一种用于治疗癌症的药物组合物及其信号传导途径

摘要

本发明提供一种治疗妇科癌症、前列腺癌、膀胱癌及肝癌的药物组合物，其具有如式I的黄酮类化合物。该黄酮类化合物具有毒杀癌细胞的活性，并通过调控癌细胞的细胞周期蛋白，将癌细胞停滞于S及G2/M周期。此外，该黄酮类化合物调控caspase－3、PARP、p－38MAPK、JNK1/2等信号传导途径诱导细胞凋亡。该黄酮类化合物能有效地抑制裸鼠的异体移植癌细胞，而没有副作用。该黄酮类化合物与顺双氯双氨络铂对癌细胞具有协同毒杀作用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种治疗癌症的药物组合物，特别是涉及包含新型黄酮类化合物-类黄酮素(Protoapigenone)的药物组合物，其用以治疗妇科癌、前列腺癌等癌症，以及本发明涉及所述药物组合物所诱导的癌细胞信号传导途径的研究。

背景技术

黄酮类化合物(flavonoid或bioflavonoid)是一种多酚化合物(polyphenolic compound)，其能够抑制人类癌细胞生长。黄酮类化合物具有苯基苯并吡喃酮(phenylbenzopyrone)的结构，主要包括黄酮(flavones)、黄烷醇(flavanol)、异黄酮(isoflavone)、黄酮醇(flavonol)、黄烷酮(flavanone)及黄烷酮醇(flavanonol)⁽¹⁹⁾。上述黄酮类化合物可在食用植物、某些药用植物及植物疗法中被发现^(11，20)。某些黄酮类化合物，例如芹菜素(apigenin)、染料木黄酮(genistein)及儿茶酚(catechin)，已被证实具有抑制卵巢癌、乳腺癌、大肠癌、前列腺癌及血癌细胞生长的能力^{(1，2，4，6-8，22-23)}。黄酮类化合物的生物活性包括诱导细胞凋亡(apoptosis)、抑制细胞周期、抑制生长、抑制血管新生(angiogenesis)、抗氧化及上述活性的组合^{(12，16，19)}，这些生物活性通过调节信号传导途径而达到，例如核因子(nuclear factor)-κB(NFκB)、激活蛋白(activator protein)-1或丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated proteinkinases)(MAPKs)^{(5，15，21)}。这意味着黄酮类化合物可为有效的抗癌制剂。

类黄酮素是一种新型黄酮类化合物，具有如式I的结构，其萃取自一种台湾本土蕨类植物——粗毛金星蕨(Thelypteris torresiana，Gaud)。已在中国台湾专利申请第094139201号中公开了类黄酮素的制备方法。此外，类黄酮素已被证明对人类肝癌细胞株(Hep G2和Hep 3B)、人类乳腺癌细胞株(human breast adenocarcinoma cell line)(MCF-7)、人类肺腺癌上皮细胞株(human lung adenocarcinoma epithelial cell line)(A549)及人类乳腺癌细胞株(MDA-MB-231)具有细胞毒杀作用⁽¹⁷⁾，然而，上述专利并未公开类黄酮素是否可抑制其他癌细胞的生长，以及其信号传导途径机制。同时，本领域技术人员也无法由类黄酮素可应用于上述癌症，推知类黄酮素也可抑制其他癌细胞的生长及具有其他生物活性。

式I

妇科癌症(genecological cancer)是发生在女性生殖器官的癌症，包括子宫颈、输卵管(fallopian tubes)、卵巢、子宫、阴道及阴户的癌症。在美国，每年被诊断的八万个新病例中大约有一半是子宫癌。罹患癌症的风险随年龄增加而增加，基因突变或家族遗传也会增加风险。通常紫杉醇(paclitaxel，)和卡铂(paraplatin，)在晚期卵巢癌的初期治疗中效果不错，缓解率达到60-80％，但复发机会高，最后导致高于70％的病患死亡。

前列腺癌(prostate cancer)是常见的恶性肿瘤，并在美国是男性中排名第三大癌症相关死因⁽¹⁰⁾。手术或放射线治疗是低度到中度分化的前列腺癌的主要治疗方法⁽¹⁴⁾。若癌细胞扩散到骨盆之外，则没有有效的治疗前列腺癌的方法。需要依靠化学治疗控制癌细胞的生长。然而，临床使用的化学治疗药物对正常细胞依然具有高度毒性⁽¹⁸⁾。

因此，为了解决妇科癌症及前列腺癌的用药问题，加上由植物萃取的天然药物可克服以化学合成方法合成新药的困难度，黄酮类化合物成为新药开发的新选择。

因此，申请人鉴于已知技术中，因抗药性问题及研发新化学合成药物成本考虑所产生的缺点，经过悉心试验及研究，并本着锲而不舍的精神，终于构思出本发明“用于治疗癌症的药物组合物及其信号传导途径”，能够克服上述缺点，下文中将简要描述。本说明书后附有本发明所引用的参考文献：

发明内容

本发明为了治疗妇科癌症及前列腺癌，以由植物萃取出的黄酮类化合物做为药物组合物，对妇科癌症细胞、前列腺癌细胞及膀胱癌细胞进行体外试验(in vitro)及体内试验(in vivo)，证实该黄酮类化合物毒杀癌细胞的活性及其信号传导途径，提升该黄酮类化合物的的临床应用价值。

本发明提供一种治疗癌症的的药物组合物，其包括如下式I的黄酮类化合物，

式I

其中所述癌症选自由妇科癌症、前列腺癌、膀胱癌及肝癌组成的组的。

根据上述构想，妇科癌症选自由卵巢癌、乳腺癌及宫颈癌组成的组的。

根据上述构想，卵巢癌为MDAH-2774或SKOV3细胞株，乳腺癌为MDA-MB-468、MDA-C33A或T47D细胞株，宫颈癌为HeLa细胞株，前列腺癌为LNCap细胞株，膀胱癌为RT4或T24细胞株，及肝癌为Hep 3B细胞株。

根据上述构想，所述黄酮类化合物萃取自名为粗毛金星蕨(Thelypteristorresiana)的蕨类植物。

根据上述构想，所述黄酮类化合物将癌细胞抑制在S及G2/M细胞周期。

根据上述构想，所述黄酮类化合物调控癌细胞至少一细胞周期蛋白的表达，包括磷酸化细胞周期蛋白B1、细胞周期蛋白B1、磷酸化CdK2、CdK2及Cdc25C。

根据上述构想，所述黄酮类化合物调控癌细胞的半胱天冬酶-3(caspase-3)、聚ADP核糖多聚酶(PARP)、Bcl-xL及Bcl-2蛋白，诱导细胞凋亡。

根据上述构想，所述黄酮类化合物调控癌细胞的p-38 MAPK及c-Jun氨基末端激酶(JNK)1/2蛋白，诱导细胞凋亡。

根据上述构想，该黄酮类化合物还可与如下式II的顺双氯双氨络铂(cis-diamminedichloridoplatinum)联合联合治疗癌症。

式II

根据上述构想，所述药物组合物包括药学上可接受的载体。

根据上述构想，所述黄酮类化合物抑制具有癌症细胞的哺乳动物，所述哺乳动物包括鼠及人。

本发明另涉及一种治疗癌症的药物组合物，其包括如下式I的黄酮类化合物及如下式II的顺双氯双氨络铂。

式I

式II

根据上述构想，所述药物组合物抑制卵巢癌细胞的生长。

附图说明

图1为不同浓度的类黄酮素对卵巢癌细胞的集落形成的影响。

第2(A)图及第2(B)图分别为以不同浓度类黄酮素处理卵巢癌细胞(A)24小时及(B)4小时的细胞周期分布情况。

图3为类黄酮素调控的S及G2/M细胞周期的蛋白表达示意图。

图4(A)为10μM类黄酮素诱导的卵巢癌细胞凋亡关系图。

图4(B)为以10μM类黄酮素处理卵巢癌细胞24小时的亚G1细胞周期关系图。

图5为类黄酮素调控的细胞凋亡的蛋白表达示意图。

图6(A)为以类黄酮素及顺双氯双氨络铂单独或联合处理MDAH-2774细胞的细胞毒杀效果。

图6(B)为类黄酮素与顺双氯双氨络铂单独或联合处理MDAH-2774细胞24小时的蛋白表达示意图。

图7为类黄酮素抑制裸鼠体内MDAH-2774卵巢肿瘤的生长情况。

图8为卵巢肿瘤组织中的被切断的PARP蛋白表达示意图。

图9为不同浓度类黄酮素处理前列腺癌细胞LNCap不同时间后的生长抑制情况。

图10(A)及图10(B)分别为以(A)annexin V-FITC试验法及(B)TUNEL试验法评估类黄酮素诱导的细胞凋亡。

图10(C)为类黄酮素诱导细胞凋亡的蛋白表达示意图。

图11(A)为类黄酮素处理LNCap细胞6及12小时的细胞周期分布。

图11(B)为不同浓度类黄酮素处理LNCap细胞6及12小时后的蛋白表达示意图。

图12(A)及图12(B)为类黄酮素处理LNCap细胞的蛋白表达示意图。

图13(A)为先以SB203580或SP600125处理LNCap细胞，再以类黄酮素处理细胞1小时的蛋白表达示意图。

图13(B)为先以SB203580或SP600125处理LNCap细胞，再以类黄酮素处理细胞12小时的存活细胞比例图。

图14(A)及图14(B)为p38 MAPK抑制剂SB203580和JNK1/2抑制剂SP600125对于(A)类黄酮素诱导的细胞凋亡及(B)细胞周期停滞的效果。

图15(A)为p38MAPK及JNK1/2专一性的小干扰RNA减弱p38 MAPK及JNK1/2的表达示意图。

图15(B)为p38MAPK siRNA及JNK1/2 siRNA抑制细胞凋亡的比例。

图15(C)为p38 MAPK及JNK1/2小干扰RNA抑制类黄酮素诱导的细胞凋亡的细胞周期分布关系图。

图15(D)为p38 MAPK及JNK1/2小干扰RNA抑制类黄酮素诱导的细胞蛋白表达示意图。

图16(A)为腹腔注射类黄酮素至异种移植LNcap细胞的裸鼠的时间与肿瘤大小关系图。

图16(B)为腹腔注射低剂量及高剂量类黄酮素至异种移植LNcap细胞的裸鼠前列腺肿瘤的被切断的PARP、p-p38 MAPK及p-JNK1/2的蛋白表达示意图(图16(B))

图17(A)至图17(C)为不同浓度类黄酮素处理癌细胞(A)RT4、(B)T24及(C)Hep 3B不同时间后的生长抑制情况。

图18为类黄酮素抑制人类宫颈癌细胞株HeLa的细胞周期分布情况。

具体实施方式

本发明所提的“一种用于治疗癌症的药物组合物及其信号传导途径”可由以下实验说明而得到充分了解，可为本领域技术人员提供参考，但仅为示例，不是对本发明范围的限制。

细胞学实验

一、实验材料：

类黄酮素萃取自整株粗毛金星蕨⁽¹⁷⁾，并溶解于二甲亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO)中。实验时，以1000倍稀释加入培养的细胞。

本发明所使用的妇科癌症细胞株如下所示：(1)人类卵巢癌细胞株(immortalized non-cancer hamah breast epithelial cell line)(MDAH-2774及SKOV3)、乳腺癌细胞株(MDA-MB-468、MDA-C33A及T47D)、宫颈癌细胞株(HeLa及C33A)及永生化非癌症人类乳腺上皮细胞株(MCF-10A)，其购自美国典型菌株保存中心(American Type Culture Collection，ATCC，Manassas，VA)，并且培养于添加了10％胎牛血清及青霉素(penicillin)/链霉素(streptomycin)/两性霉素B(amphotericin B)的DMEM-F12培养基中；及(2)永生化人类卵巢癌表面上皮细胞株(human ovarian surface epithelial，HOSE)(HOSE 6-3及HOSE 11-12)，其由香港大学曹世华教授(Prof.GSW Tsao)提供，并培养于添加了10％胎牛血清及青霉素/链霉素/两性霉素B的MCDB105及M199混合培养基(1∶1体积比混合)(Sigma，St.Louis，MO)中。

本发明使用的人类前列腺癌细胞株(LNCap)购自美国典型菌株保存中心，培养于添加了10％胎牛血清及青霉素/链霉素/两性霉素的RPMI 1640培养基中。LNCap细胞分别以2.5、5及10μM的类黄酮素处理并加以分析。在某些实验中，LNCap细胞在经类黄酮素处理前，先以p38 MAPK抑制剂SB203580或JNK1/2抑制剂SP600125处理1小时。

二、实验方法：

1.XTT细胞增殖(XTT cell proliferation assay)及选殖法：

在96孔盘的每一个孔种入7×10³个细胞，再以不同浓度(2.5、5及10μM)的类黄酮素处理12、24和/或48小时的后，以XTT细胞增殖检测法(XTT cellproliferation assay)(Sigma，St.Louis，MO)测定类黄酮素的细胞毒性。以酵素免疫分析仪测定波长490nm及650nm时的吸光值，并以OD₄₉₀-OD₆₅₀值计算50％的抑制浓度(IC₅₀)⁽³⁾。此外，为了测定长时间使用类黄酮素的效果，以不同浓度的类黄酮素处理细胞3小时，再以新鲜培养基培养细胞14天以形成细胞集落(colony)，最后以结晶紫将细胞染色并观察。

2.细胞存活试验：

不同细胞周期的SKOV3细胞培养于6厘米细胞培养皿中，并以不同剂量(0、5或10μM/ml)的类黄酮素处理SKOV3细胞后，收集细胞并与台盼蓝以1∶1体积比混合。用显微镜检视被染色的凋亡细胞。

3.细胞周期及亚G1期分析：

以不同浓度的类黄酮素(0、2.5、5及10μM)分别处理卵巢癌细胞24小时及前列腺癌细胞6或12小时，以胰蛋白酶(trypsin)收集细胞并以70％乙醇固定细胞1小时，再以磷酸缓冲溶液(PBS)清洗2次，并悬浮于碘化丙锭(propidium iodide，PI)/核醣核酸酶A(RNase A)溶液中30分钟。通过碘化丙锭染色DNA的作用机制，以流式细胞仪(FACScan flow cytometry，BectonDickinson，San Jose，CA)检测细胞周期及亚G1的分布，并以CellQuest软件(BS Biosciences)分析数据。

4.Annexin V细胞凋亡分析：

本实验原理为在细胞凋亡进程时以annexin V检测早期的凋亡细胞。将卵巢癌细胞及前列腺癌细胞分别与10μM类黄酮素共同培养于腔室玻片中3小时，先以冰的PBS清洗细胞2次，再于25℃以含有annexin V-FITC(1mg/ml；Strong Biotech，Taipei，Taiwan)及4′，6-二脒-2-苯基吲哚(Sigma)的混合溶液染色15分钟，再以PBS清洗细胞2次，以荧光显微镜观察被染色的细胞。

5.末端脱氧核苷酸转移酶介导dUTP缺口末端标记法(TUNEL)试验法：

TUNEL试验法是检测检测DNA是否断裂成片段。以不同浓度(2.5、5及10μM)的类黄酮素处理前列腺癌细胞12或24小时，再以DeadEnd比色法TUNEL系统(Promega，Madison，WI)的TUNEL染色。步骤为：在类黄酮素处理前列腺癌细胞后，将癌细胞固定于4％的三聚甲醛(paraformaldehyde)中30分钟，再将固定的细胞与地高辛扼合的dUTP及核苷酸混合物共同置于37℃的湿润环境下进行重组末端脱氧核苷酸转移酶催化反应。之后，再加入终止溶液于37℃作用15分钟。以PBS清洗细胞，再置于二氨基联苯胺(DAB)溶液并于暗处反应15分钟。以显微镜观察被染色的细胞。计数1,000个细胞以得知TUNEL阳性细胞的比例，并计算后期的细胞凋亡指数。

6.免疫印迹分析：

将经过不同浓度(0、2.5、5及10μM)的类黄酮素处理24小时的细胞清洗2次，以EBC缓冲溶液(50mM Tris(pH 7.6)，120mM NaCl，0.5％NonidetP-40，1mM β-巯基乙醇，50mM NaF，和1mM Na₃VO₄)打破细胞，并以Bio-Rad蛋白试剂盒测定蛋白浓度。以聚丙烯酰胺(polyacrylamide SDS)凝胶解析细胞总蛋白，再将被解析的蛋白印迹到硝化纤维膜。依序用专一性结合的一抗、过氧化酶标示的二抗识别蛋白，再以增强的化学发光检测系统(Amersham，NJ，USA)检测蛋白强度。

7.裸鼠模型：

将0.1ml PBS中具有的2×10⁶个MDAH-2774人类卵巢癌细胞(或1×10⁶个LNCap前列腺癌细胞)皮下注射至6周龄母裸鼠(Foxnlun/Foxnlnu)右腋下。当肿瘤可见时(约3×3mm)，将裸鼠随机分组，并每隔一天腹腔注射类黄酮素或控制组。在异种移植MDAH-2774卵巢癌细胞这一组中，控制组、低剂量组及高剂量组分别为PBS、每克裸鼠体重0.069μM类黄酮素(该剂量等同于MDAH-2774的IC₅₀的十分之一)及每克裸鼠体重0.69μM类黄酮素(该剂量等同于MDAH-2774的IC₅₀)；在异种移植LNCap前列腺癌细胞这一组中，控制组、低剂量组及高剂量组分别为PBS、每克裸鼠体重0.37μM类黄酮素(该剂量等同于LNCap的IC₅₀的十分的一)及每克裸鼠体重3.7μM类黄酮素(该剂量等同于LNCap的IC₅₀)。每周以测径器测量肿瘤大小并测量体重，并以公式“宽度²×长度/2”计算肿瘤体积。异种移植LNCap前列腺癌细胞这一组的裸鼠在施用类黄酮素五周后以深麻醉处死，并立即取血液样本。以Sysmex XE-2100(TOA Medical Electronics，Kobe，Japan)计数裸鼠血球数目，以Beckman LX20(Beckman-coulter，Fullerton，USA)测量血尿素氮、肌酐、天门冬氨酸转氨酶(asparatate aminotransferase，AST)及丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)含量。

8.小干扰RNA基因敲减(siRNAknockdown)：

本实验原理为用专一性的小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)(Santa Cruz Biotechnology，Inc.)敲减LNCap细胞的p38 MAPK及JNK1/2表达，其是使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)进行转染(transfection)而完成。将LNCap细胞培养48小时后，以类黄酮素处理LNCap细胞，再收集被处理的细胞进行分析。

9.免疫组织化学分析：

组织样本以10％甲醛或4％三聚甲醛固定⁽²⁶⁾后，再切片、脱水、以蜡包埋。样本切片厚度为3m或4m，以苏木紫-伊红或以单株抗体进行免疫染色，再以Universal LAB+试剂盒/辣根过氧化酶(HRP)(horseradishperoxidase)(Dako Denmark A/S，Glostrup，Denmark)标定，或以苏木紫(hematoxylin)逆染色。于显微镜下观察细胞。

三、实验结果：

1.以类黄酮素抑制卵巢癌细胞：

请参见见表1，为类黄酮素对不同癌细胞株的细胞毒性。在表1中，类黄酮素对卵巢癌细胞(MDAH-2774及SKOV3)具有最强的细胞毒性，但是对永生化人类卵巢癌表面上皮细胞株(HOSE 6-3及HOSE 11-12)的细胞毒性较低。相同的结果也可对应于乳腺癌细胞株(MDA-MB-468及T47D)与永生化非癌症人类乳腺上皮细胞株(MCF-10A)。

此外，请参见图1，为不同浓度的类黄酮素对卵巢癌细胞的集落形成的影响。在图1中，随着类黄酮素浓度增加，MDAH-2774及SKOV3集落形成的比例越低。由表1及图1可知，类黄酮素对卵巢癌细胞MDAH-2774及SKOV3具有毒性且可抑制其生长，但对永生化非卵巢癌上皮细胞没有毒性，表示类黄酮素对卵巢癌细胞具有选择性的细胞毒性。

表1、类黄酮素对不同细胞株的细胞毒性

^a三次独立实验的平均±标准偏差

请参见图2(A)，为以不同浓度类黄酮素处理卵巢癌细胞24小时的细胞周期分布情况。在图2(A)中，类黄酮素明显地使进入S及G2/M周期的MDAH-2774及SKOV-3细胞增加，而且随着类黄酮素浓度增加，进入S及G2/M细胞周期的细胞也随之增加。请参见图2(B)，为以不同浓度类黄酮素处理SKOV3细胞4小时的细胞周期分布及存活细胞的比例。在图2(B)中，当以5及10μM类黄酮素分别处理SKOV3细胞后，在S、G2及M细胞周期增生的SKOV3细胞数量分别降低23.5％及45.4％，20.3％及34.7％，及44.8％及70.5％。

请参见图3，为类黄酮素调控的S及G2/M细胞周期的蛋白表达示意图。在图3中，MDAH-2774及SKOV3细胞的p-Cdk2、Cdk2、p-细胞周期蛋白B1(ser¹⁴⁷)及细胞周期蛋白B1蛋白表达量随着类黄酮素浓度增加而下降，而p-Cdc25C(ser²¹⁶)表达量则上升。由于Cdk2、细胞周期蛋白B1及Cdc25C属于抑制与调节细胞周期的蛋白，在过去的研究中，Cdc25C(Ser²¹⁶)的磷酸化结合至14-3-3家族的蛋白，而且被隔离于细胞质中，而防止了不成熟的有丝分裂⁽⁹⁾。而细胞周期蛋白B的磷酸化是进入M周期所需的，且需要Cdc25C作用⁽²⁴⁾。由图3可知，类黄酮素增加Cdc25(Ser²¹⁶)的磷酸化，并降低Cdk(Thr¹⁶¹)、细胞周期蛋白B1(Ser¹⁴⁷)的表达。因此由图2(A)、图2(B)及图3可知，类黄酮素对SKOV3在S及G2/M周期具有明显的细胞毒性，类黄酮素不仅使SKOV3的细胞周期停滞于S及G2/M周期，也在这些周期对SKOV3细胞造成更大的细胞毒性。类黄酮素的确是通过调控卵巢癌细胞的细胞周期蛋白表达而停滞其细胞周期。

细胞凋亡的定量评估原理是以annexin V-FITC试剂检测胞质微区(cytoplasmic leaflet)的磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine)迁移至细胞表面。请参见图4(A)，为10μM类黄酮素诱导的卵巢癌细胞凋亡关系图。在图4(A)中，与对照组相比较，以10μM类黄酮素处理卵巢癌细胞3小时将分别导致24.5％的MDAH-2774及34.2％的SKOV3的细胞凋亡。请参见图4(B)，为以10μM类黄酮素处理卵巢癌细胞24小时的亚G1细胞周期关系图。在图4(B)中，随着类黄酮素浓度增加，MDAH-2774及SKOV-3细胞的亚G1峰值也随之增加。

请参见图5，为类黄酮素调控的细胞凋亡的蛋白表达示意图。由于被切断的PARP蛋白是细胞凋亡的标志，且由caspase-3活化，而caspase-3又由Bcl-2家族蛋白调控。所以，在图5中，类黄酮素降低卵巢癌细胞的Bcl-2及Bcl-xL表达，活化caspase-3及切断完整的PARP而诱导细胞走向凋亡。此外，类黄酮素能增加Bad及Bax表达。

在过去的临床研究中，顺双氯双氨络铂是一种常见的、基于铂的抗癌药物或化疗药物，用以治疗包括肉瘤(sarcoma)、小细胞肺癌、卵巢癌、淋巴癌及生殖细胞肿瘤(germ cell tumor)等癌症。顺双氯双氨络铂在细胞内会形成与DNA结合或交互结合的铂复合物，最终开启细胞凋亡程序或自动细胞死亡。因此，将类黄酮素与顺双氯双氨络铂混合成药物组合物，研究该药物组合物是否具有协同的(synergistic)细胞毒杀效果。请参见图6(A)，为以类黄酮素及顺双氯双氨络铂单独或联合处理MDAH-2774细胞的细胞毒杀效果。在图6(A)中，1及2.5μM的类黄酮素(在此简称PA)分别抑制24.96％及53.36％的细胞生长，而5及10μM的顺双氯双氨络铂(在此简称CIS)亦分别抑制28.48％及36.91％的细胞生长。当1μM类黄酮素分别与5及10μM顺双氯双氨络铂组合成药物组合物时，则可分别抑制39.73％及55.40％的细胞生长。当类黄酮素浓度增加为2.5μM时且分别与5及10μM顺双氯双氨络铂组合成药物组合物时，则可分别抑制72.02％及82.65％的细胞生长。由此可知，类黄酮素不仅可以单独抑制卵巢癌细胞的生长，还可与顺双氯双氨络铂组合成药物组合物，显现出更强的毒杀细胞能力。

式II

请参见图6(B)，为类黄酮素与顺双氯双氨络铂单独或联合处理MDAH-2774细胞24小时的蛋白表达示意图。在图6(B)中，与不经类黄酮素及顺双氯双氨络铂处理，或单独以类黄酮素或顺双氯双氨络铂处理的组比较，经过1μM类黄酮素与5μM顺双氯双氨络铂处理的细胞可诱导完整的PARP被切断，并且活化caspase-3的活性。

请参见图7，为类黄酮素抑制裸鼠体内MDAH-2774卵巢肿瘤的生长情况。在图7中，与施用PBS的对照组相比，低剂量与高剂量的类黄酮素可显著地抑制裸鼠体内的卵巢肿瘤生长。请参见表2，为以类黄酮素腹腔注射裸鼠7周后的体重、全血计数及血液生化测试结果。在表2中可发现，腹腔注射类黄酮素并不会明显地损害裸鼠的造血能力、肝功能、肾功能。

将上述裸鼠处死后，摘取其体内的MDAH-2774肿瘤，进行免疫印迹及免疫组织化学分析，评估其细胞凋亡情况。请参见图8，为卵巢肿瘤组织中的被切断的PARP蛋白表达示意图。在图8中，被切断的PARP在经过类黄酮素处理的卵巢肿瘤组织中表达，但并未在控制组中表达。此外，类黄酮素诱导异种移植MDAH-2774的细胞凋亡，而且被切断的PARP的细胞核表达(nuclear expression)在经过类黄酮素处理的肿瘤组织明显增加(结果未显示)。

2.以类黄酮素抑制前列腺癌细胞：

请参见图9，为不同浓度类黄酮素处理前列腺癌细胞LNCap不同时间后的生长抑制情况。在图9中，类黄酮素抑制LNCap细胞生长的能力随着时间及类黄酮素浓度增加而增加。以类黄酮素处理48小时可得到最大的抑制效果，其IC₅₀值为3.7±0.2μM。而经类黄酮素处理12及24小时的细胞呈现收缩状态(结果未显示)。

请参见图10(A)，为以annexin V-FITC试验法评估类黄酮素诱导的细胞凋亡。在图10(A)中，以10μM类黄酮素处理LNCap细胞3小时后，annexinV-FITC阳性细胞的比例增加为24.2±1.3％，而对照组只有2.7±1.0％。请参见图10(B)，为以TUNEL试验法评估类黄酮素诱导的细胞凋亡。在图10(B)中，TUNEL阳性细胞的比例随着时间及类黄酮素剂量增加而增加。请参见图10(C)，为类黄酮素诱导细胞凋亡的蛋白表达示意图。在图10(C)中，被切断的PARP及被切断的caspase-3蛋白表达随着类黄酮素剂量及作用时间而增加。

请参见图11(A)，为类黄酮素处理LNCap细胞6及12小时的细胞周期分布。在图11(A)中，类黄酮素使LNCap细胞停滞在S及G2/M细胞周期，抑制了细胞周期程序的进行。请参见图11(B)，为不同浓度类黄酮素处理LNCap细胞6及12小时后的蛋白表达示意图。在图11(B)中，Cdk2的表达随着类黄酮素剂量及作用时间增加而增加。在类黄酮素处理6小时后，活化的p-细胞周期蛋白B1(Ser¹⁴⁷)表达量降低；然而，在类黄酮素处理12小时后，活化的p-细胞周期蛋白B1(Ser¹⁴⁷)及细胞周期蛋白B1表达量皆降低。在类黄酮素处理6及12小时后，不活化的p-Cdc25C(Ser²¹⁶)表达量皆增加。

某些黄酮类化合物(包括(-)-epigallocatechin gallate(一种儿茶素，简称EGCG)及芹菜素)被发现其抗癌活性与MAPK调控路径有关^(13，25)。因此，经过类黄酮素处理的LNCap细胞是否也会参与MAPK调控路径也被加以研究。请参见图12(A)及图12(B)，为类黄酮素处理LNCap细胞的蛋白表达示意图。在图12(A)及图12(B)中，以类黄酮素处理LNCap细胞1小时将导致p38 MAPK及JNK1/2的磷酸化显著地增加。而KAPK激酶(MKK)3/6及MKK4是p38 MAPK及JNK1/2上游的激酶，MKK3/6及MKK4的磷酸化(即p-MKK3/6(ser^189/270)及p-MKK4(thr²¹⁶))也因此增加。另外，MKK3/6、MKK4、p38 MAPK及JNK1/2蛋白的整体表达并不受类黄酮素处理的影响，ERK1/2的磷酸化亦不受影响(结果未显示)。

为了评估p38 MAPK及JNK1/2的活化在类黄酮素诱导的细胞凋亡角色，先将p38 MAPK抑制剂SB203580及JNK1/2抑制剂SP600125分别处理LNCap细胞1小时，再以类黄酮素处理LNCap细胞(图13(A))。当SB203580及SP600125分别存在时，由类黄酮素诱导的p-38 MAPK及JNK1/2磷酸化(即活化)将被阻断。请参见图13(B)，为先以SB203580及SP600125分别处理LNCap细胞，再以类黄酮素处理细胞12小时的存活细胞比例图。在图13(B)中，经过SB203580及SP600125分别处理、再以类黄酮素处理的LNCap细胞的存活率皆比只经过类黄酮素处理的LNCap细胞的存活率高，表示p38 MAPK及JNK1/2的去活化可使被类黄酮素抑制的LNCap细胞增殖。

进一步研究p38 MAPK和JNK1/2的活化是否涉及由类黄酮素诱导的细胞凋亡及细胞周期停滞。请参见图14(A)及图14(B)，为p38 MAPK抑制剂SB203580和JNK1/2抑制剂SP600125对于类黄酮素诱导的细胞凋亡及细胞周期停滞的效果。在图14(A)中，SB203580和SP600125会降低因类黄酮素诱导的凋亡细胞比例。此外，SB203580和SP600125会抑制被切断的caspase-3蛋白表达。在图14(B)中，SB203580显著地降低因类黄酮素诱导的S及G2/M细胞周期停滞，但SP600125并没有这样的能力。当SB203580存在时，会使p-Cdc25C(Ser²¹⁶)表达降低，Cdk2表达增加；而SP600125对以类黄酮素诱导的细胞周期停滞没有显著地影响(结果未显示)。

为了进一步研究p38MAPK及JNK1/2在类黄酮素诱导的细胞凋亡的角色，分别以p38 MAPK及JNK1/2专一性的小干扰RNA(siRNA)敲减p38MAPK及JNK1/2的表达(图15(A))。再者，p38MAPK siRNA及JNK1/2siRNA皆可抑制类黄酮素诱导的细胞凋亡(图15(B))。请参见在图15(C)中，p38 MAPK siRNA选择性地抑制因类黄酮素诱导的S及G2/M细胞周期停滞，然而JNK1/2 siRNA并不具这样的能力。此机制是通过调控Cdk2及不活化的p-Cdc25C(Ser²¹⁶)表达而达成(图15(D))。上述结果与第14图的结果一致。

为了测试类黄酮素在生物体内是否能抑制前列腺癌细胞的生长，将LNCap细胞皮下注射至裸鼠右腋下，并以腹腔注射类黄酮素，分析类黄酮素抑制肿瘤增殖的能力。请参见图16(A)，为腹腔注射类黄酮素至异种移植LNcap细胞的裸鼠的时间与肿瘤大小关系图。在图16(A)中，注射后5周，高剂量及低剂量的平均肿瘤尺寸(分别为1153.0±218.7mm³及1876.9±428.6mm³)显著地比控制组的平均肿瘤大小(3409.8±704.8mm³)小。而且没有造成显著的造血能力、肝功能、肾功能的损伤。高剂量、低剂量与控制组间也没有明显的体重差异(表3)。此外，低剂量组及高剂量组的被切断的PARP、p-p38 MAPK及p-JNK1/2的蛋白表达皆比控制组高(图16(B))。未磷酸化的p38 MAPK及JNK1/2蛋白表达并未因类黄酮素的作用而改变(结果未显示)。

由上述结果可知，以类黄酮素处理前列腺癌细胞LNCap可活化p38MAPK及JNK1/2信号传导途径，增加被切断的PARP及caspase-3表达，最终诱导细胞凋亡。本发明也证实了p38 MAPK及JNK1/2的活性可分别被其抑制剂SB203580和SP600125抑制及被专一性的siRNA抑制，减少细胞凋亡及降低被切断的caspase-3活性。因此，本发明证实了p38 MAPK及JNK1/2在类黄酮素诱导的细胞凋亡扮演重要角色。

在本发明中，被活化的p38 MAPK及JNK1/2导致细胞周期停滞于G1/S或G2/M周期，其是通过增加不活化的p-Cdc25C(Ser216)及减少p-细胞周期蛋白B1(Ser147)及Cdk2达成。

3.以类黄酮素抑制其他癌细胞：

除了卵巢癌及前列腺癌外，本发明也以膀胱癌、肝癌及宫颈癌为研究对象，研究类黄酮素是否也会抑制这些癌细胞的生长。首先，类黄酮素对人类膀胱移行细胞乳头状瘤(human urinary bladder transitional cell papilloma)RT4(ATCC号：HTB-2)、T24(ATCC号：HTB-4)及人类肝癌细胞株Hep 3B(ATCC号：HB-8064)的细胞毒性(IC₅₀)分别为5.105±3.25μM、5.52±0.598μM及1.86±0.656μM。请参见第17(A)、17(B)及17(C)图，为不同浓度类黄酮素处理癌细胞(A)RT4、(B)T24及(C)Hep 3B不同时间后的生长抑制情况。在图17(A)中，4μM及8μM类黄酮素处理RT4细胞24及48小时皆可降低存活细胞比例，然而低浓度(0.5、1及2μM)类黄酮素的存活细胞比例超过100％，推测低浓度类黄酮素会刺激细胞的生长。在图17(B)及图17(C)中，类黄酮素对T24及Hep 3B细胞的生长抑制呈现剂量依赖效应及时间依赖效应。

请参见图18，为类黄酮素对人类宫颈癌细胞株HeLa的细胞周期分布情况。在图18中，类黄酮素能将HeLa细胞停滞在G2/M周期，将阻断HeLa细胞的细胞分裂，而使HeLa细胞进入细胞凋亡。

综上所述，本发明以类黄酮素处理卵巢癌细胞、前列腺癌细胞、膀胱癌细胞、肝癌细胞及宫颈癌细胞，可有效诱导细胞凋亡，并证实其信号传导途径，而且通过动物试验，证实类黄酮素对裸鼠没有显著的肝毒性、肾毒性、血液毒性，意味着类黄酮素可成为应用于人或其他哺乳动物的化学治疗药物。另外，本发明的类黄酮素可与顺双氯双氨络铂联合制成药物组合物，达到有效的癌症治疗效果。本发明的类黄酮素可与药学上可接受的载体制成可传输药物的药物剂型。本发明实属难能可贵的创新设计，深具产业价值，依法提出申请。

本发明可由本领域技术人员作出各种修饰，但不脱离本发明的保护范围。

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