad，Calif.USA) 的说明用T4DNA连接酶连入PstI和HpaI消化的pHPLT中。如美国公 开专利申请US2002/0182734(还参见国际公开WO 02/14490)所述，将连接 混合物转化到枯草芽孢杆菌菌株SC6.1中。共三个克隆产生相对大的晕圈， 这指示高淀粉酶表达。通过DNA序列分析对三个克隆的插入物进行测序。 一个克隆在FRED基因中含有单个突变(可能是由于LAT(PSTI)_FW引 物中的错误所致)，且表达FRED(A1T)淀粉酶。在该克隆中，FRED α-淀粉酶(没有信号序列的成熟链)中编码丙氨酸的第一个密码子 (gca)突变成编码苏氨酸的另一密码子(aca)。
然后将FRED(A1T)基因克隆到pICatH载体(参见例如公开的美国申 请No.2006/0014265和国际PCT申请WO 2005/111203)中。如上文所述通 过PCR扩增FRED(A1T)基因，但使用引物EBS2XhoI_FW和 EBS2XhoI_RV：
EBS2XHOI_FW 5′-ATCCTACTCGAGGCTTTTCTTTTGGAAGAAAATATAGGG-3′(SEQID NO：5)
EBS2XHOI_RV 5′-TGGAATCTCGAGGTTTTATCCTTTACCTTGTCTCC-3′(SEQID NO：6)
所得的PCR片段用限制性酶XhoI消化，并按照厂商(Invitrogen， Carlsbad，Calif.USA)的说明用T4DNA连接酶连入XhoI消化的pICatH 中。如上文所述将连接混合物转化到枯草芽孢杆菌菌株SC6.1中。选择其 中FRED(A1T)基因取向与侧翼catH基因相同的克隆(图2B)。这产生了菌 株SC6.1(pICatH-FRED(A1T)ori1)，且其序列通过DNA测序进行了确认。
将“野生型”FREDα-淀粉酶基因(编码不含A1T突变的 FRED淀粉酶)也克隆到pICatH载体中。利用引物PlatFREDXhoI_FW和 FRED-Tlat_RV通过PCR(聚合酶链式反应)从FREDα-淀粉酶 扩增该FRED基因：
PlatFREDXhoI_FW
5-
`ACCCCCCTCGAGGCTTTTCTTTTGGAAGAAAATATAGGGAAAATGGTACTTGTTAAAAATTCGGAATAT
TTATACAATATCATATGTTTCACATTGAAAGGGGAGGAGAATCATGAAACAACAAAAACGGC-3′(SEQ
ID NO：7)
FRED-Tlat_RV
5′-
GTCGACCTCGAGGTTTTATCCTTTACCTTGTCTCCAAGCTTAAAATAAAAAAACGGATTTCCTTCAGGA
AATCCGTCCTCTGTTAACTCATCTTTGAACATAAATTG-3′(SEQ ID NO：8)
PCR在热循环仪上用Phusion高保真DNA聚合酶(Finnzymes OY， Espoo，Finland)按照生产商的说明进行(退火温度为55℃)。所得的PCR片 段用限制性酶XhoI消化，并如上文所述用T4DNA连接酶连入XhoI消化 的pICatH中。如上文所述将连接混合物转化到枯草芽孢杆菌菌株SC6.1 中。选择其中FRED基因取向与侧翼catH基因相同的克隆(图2A)。该克 隆的序列通过DNA测序进行了确认。将该克隆命名为 SC6.1(pICatH-FREDori1)。
以一式三份的方式从心浸液(Heart Infusion，HI)琼脂板上挑取枯草芽 孢杆菌SC6.1(pICatH-FREDori1)和SC6.1(pICatH-FRED(A1T)ori1)到新 的含0.2％可溶淀粉的HI板上。在37℃生长16小时之后，板用碘溶液染 色，以显现板上淀粉的清除(图3)。菌落周围的晕圈(即清除的淀粉)的大小 是淀粉酶产量的量度，因为FRED(1AT)分子的比活相对于野生型FRED 分子并未改变。表达FRED(A1T)的枯草芽孢杆菌菌株(下方，标记为A1T) 形成的晕圈比表达野生型FRED淀粉酶的相同宿主菌株(上方，标记为wt) 的大。因此，通过在FRED分子中引入A1T突变，可以增加枯草芽孢杆 菌的FRED淀粉酶产量。
实施例2 在地衣芽孢杆菌中表达FRED(A1T)变体
将质粒pICatH-FREDori1和pICatH-FRED(A1T)ori1在许可温度 37℃转化到地衣芽孢杆菌菌株BML612(参见国际PCT申请WO 2005/111203)中。对于各构建体，分别选择新霉素抗性(neoR)和氯霉素抗性 (CmR)转化株，并分别命名为BML612(pICatH-FREDori1)和 BML612(pICatH-FRED(A1T)ori1)。通过在非许可温度(50℃)在具有5 μg/mL氯霉素的培养基中培养菌株，使BML612(pICatH-FREDori1)和 BML612(pICatH-FRED(A1T)ori1)中的质粒整合到地衣芽孢杆菌基因组的 catH区域。对于各构建体，分别选择CmR抗性克隆，并分别命名为 BML612-pICatH-FREDori1和BML612-pICatH-FRED(A1T)ori1。
在无新霉素情况下再次在许可温度培养两菌株几代，以环出载体序列， 然后对于各构建体分别选择新霉素敏感(neoS)但CmR的克隆。在这些克 隆中，染色体上的pICatH载体序列被切除(包括新霉素抗性基因)，而仅留 下了catH-淀粉酶盒。接下来，通过在氯霉素浓度渐增的培养基中培养菌 株来扩增染色体上的catH-淀粉酶盒。在多轮扩增之后，对各构建体分别 选择在淀粉板上产生最大晕圈的克隆(抗75μg/mL氯霉素)。这些菌株随后 分别命名为BML612-FRED和BML612-FRED(A1T)。对两种菌株均进行 14L和3000L规模的典型地衣芽孢杆菌发酵过程。两种规模下FRED(A1T) 发酵均表现出增加的初始酶生产速率和更高的最终滴度。图3显示了三个 3000L实验性发酵的结果，比较了BML612-FRED菌株的典型生产曲线和 BML612-FRED(A1T)菌株的两个曲线。该图显示了最终酶滴度相比于 FREDα-淀粉酶表达菌株显著增加。所用的生长培养基由玉米 浆干固形物和大豆粉(作为有机化合物来源)，连同无机盐(作为钠、钾、 磷酸、镁、硫酸的来源)，以及其他微量元素组成。也包括糖源，如葡萄 糖，作为起始培养基的一部分。一旦培养物已经建立并开始生长，便向罐 中定量供应糖，以维持培养物。定期对发酵罐中培养基的周期取样进行测 量，以利用比色测定法来评估酶滴度。当酶生产速率停止增加时，结束发 酵。
变体蛋白质的特征在于具有如下比活。分析了两个FRED A1T纯化材 料和四个其他的FRED A1T样品，以确定FRED A1T的比活。也分析了 FRED A1T并用作蛋白质标准。进行了SDS-PAGE凝胶电泳、TCA和借 助定氮分析的总蛋白质分析，以及光密度分析。测试了如下样品：
FRED A1T
1)#1- 纯化材料
2)#2- 纯化材料
3)20060100-14L PA轮(run)，“正常”轮，澄清处理
4)
5)20068013，澄清的-第一个3K PA轮，澄清处理
6)20068013，全细胞-第一个3K PA轮，全肉汤
7)20068024，澄清的-第二个3K PA轮，澄清处理
8)20068024，全细胞-第二个3K PA轮，全肉汤
FRED
1)105-01086-002-FRED凝胶参照
2)107-04326-001-FRED-L第1轮
3)101-05330-001-FRED-L第2轮
FRED A1T的比活测定为1317LU/mg活性蛋白质。该结果基于活性/ 调整的TCA蛋白质和具有仅一个FRED A1T样品(其用作蛋白质标准) 的一个凝胶。基于更为近来的工作，FRED A1T样品实际上在该凝胶上过 载了，这使得FRED A1T结果假高。
利用几块不同凝胶(使用至少三个FRED A1T样品)作为标准和对照。 在一些凝胶上还利用牛血清白蛋白(BSA)和LAT作为蛋白质标准。利用两 种不同的方法计算比活：使用活性/调整的TCA蛋白质和使用FRED、LAT和/或BSA作为蛋白质标准。
使用活性/调整的TCA蛋白质的结果与使用蛋白质标准的结果不同。 由于相对于标准得到的结果更接近于对FRED(FRED)和 FRED A1T样品两者的预期，所以在最终的比活确定中未包括活性/调整的 三氯乙酸(TCA)沉淀蛋白质的结果。基于这些实验，FRED A1T具有1323 LU/mg活性蛋白质或0.00076mg/LU的比活，这比1317LU/mg活性蛋白 质或0.00076mg/LU的历史赋值高约2％。
实施例3 增强FRED A1T发酵和纯化的方法
实施例1中获得的样品随之在SDS聚丙烯酰胺凝胶上跑样。对于SDS 聚丙烯酰胺凝胶，FRED和FRED A1T样品基于活性蛋白质值 进行上样。利用0.00076mg活性蛋白质/LU的FRED转换因子 来计算活性蛋白质。利用三氯乙酸(TCA)失活预备样品。凝胶利用常规考 马斯染色。当利用FRED比活值上样所有样品时，FRED和FRED A1T均显示出相似的主带强度，表明变体和亲本株之间的 活性蛋白质/比活极为相似。
利用两个不同的方法计算了比活。首先，通过TCA沉淀蛋白质与凝 胶中的蛋白质纯度(活性带相对于总考马斯反应面积)相乘来确定活性蛋白 质。
在第二个方法中，三批FRED A1T以及LAT和牛血清白蛋白(BSA) 利用其活性蛋白质值进行赋值，并用作标准，所有其他样品与之比较并确 定比活值；这利用来自每个样品的主蛋白质带的原始面积进行。
表1.利用调整的TCA值计算的比活(活性/调整的TCA蛋白质)
注释：FRED蛋白质利用5.78g蛋白质/g氮的转换因子来 计算。FRED A1T利用5.79g蛋白质/g氮的转换因子。“FRED A1T纯”表 示如上文实施例所述的纯化的酶。“全肉汤”表示未澄清的。
利用活性/调整的TCA蛋白质计算给出三轮的平均1315LU/mg比活。 FRED A1T样品范围在1216-2039LU/mg，平均值为1655LU/mg。不同的 A1T轮次在发酵和回收过程中具有许多差异，这可能促成了这些结果的变 异性。
表2.利用FRED(“FRED”)、LAT和BSA作为蛋白质标准计算的比活
“＊”表示比活为从四块凝胶使用3个不同分析和5种不同蛋白质标准(3 种FRED标准以及BSA和LAT标准)获得的平均值。相对于这 些不同蛋白质标准的比活给出了1323LU/mg的FRED结果，这与1299 LU/mg的赋值相似。FRED A1T具有1317LU/mg的比活结果。
实施例4 FRED(A1T)的枯草芽孢杆菌生产
利用枯草芽孢杆菌作为中间宿主以建立A1T和野生型FRED的整合质粒。结果是枯草芽孢杆菌FRED(A1T)多肽相对于野生型 FRED具有增加量的蛋白质产生。
将FRED淀粉酶基因(编码在1位，即X2，具有丙氨酸的 FREDα-淀粉酶)和突变FRED(A1T)基因(编码X2位具有苏氨酸 而非丙氨酸的FRED突变体)克隆在pICatH载体(美国公开No. 20060014265)中，并转化到枯草芽孢杆菌菌株SC6.1(澳大利亚申请No. 20041293826)中。对于FRED和FRED A1T两种构建体，均选 择其中FRED基因取向与侧翼catH基因相同的克隆(图2A和 2B)。这产生了菌株SC6.1(pICatH-FREDori1)和 SC6.1(pICatH-FRED(A1T)ori1)。从心浸液(HI)琼脂板上一式三份挑取两 种菌株到新的含0.2％可溶淀粉的HI板上。在37℃生长16小时之后，板 用碘溶液染色，以观察板上淀粉的清除。菌落周围晕圈(即清除的淀粉)的 大小是α-淀粉酶产量的量度(FRED(1AT)分子的比活相对于野生型 FRED分子并未改变)。图3显示了表达FRED(A1T)的枯草芽 孢杆菌菌株(下，标记为“A1T”)形成的晕圈比表达野生型FRED 的相同菌株(上，标记为“wt”)的大。
根据这些数据，确定了通过在FRED分子中引入A1T突变 可以增加枯草芽孢杆菌的FRED α-淀粉酶产量。
实施例5 LATα-淀粉酶的修饰
所考虑的另一α-淀粉酶是成熟LATα-淀粉酶。该成熟形式可作为与 信号多肽融合的异源蛋白质生产，该信号多肽可以不同于LAT的信号肽 或不源于相同亲本。这将包括在第一个残基处替代为非丙氨酸或缬氨酸的 任何氨基酸。其他修饰可以是第一个残基(以下划线标出的丙氨酸)用替代 该丙氨酸的两个、三个、四个或五个残基取代，其中这些残基中的第一个 是非丙氨酸或缬氨酸的氨基酸。而另一实例是用苏氨酸取代划线标出的丙 氨酸。然后可以如本文所述或本领域已知的那样合成多肽。
ANLNGTLMQY FEWYMPNDGQ HWKRLQNDSA YLAEHGITAV WIPPAYKGTS QADVGYGAYD LYDLGEFHQK
GTVRTKYGTK GELQSAIKSL HSRDINVYGD VVINHKGGAD ATEDVTAVEV DPADRNRVIS GEHLIKAWTH
FHFPGRGSTY SDFKWHWYHF DGTDWDESRK LNRIYKFQGK AWDWEVSNEN GNYDYLMYAD IDYDHPDVAA
EIKRWGTWYA NELQLDGFRL DAVKHIKFSF LRDWVNHVRE KTGKEMFTVA EYWQNDLGAL ENYLNKTNFN
HSVFDVPLHY QFHAASTQGG GYDMRKLLNG TVVSKHPLKS VTFVDNHDTQ PGQSLESTVQ TWFKPLAYAF
ILTRESGYPQ VFYGDMYGTK GDSQREIPAL KHKIEPILKA RKQYAYGAQH DYFDHHDIVG WTREGDSSVA
NSGLAALITD GPGGAKRMYV GRQNAGETWH DITGNRSEPV VINSEGWGEF HVNGGSVSIY VQR(SEQ ID
NO：9)
实施例6FRED的修饰
所考虑的一种α-淀粉酶是成熟FRED。该成熟形式可作为 与信号多肽融合的异源蛋白质生产，所述信号多肽可以不同于LAT的信 号多肽或不源于芽孢杆菌属物种。这将包括用非丙氨酸或缬氨酸的任何氨 基酸取代第一个残基(即丙氨酸)。其他修饰可以是该丙氨酸以两个、三个、 四个或五个残基取代，其中这些残基中的第一个是非丙氨酸或缬氨酸的氨 基酸。而另一实例可以是用苏氨酸取代该下划线标出的丙氨酸，即A1T， 也称为FRED A1T。然后可以如本文所述或本领域已知的那样合成多肽。
FRED与LAT成熟多肽序列相比具有如下突变：M15T、 H133Y、N188S和A209V，所述残基在下面的序列中以下划线标出。第23 个残基处的赖氨酸也可以是精氨酸。
ANLNGTLMQY FEWYTPNDGQ HWKRLQNDSA YLAEHGITAV WIPPAYKGTS 50
QADVGYGAYD LYDLGEFHQK GTVRTKYGTK GELQSAIKSL HSRDINVYGD 100
VVINHKGGAD ATEDVTAVEV DPADRNRVIS GEYLIKAWTH FHFPGRGSTY 150
SDFKWHWYHF DGTDWDESRK LNRIYKFQGK AWDWEVSSEN GNYDYLMYAD 200
IDYDHPDVVA EIKRWGTWYA NELQLDGFRL DAVKHIKFSF LRDWVNHVRE 250
KTGKEMFTVA EYWQNDLGAL ENYLNKTNFN HSVFDVPLHY QFHAASTQGG 300
GYDMRKLLNG TVVSKHPLKS VTFVDNHDTQ PGQSLESTVQ TWFKPLAYAF 350
ILTRESGYPQ VFYGDMYGTK GDSQREIPAL KHKIEPILKA RKQYAYGAQH 400
DYFDHHDIVG WTREGDSSVA NSGLAALITD GPGGAKRMYV GRQNAGETWH 450
DITGNRSEPV VINSEGWGEF HVNGGSVSIY VQR(SEQ ID NO：10)
实施例7 地衣芽孢杆菌野生型Teramyl的修饰
所考虑的另一α-淀粉酶是对地衣芽孢杆菌野生型Teramyl淀粉酶(参 见例如WO 02/10355)的修饰。此α-淀粉酶具有K23R取代。下面的序列图 示了成熟Teramyl淀粉酶。
另一变体可以是在X2处具有取代的R23K形式，或其中在成熟形式中 残基23位为R的序列。这将包括将该成熟α-淀粉酶的第一个残基(下划线 标出的丙氨酸)取代为非丙氨酸或缬氨酸的任何氨基酸。成熟多肽中的第 一个残基实际上是前蛋白质中的第30位残基。其他修饰可以是第一个残基 (下划线标出的丙氨酸)用替代该丙氨酸的两个、三个、四个或五个残基取 代，其中这些残基中的第一个是非丙氨酸或缬氨酸的氨基酸。而另一实例 将会是用苏氨酸取代下划线标出的丙氨酸。然后可以如本文所述或本领域 已知的那样合成多肽。
ANLNGTLMQY FEWYMPNDGQ HWRRLQNDSA YLAEHGITAV WIPPAYKGTS QADVGYGAYD LYDLGEFHQK
GTVRTKYGTK GELQSAIKSL HSRDINVYGD VVINHKGGAD ATEDVTAVEV DPADRNRVIS GEHLIKAWTH
FHFPGRGSTY SDFKWHWYHF DGTDWDESRK LNRIYKFQGK AWDWEVSNEN GNYDYLMYAD IDYDHPDVAA
EIKRWGTWYA NELQLDGFRL DAVKHIKFSF LRDWVNHVRE KTGKEMFTVA EYWQNDLGAL ENYLNKTNFN
HSVFDVPLHY QFHAASTQGG GYDMRKLLNG TVVSKHPLKS VTFVDNHDTQ PGQSLESTVQ TWFKPLAYAF
ILTRESGYPQ VFYGDMYGTK GDSQREIPAL KHKIEPILKA RKQYAYGAQH DYFDHHDIVG WTREGDSSVA
NSGLAALITD GPGGAKRMYV GRQNAGETWH DITGNRSEPV VINSEGWGEF HVNGGSVSIY VQR(SEQ ID
NO：11).
实施例8Sc序列的修饰
考虑在X2(成熟序列中下划线标出的丙氨酸)处进行突变的另一α-淀粉 酶是可用于淀粉加工的Termamyl SC/Sc序列。这将包括第 一个残基(下划线标出的丙氨酸)以非丙氨酸或缬氨酸的任何氨基酸取代。 其他修饰可以是将该丙氨酸替代为两个、三个、四个或五个残基，其中这 些残基中的第一个是非丙氨酸或缬氨酸的氨基酸。然后可以如本文所述或 本领域已知的那样合成多肽。
AAPFNGTMMQ YFEWYLPDDG TLWTKVANEA NNLSSLGITA LWLPPAYKGT SRSDVGYGVY DLYDLGEFNQ
KGTVRTKYGT KAQYLQAIQA AHAAGMQVYA DVVFDHKGGA DGTEWVDAVE VNPSDRNQEI SGTYQIQAWT
KFDFPGRGNT YSSFKWRWYH FDGVDWDESR KLSRIYKFRG KAWDWEVDTE FGNYDYLMYA DLDMDHPEVV
TELKNWGKWY VNTTNIDGFR LDAVKHIKFS FFPDWLSYVR SQTGKPLFTV GEYWSYDINK LHNYITKTNG
TMSLFDAPLH NKFYTASKSG GAFDMRTLMT NTLMKDQPTL AVTFVDNHDT EPGQALQSWV DPWFKPLAYA
FILTRQEGYP CVFYGDYYGI PQYNIPSLKS KIDPLLIARR DYAYGTQHDY LDHSDIIGWT REGGTEKPGS
GLAA ITDGP GGSKWMYVGK QHAGKVFYDL TGNRSDTVTI NSDGWGEFKV NGGSVSVWVP RKTTVS(SEQ
ID NO：12)
实施例9比较FRED A1T和FRED的液化试验
在标准液化试验以及低pH条件下的试验和较低钙条件下的试验中， 对野生型α-淀粉酶FRED与A1T突变体进行了比较。
材料和方法。与野生型相比较，评估了四种A1T样品。淀粉酶在假单 胞菌中发酵。使用如下材料：
Cargill袋装淀粉，批号RM 228B D
Clinton牌106B珍珠玉米淀粉，批号CS4 C20 076 106
TSL 06.275 blip A1T 20060100(澄清的)，活性：18,392，LU/g
TSL 06.276 blip A1T 20060101(澄清的)，活性：20,832，LU/g
TSL 06.277 blip A1T 20068013(全细胞)，活性：16,969，LU/g
TSL 06.278 blip A1T 20068013(澄清的)，活性：22,154，LU/g
(实验室标准)，批号107-05190-001，活性：19,678LU/g
亚硫酸，JT Baker，批号L14635
氯化钙，Fisher，批号006902
对于每组液化，通过向7333.33g反渗透(RO)处理水中添加4666.67g Cargill袋装淀粉来制备35％干固形物(ds)的玉米淀粉浆。利用15.385g 6.5％亚硫酸向此淀粉浆中添加100ppm SO2。钙需要时作为氯化钙二水合 物添加。用碳酸钠将淀粉浆pH调整至期望的pH(5.8或5.4)。淀粉浆通 过100目筛网过滤，并分成2000g的份。在泵过台式蒸煮锅之前大约10 分钟，向每份淀粉浆投放10LU/g(标准品，批号107-05190-001) 或适当的A1T样品。淀粉浆以大约43.33mL/分的速率泵过台式蒸煮锅， 以在109℃达到9分钟的保持时间。液化物随之收集在500mL锥形瓶中， 并在95℃水浴中保持120分钟进行二次液化。在30、60、90和120分钟 收集样品。利用Schoorl还原糖法测定DE。Schoorl还原糖法是基于铜(II) 离子在还原糖和已知过量铜(II)离子的存在下还原为铜(I)离子的测定法。之 后，剩余的铜(II)离子浓度还原乙酸介质中的碘化物离子，形成三碘化物离 子。三碘化物离子随之用标准化的硫代硫酸盐溶液进行滴定。所用的具体 材料和方法如下：10mL广口吸量管，250mL锥形瓶，配有贮液器(10mL 和2mL)的自动分配移液管管理器，变阻式加热器，夹子，烧瓶，安全钳， Fehlings溶液A和B，碘化钾溶液(30％w/v)，硫酸溶液(26％w/v)，硫代 硫酸钠(0.1N)标准化的，淀粉指示剂溶液，葡萄糖(1.00％w/v标准化的)。 碘化钾溶液(30％w/v)通过将150g KI溶于40mL蒸馏水中，加入1.5mL 1N NaOH，定量转移到500mL容量瓶中，并加蒸馏水使之达到刻度来制 备。硫酸(26％w/v)制备如下：边温和搅动边向600mL烧杯的400mL蒸 馏水中缓慢加入72.f mL浓缩硫酸(S.G.1.84)。冷却至室温。定量转移到 500mL容量瓶中，并加蒸馏水使之达到刻度。淀粉指示剂溶液通过将150 g NaCl溶于300mL蒸馏水中并加热至沸腾来制备。然后制备于冷蒸馏水 中含5g(干重)可溶淀粉的淀粉浆。在搅动该热NaCl溶液的同时，缓慢加 入该淀粉浆。使所述组合的混合物煮沸约5分钟，然后冷却至室温。定量 转移到500mL容量瓶中，并加蒸馏水使之达到刻度。并非所有的盐都会 溶解。标准化的葡萄糖、标准化的硫代硫酸钠和Fehlings溶液是购买的。
Schrool方法如下。使加热器彻底热起来，并进行调整使之能在3分 钟内煮沸50mL水。获得醪样品，制备相当于含有47-67mg葡萄糖/mL 的稀释液。例如，将大约15g液化醪(DE＝10-12)或4g糖化醪(DE＝50-60) 稀释到100mL。测定稀释样品的％固形物(％S)。称出250mL锥形瓶的皮 重。移取10mL稀释样品至烧瓶中，并称重(F+S)。边混合边加入15mL 蒸馏水，然后加入10mL Fehlings溶液A和10mL Fehlings溶液B。在加 热器上在3分钟(+/-15秒)内使混合物沸腾。继续再煮沸大约2分钟。立即 用流动的自来水冷却。边混合边加入10mL 30％碘化钾，然后加入10mL 26％硫酸。加入2mL淀粉指示剂并混合。立即用0.1N硫代硫酸钠滴定， 直到蓝色的淀粉-碘复合物消失。不应当持续至少1分钟再出现蓝颜色。记 录滴定体积(TVs)。至于标准，移取5.00mL 1.00％葡萄糖和20mL蒸馏水 至250mL锥形瓶中。所用的水空白为移至另一烧瓶中的25mL蒸馏水。 重复从边混合边加入15mL蒸馏水连同Fehlings溶液A和B各10mL起 开始的步骤。计算方法如下：
结果。当利用台式蒸煮器在109℃进行保留时间9分钟的液化时，四 种样品中每一种都相对于FRED具有改进的DE进程。不过， FRED和A1T FRED变体在pH 5.4比5.8均具有显著的DE(葡 萄糖等同物)形成。对于FRED或A1T变体，向淀粉浆中添加 10 ppm钙对液化并没有显著影响。结论是，淀粉的天然钙含量显然足够高， 能在pH 5.8时稳定各酶。
表3
数据显示所有A1T样品在这些条件下都比标准表现更好。 A1T全细胞样品比其澄清对应物表现更好。不清楚为什么标准 在回归线中产生了非特征性的弯曲，这表明该酶在120分钟的二次液化期 间变性。图4显示了不加钙时A1T样品的DE进程；图5显示DE进程不 受10ppm添加的显著影响，但是A1T仍比对照表现更好。
当pH变至pH 5.4(不添加钙)时，两种酶的稳定性均稍微下降(图6)。 然而，A1T样品平均起来比对照较少受pH减小的影响。
出于所有目的，上面引用的所有参考文献在此整体引入作为参考。
序列表
SEQ ID NO：1合成序列(5个氨基酸)
NH2-X1-X2-X3-X4-Y-COOH
其中X1为大小在18-35个氨基酸范围内的信号序列中最后的氨基酸；
X2为A’-B’，其中当X2为丙氨酸时，A’为非丙氨酸或缬氨酸的任何氨 基酸，而B’为任何氨基酸残基或无氨基酸残基；当X2为缬氨酸、组氨酸 或天冬氨酸时，A’为任何氨基酸，B’为任何氨基酸残基或无氨基酸残基；
X3为天冬酰胺、丙氨酸、组氨酸或甘氨酸；
X4为亮氨酸、甘氨酸、脯氨酸或天冬酰胺；和
Y为成熟细菌α-淀粉酶或α-淀粉酶变体的剩余部分。
SEQ ID NO：2地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(LAT)信号肽(29个氨基酸)
1 MKQQKRLYAR LLTLLFALIF LLPHSAASA
SEQ ID NO：3引物LAT(PSTI)_FW(47个核苷酸)
1 GAATGTCTGC AGCTTCAGCA GCAAATCTTA ATGGGACGCT GATGCAG
SEQ ID NO：4引物LAT(HPAI)_RV(46个核苷酸)
1 CCCGGGGTTA ACTCATCTTT GAACATAAAT TGAAACCGAC CCGCCG
SEQ ID NO：5引物EBS2XHOI_FW(39个核苷酸)
1 ATCCTACTCG AGGCTTTTCT TTTGGAAGAA AATATAGGG
SEQ ID NO：6引物EBS2XHOI_RV(35个核苷酸)
1 TGGAATCTCG AGGTTTTATC CTTTACCTTG TCTCC
SEQ ID NO：7引物PlatFREDXhoI_FW(131个核苷酸)
1 ACCCCCCTCG AGGCTTTTCT TTTGGAAGAA AATATAGGGA
41 AAATGGTACT TGTTAAAAAT TCGGAATATT TATACAATAT
81 CATATGTTTC ACATTGAAAG GGGAGGAGAA TCATGAAACA
121 ACAAAAACGG C
SEQ ID NO：8引物FRED-Tlat_RV(109个核苷酸)
1 GTCGACCTCG AGGTTTTATC CTTTACCTTG TCTCCAAGC
41 TTAAAATAAA AAAACGGATT TCCTTCAGGA AATCCGTCC
81 TCTGTTAACT CATCTTTGAA CATAAATTG
SEQ ID NO：9 LATα-淀粉酶(483个氨基酸)
1 ANLNGTLMQY FEWYMPNDGQ HWKRLQNDSA YLAEHGITAV WIPPAYKGTS
51 QADVGYGAYD LYDLGEFHQK GTVRTKYGTK GELQSAIKSL HSRDINVYGD
101 VVINHKGGAD ATEDVTAVEV DPADRNRVIS GEHLIKAWTH FHFPGRGSTY
151 SDFKWHWYHF DGTDWDESRK LNRIYKFQGK AWDWEVSNEN GNYDYLMYAD
201 IDYDHPDVAA EIKRWGTWYA NELQLDGFRL DAVKHIKFSF LRDWVNHVRE
251 KTGKEMFTVA EYWQNDLGAL ENYLNKTNFN HSVFDVPLHY QFHAASTQGG
301 GYDMRKLLNG TVVSKHPLKS VTFVDNHDTQ PGQSLESTVQ TWFKPLAYAF
351 ILTRESGYPQ VFYGDMYGTK GDSQREIPAL KHKIEPILKA RKQYAYGAQH
401 DYFDHHDIVG WTREGDSSVA NSGLAALITD GPGGAKRMYV GRQNAGETWH
451 DITGNRSEPV VINSEGWGEF HVNGGSVSIY VQR
SEQ ID NO：10合成序列(483个氨基酸)
1 ANLNGTLMQY FEWYTPNDGQ HWKRLQNDSA YLAEHGITAV WIPPAYKGTS
51 QADVGYGAYD LYDLGEFHQK GTVRTKYGTK GELQSAIKSL HSRDINVYGD
101 VVINHKGGAD ATEDVTAVEV DPADRNRVIS GEYLIKAWTH FHFPGRGSTY
151 SDFKWHWYHF DGTDWDESRK LNRIYKFQGK AWDWEVSSEN GNYDYLMYAD
201 IDYDHPDVVA EIKRWGTWYA NELQLDGFRL DAVKHIKFSF LRDWVNHVRE
251 KTGKEMFTVA EYWQNDLGAL ENYLNKTNFN HSVFDVPLHY QFHAASTQGG
301 GYDMRKLLNG TVVSKHPLKS VTFVDNHDTQ PGQSLESTVQ TWFKPLAYAF
351 ILTRESGYPQ VFYGDMYGTK GDSQREIPAL KHKIEPILKA RKQYAYGAQH
401 DYFDHHDIVG WTREGDSSVA NSGLAALITD GPGGAKRMYV GRQNAGETWH
451 DITGNRSEPV VINSEGWGEF HVNGGSVSIY VQR
SEQ ID NO：11合成序列(483个氨基酸)
1 ANLNGTLMQY FEWYMPNDGQ HWRRLQNDSA YLAEHGITAV WIPPAYKGTS
51 QADVGYGAYD LYDLGEFHQK GTVRTKYGTK GELQSAIKSL HSRDINVYGD
101 VVINHKGGAD ATEDVTAVEV DPADRNRVIS GEHLIKAWTH FHFPGRGSTY
151 SDFKWHWYHF DGTDWDESRK LNRIYKFQGK AWDWEVSNEN GNYDYLMYAD
201 IDYDHPDVAA EIKRWGTWYA NELQLDGFRL DAVKHIKFSF LRDWVNHVRE
251 KTGKEMFTVA EYWQNDLGAL ENYLNKTNFN HSVFDVPLHY QFHAASTQGG
301 GYDMRKLLNG TVVSKHPLKS VTFVDNHDTQ PGQSLESTVQ TWFKPLAYAF
351 ILTRESGYPQ VFYGDMYGTK GDSQREIPAL KHKIEPILKA RKQYAYGAQH
401 DYFDHHDIVG WTREGDSSVA NSGLAALITD GPGGAKRMYV GRQNAGETWH
451 DITGNRSEPV VINSEGWGEF HVNGGSVSIY VQR
SEQ ID NO：12 TermamylSc序列(486个氨基酸)
1 AAPFNGTMMQ YFEWYLPDDG TLWTKVANEA NNLSSLGITA LWLPPAYKGT
51 SRSDVGYGVY DLYDLGEFNQ KGTVRTKYGT KAQYLQAIQA AHAAGMQVYA
101 DVVFDHKGGA DGTEWVDAVE VNPSDRNQEI SGTYQIQAWT KFDFPGRGNT
151 YSSFKWRWYH FDGVDWDESR KLSRIYKFRG KAWDWEVDTE FGNYDYLMYA
201 DLDMDHPEVV TELKNWGKWY VNTTNIDGFR LDAVKHIKFS FFPDWLSYVR
251 SQTGKPLFTV GEYWSYDINK LHNYITKTNG TMSLFDAPLH NKFYTASKSG
301 GAFDMRTLMT NTLMKDQPTL AVTFVDNHDT EPGQALQSWV DPWFKPLAYA
351 FILTRQEGYP CVFYGDYYGI PQYNIPSLKS KIDPLLIARR DYAYGTQHDY
401 LDHSDIIGWT REGGTEKPGS GLAALITDGP GGSKWMYVGK QHAGKVFYDL
451 TGNRSDTVTI NSDGWGEFKV NGGSVSVWVP RKTTVS
机译： 通过将n-末端添加到成熟蛋白质淀粉酶上，可以增加淀粉酶的产量。
机译： 通过加入成熟蛋白淀粉酶的N末端来提高淀粉酶的产量
机译： 在成熟的淀粉酶蛋白的n-末端增加淀粉酶的生产。
