抗肿瘤疫苗、其制备方法以及抗肿瘤免疫疗法

摘要

本发明涉及医疗技术，尤其涉及肿瘤患者的免疫治疗。抗肿瘤疫苗以表面肿瘤抗原为基础，包含表面肿瘤抗原混合物。包括培养肿瘤细胞和分离表面肿瘤抗原。将预先从生长培养基上洗脱的肿瘤细胞进行原代培养，用蛋白酶对肿瘤细胞进行不使细胞死亡的处理，收集释放的表面抗原。在一段时间间隔后，用蛋白酶重复处理原代培养的活体肿瘤细胞，该时间间隔足以使得细胞表面肿瘤抗原得到恢复。积聚表面肿瘤抗原，直至达到足够的疫苗剂量，控制表面肿瘤抗原的组成。蛋白酶可以采用胰蛋白酶。本发明所提供抗肿瘤治疗的方法，包括向患者体内注入抗肿瘤疫苗。本发明所达到的技术效果包括通过强化抗肿瘤免疫反应来提高肿瘤疾病的的治疗效果。

说明书

技术领域

该组发明涉及医疗技术，尤其涉及肿瘤患者的免疫治疗，本发明也可应用于肿瘤疾病的治疗和预防该病复发的药物中。

背景技术

对于肿瘤疾病的治疗，由于手术、化学疗法和放射线疗法在实施中受到限制，迫切需要治疗肿瘤患者的新方法的开发。特别是，人们相信，由于免疫治疗的原则是增强人体自身的、防御性的抗肿瘤免疫能力，因而免疫疗法的发展前景良好。

免疫治疗的有效方法之一是疫苗接种。疫苗接种的效果好坏，取决于由肿瘤抗原引起的免疫应答强度，这些肿瘤抗原可存在于疫苗的组分中，也可存在于疫苗制备的不同阶段(例如，基于抗个体抗体，树突状细胞等而制备的疫苗)。因此，肿瘤抗原的分离是开发抗肿瘤疫苗的必要先决条件。

现已知有很多不同制备抗肿瘤疫苗的方法。

一些疫苗是利用肿瘤细胞(TC)的特异性抗原制备——即肽类、热休克蛋白、多糖和其他物质。特别公知的方法是通过合成的方法制备肿瘤肽类抗原。由9个氨基酸合成的肽类疫苗，在髓细胞性白血病患者的临床试验中效果良好(Williams R.，″Harnessing the Immune System：The Promise and Potential ofCancer Vaccines″，Oncolog.，2005，v.50，№4)。其他的肽类治疗效果不一。例如，gp100蛋白组成的肽类在初期效果良好，但不能引起足够的免疫应答来对抗患者的肿瘤发展(Yu Z.，Restifo N.P.，″Cancer Vaccines：Progress Reveals NewComplexities″，J.Clin.Invest.，2002，v.110，289-294)。

使用肿瘤糖类物质作为激活免疫反应抗原的方法是众所周知的。但是，类似的抗原疗效仅表现在对单一的肿瘤细胞时以及早期的转移阶段。(Franco A.，″CTL-Based cancer Preventive/Therapeutic Vaccines for Carcinomas：Role ofTumour-Associated Carbohydrate Antigens″，Scand.J.Immunol.，2005，v.61，391-397)。

应注意的是，基于确定抗原的疫苗具有其本质缺点。肿瘤细胞不仅具有多种抗原，而且其突变率较高且在机体中具有不断地细胞选择作用机制，这导致新抗原和经过修饰的已有的肿瘤抗原的出现。由此使用自体疫苗(基于病人自身肿瘤细胞的疫苗)的优点更为突出，这些自体疫苗覆盖引起免疫反应的整个抗原谱，包括个体的和疾病状态下的特异性抗原，这些抗原具有特定的病人在肿瘤发展过程中的所有特征。

使用外来体(exosome)制备肿瘤抗原的方法是公知的。外来体是直径不足几纳米的囊泡，可由多种细胞分泌，包括肿瘤细胞(如，论文Wolfers J.et al.，″Tumor-derived exosomes are a source of shared tumor rejection antigens for CTLcross-priming″，Nat.Med.，2001，v.7，297-303)、T-淋巴细胞和B-淋巴细胞(Raposo G.et al.，″B lymphocytes secrete antigenpresenting vesicles″，J.Exp.Med.，1996，v.183，1161-1172)，以及树突状细胞(Zitvogel L.et al.，″Eradicationof established murine tumors using a novel cell-free vaccine：dendritic cell-derivedexosomes″，Nature Med.，1998，v.4，594-600)。

这种方法的缺点是具有表面蛋白的外来体浓缩水平低，而这些表面蛋白是实质上免疫治疗中的抗原。众所周知，外来体主要包含胞浆蛋白和内涵体间隔担保(见论文Thery C.et al.，“Exosomes：composition，biogenesis and function”Reviews Immunology，2002，v.2，569-579)。该方法的第二个公知缺点是，收集外来体所需时间较长，这使得生长培养基中必须有肿瘤细胞，并且必须从生长培养基成分中纯化抗原。

另一种公知的制备抗肿瘤疫苗的方法，是向机体引入编码抗原的DNA，而不是引入抗原本身。抗原递呈细胞吸取DNA，形成肿瘤抗原，并且主要与组织相容性复合体(hystocompatibility complex)结合表达于细胞表面，以激活细胞毒性T淋巴细胞。由此，采用基于病毒载体的疫苗，在动物模型上得到较好的效果(见论文Yu Z.，Restifo N.P.，″Cancer Vaccines：Progress RevealsNew Complexities″，J.Clin.Invest，2002，v.110，289-294)。

这种方法的缺点是病毒载体自身会引发免疫系统的反应，这会导致人体内的抗肿瘤疫苗缺乏明显的疗效。

另一种制备抗肿瘤疫苗的公知方法是，事先用整个肿瘤细胞作为抗原，从病人自身的肿瘤细胞或者其他病人的肿瘤细胞制备自体疫苗或同种异体疫苗。细胞预先用电离辐射灭活。这种疫苗的优势在于不需要鉴别和分离具体的抗原。由此与作为佐剂的卡介苗疫苗混合后的细胞，可用于治疗结肠直肠癌、黑色素瘤以及肾癌(见Armstrong A.C.，Eaton D.，Ewing J.C.，″CellularImmunotherapy for Cancer″，Brit.Med.J.，2001，v.3323，1289-1293)。

这种方法的缺点是肿瘤细胞必须灭活，以及由于吞噬作用和抗原呈递细胞的作用而导致的位于整个肿瘤细胞表面的抗原的低适应性。

美国专利US 6039941(分类号C12N 15/09，A61K 31/00，公开于于2000年3月21日)公开了利用基因工程的方法处理编码具有免疫活性的表面蛋白的基因，以从肿瘤细胞中制得高致免疫性抗肿瘤疫苗的方法。

这种方法的缺点是，第一，必须对肿瘤细胞灭活；第二，肿瘤细胞表面抗原很难适合吞噬作用和抗原呈递细胞的作用。

国际申请WO 02053176(分类号A61K 39/00；C12N 5/06；A61K 39/00；C12N 5/06，公开于2002年7月11日)公开了一种基于培养肿瘤细胞的溶胞产物制备抗肿瘤疫苗的方法。这些疫苗的优势在于，不需经电离辐射灭活，以及不同于完整的肿瘤细胞，裂解的的细胞抗原更适合吞噬作用和抗原呈递细胞的作用，由此产生更明显的免疫反应。

这种方法的缺点是肿瘤细胞溶胞产物的主要部分是细胞内蛋白，并且由这种蛋白引起的免疫应答没有抗肿瘤的活性，因为肿瘤细胞的细胞内蛋白很难进入免疫体系。

最接近本专利的是美国专利5993829(分类号A61P 35/00，C07K 14/47，公开于1999年11月30日)中描述的制备抗肿瘤疫苗的方法。美国专利US6338853(分类号A61P 35/00，C07K 14/47，公开于2002年1月15日)，美国专利5030621(公开于1991年7月9日)以及美国专利US 5635188(公开与1997年6月3日)中也描述了类似的方法，包括肿瘤细胞培养以及其表面抗原的分离。

另一种公知方法是预先在无血清生长培养基中培养肿瘤细胞，并从生长培养基中分离表面细胞抗原，在此培养程中肿瘤细胞消失。经纯化收集抗原可用作抗肿瘤疫苗的抗原。这种疫苗的优势在于，细胞表面肿瘤抗原含量高，这种肿瘤抗原(并非隐藏在细胞内)容易被免疫系统作用。这种方法的缺点是：

-由于不受外部影响、自发地反应，以及缺少培养肿瘤细胞的抗原，因而抗原产量低；

-所得物质中目的产物(抗原)含量低，且杂质多。这是由于抗原收集之前，肿瘤细胞要在生长培养基中孵育若干小时(如美国专利6338853所述，在1640培养基中培养三个小时)，这意味着要在含有40多种物质(氨基酸、盐、缓冲剂、维生素、葡萄糖等)的生长培养基中收集抗原，同时培养基中还含有代谢产物以及在培养进程中由肿瘤细胞分泌的其他物质；

-要分析抗原混合物的成分，必须事先纯化从生长培养基和细胞代谢产物中得到的产物。

-要分离得到足以满足疫苗接种所需剂量的抗原，必须延长肿瘤细胞培养时间以使其增殖，这会导致抗原混合物组成发生改变并使疫苗功效降低；

-根据该方法，要得到疫苗接种所需的抗原数量，必须通过肿瘤细胞培养，也就是说，利用该方法不可能从离体(无培养)细胞中提取抗原；

-鉴于肿瘤细胞的长时间培养和表面肿瘤抗原必须经过纯化，上述疫苗价格昂贵。

其他公知的抗肿瘤疫苗，其基本组成是不同抗原的混合物或者抗原与不同免疫刺激物质的混合物。

国际申请WO 2004012685(分类号A61K 39/00，公开于2004年2月12日)所公开的抗肿瘤疫苗是基于表面肿瘤抗原的，这些抗原在细胞培养过程中会“消失”。这种疫苗的制备，可能加快在不同因素影响下，通过生长培养基的细胞分泌抗原的速度，在受到一定程度上提高疫苗效果的不同影响下，疫苗制备中，加速了通过生长培养基中的细胞分泌抗原的进程。但是这种疫苗也具有与其他通过无血清培养基中培养肿瘤细胞所得到的疫苗相同的固有缺点。

这里描述的最相近的专利申请是基于表面肿瘤抗原的疫苗，由美国专利US 5993829(分类号A61P 35/00，C07K 14/47，公开于1999年11月30日)所披露。美国专利US 6338853(分类号A61P 35/00，C07K 14/47，公开于2002年1月15日)，美国专利US 5030621(公开于1991年7月9日)，美国专利US5635188(公开于1997年6月3日)中对相似的疫苗也有描述。正如前面所提到的，这个公开疫苗的缺点是其高昂的价格，这主要是因为肿瘤细胞的培养期和纯化步骤。

还有很多已知的不同的抗肿瘤治疗方法。

公知的利用单价疫苗进行抗肿瘤免疫治疗，包括向机体中导入确定的肿瘤抗原。例如，这种疫苗属于基于合成肽、热休克蛋白、多糖及其他物质的疫苗。这些方法特别公开于专利WO 2005083074(分类号A61K 31/7088；A61P 35/00；C07K 7/06，公开于2005年9月9日)和俄罗斯专利RU 2271831(A61K 39/385；A61K 39/39；A61K 51/00，公开于2006年3月20日)。

这些方法的缺点是引入的抗肿瘤免疫的特异性较差，这是因为某些抗原对具体患者的肿瘤不具有特异性，统计发现这些抗原是各类肿瘤的共同抗原。

公知的抗肿瘤疗法，包括向机体注射全部的灭活肿瘤细胞，和经过强化免疫原性的全部的肿瘤细胞(例如，US Patent 6039941，分类号C12N 15/09，A61K 31/00，公开于2000年3月21日)。

这种免疫疗法的缺点是诱导的抗肿瘤反应特异性低，因为肿瘤细胞表面抗原几乎不适合吞噬作用和接下的抗原呈递细胞的过程。此方法的也需要预先在体外进行细胞增殖，以获得疫苗接种所必须剂量的抗原，这也会引起抗原组成的改变以及免疫治疗效果的降低。

国际申请WO 02053176(分类号A61K 39/00；C12N 5/06；A61K 39/00；C12N 5/06，公开于2002年7月11日)公开了实施抗肿瘤免疫治疗的方法，包括将肿瘤细胞溶胞产物导入机体的步骤。

这种免疫接种方法的缺点诱导的抗肿瘤免疫特异性低。这种方法中，疫苗中除了含有免疫应答所需的表面肿瘤抗原外，还含有作为溶胞产物主要成分的细胞内蛋白。因此，针对大量压载蛋白(ballast proteins)的免疫反应由此产生，使得免疫应答的肿瘤特异性变“模糊”。该方法也需要预先进行细胞体外增殖，以获得疫苗接种所需的足够的抗原剂量，这也会引起肿瘤细胞抗原组成的改变，继而降低抗肿瘤治疗的效果。

基于特定肿瘤抗原的组合以及不同抗原与各种免疫兴奋剂的组合的方法，是公知的。

同本发明最相近的抗肿瘤治疗的方法，为美国专利US 5993829(分类号A61P 35/00，C07K 14/47，公开于1999年11月30日)所披露的。相近的方法也在专利US 6338853(分类号A61P 35/00，C07K 14/47，公开于2002年1月15日)，US 5030621(公开于1991年7月9日)，美国专利US 5635188(公开于1997年6月3日)以及WO 2004012685(分类号A61K 39/00，公开与2004年2月12日)中有所描述。该方法包括将从抗原混合物中得到的疫苗注入机体内，这些抗原是肿瘤细胞表面蛋白的片段，在无血清培养基培养的过程中的被细胞自然地除去。

这种方法的缺点之一是所诱导的免疫应答的低特异性。该方法首先要长时间地培养肿瘤细胞，这引起其抗原组成的改变并降低疫苗效果。另一个缺点是该方法成本相对较高，这是由于细胞培养时间长，以及必须从生长培养基中的组分中分离纯化抗原而导致。

发明内容

本发明所达到的技术效果为由于强化了抗肿瘤免疫应答而提高了肿瘤疾病的治疗效果。

本发明的技术效果是通过使用基于表面肿瘤抗原的抗肿瘤疫苗而实现的。根据本发明，疫苗包含表面肿瘤抗原的混合物，所述抗原是通过收集活的肿瘤细胞表面蛋白的肽类而得到，所述肽类是通过向原代培养的活的肿瘤细胞周期性加入不使细胞死亡的蛋白酶进行处理而得到的。

根据本发明优选的实施方式，所述抗肿瘤疫苗中使用的蛋白酶可为胰蛋白酶。

前述技术效果，也可通过本发明所提供的制备抗肿瘤疫苗的方法而实现，所述制备方法包括培养肿瘤细胞和分离表面肿瘤抗原。根据本发明，将预先从生长培养基上洗脱的活的肿瘤细胞进行原代培养，用蛋白酶对肿瘤细胞进行不使细胞死亡的处理，收集释放的表面肿瘤抗原。接着，经过一段时间，用蛋白酶对原代培养的活的肿瘤细胞进行重复处理，该段时间的间隔足以使得表面肿瘤抗原的活性被细胞恢复。积聚(富集，收集；accumulate)表面肿瘤抗原直至达到满足疫苗接种的剂量，控制得到的表面肿瘤抗原的组分。

根据本发明的实施例，所述蛋白酶为胰蛋白酶。

本发明的技术效果也可通过抗肿瘤免疫疗法的实施而获得，包括将疫苗注射到患者体内的步骤，该疫苗由表面肿瘤抗原的混合物制成，这些抗原为肽类，该肽类来源于肿瘤细胞表面蛋白。

根据本发明，使用表面肿瘤抗原，其抗原为收集的活的肿瘤细胞表面蛋白的肽类，是通过向原代培养的活的肿瘤细胞中周期性地加入不使细胞死亡的蛋白酶进行处理而得到的。

根据本发明的一个实施方式，所用蛋白酶为胰蛋白酶。

为了获得更强的特异性免疫应答，所述表面肿瘤抗原可以为患者自身的表面肿瘤抗原。

根据本发明的另一实施方式，所述表面肿瘤抗原可以为其他患者的表面肿瘤抗原。

根据本发明的一种实施方式，可以加入佐剂作为疫苗组成之一。

附图说明

以下通过具体实施方式和附图来进一步说明本发明。

图1为实现本发明制备抗肿瘤疫苗的大体工艺总流程图；

图2A为根据本发明第二个实施方式，从原代培养肿瘤细胞得到的表面抗原的质谱图；

图2B为源自同样的培养细胞，在表面抗原完全修复和经过蛋白酶重复处理后，得到的表面抗原的质谱图；

图2C为源自同样的培养细胞，在经过蛋白酶处理、部分修复后，所得到的表面抗原的质谱图；

图3为根据本发明所述方法获得的表面抗原片段质谱图；

图3A，图3B为抗原的碳水化合物中的CID片段图谱；

图3C，图3D为具有b/y离子的抗原肽段序列的CID片段图谱；

图4为接种肽混合物后的H22肿瘤细胞荷瘤小鼠的生命曲线图。

具体实施方式

实施例一是利用人肝癌细胞H22的荷瘤小鼠制备抗肿瘤疫苗的方法。利用了培养的H22细胞来制备疫苗。

1.将生长培养基从培养有H22细胞的细胞瓶中移出，用不少于生长培养基一半体积的无菌生理溶液冲洗单层细胞。冲洗至少三次，以彻底清除培养基中的杂质。

接下来至关重要的一步，是用不致细胞死亡的浓度的蛋白酶处理细胞，一般使用胰蛋白酶(酶活力～3000U/mg)。

2.将0.0001％的胰蛋白酶溶液加入到单层细胞中，每25cm²的细胞瓶面积加入1ml溶液。

3.细胞瓶在37℃环境下进行孵育，在孵育到第5至第7分钟之间时，收集含有从细胞表面裂解出的抗原的胰蛋白酶溶液。

4.将新制备的含有血清(通常含10％)的生长培养基加入到细胞中，继续培养。

5.为了得到所需数量的抗原，隔24小时重复步骤2-4。

6.采用质谱分析以评估抗原的有效性。

7.将积聚的抗原用于制备疫苗。

质谱分析的操作步骤如下。140ul的抗原溶液与140ul的乙醇和720ul的丁醇混合，再加入15ul的CL4B琼脂糖凝胶。混合物孵育45分钟并缓慢搅拌。孵育后，用相同的乙醇-丁醇溶液冲洗琼脂糖凝胶2遍，并在50％乙醇溶液中孵育30分钟。收集乙醇溶液并在旋转蒸发装置(rotor-evaporating device)中晾干。所得到的干燥物质复溶于10ul水中，并采用MALDI-TOF质谱仪分析。将待分析的2ul溶液，以1∶1的比例同含有50％的乙腈和0.5％的三氟乙酸的2，5-二羟基苯甲酸的饱和溶液混合，至于质谱仪靶上。在样品板上制备好的样品液滴在空气中干燥，多肽的质谱分析在质量范围600-4000道尔顿(Da)进行。

已知大多数的肿瘤抗原都位于细胞表面，这些抗原在疫苗开发上有一定益处(如综述Bocchia M.et al.，″Antitumor vaccination：where we stand″，Hematologica，2000，v.85，1172-1206)。用在不致细胞死亡条件下用胰蛋白酶处理原代培养的细胞，会导致蛋白片段从细胞表面裂解(见Lokhov P.G.，ArchakovA.I.，“Proteomic footprinting：a method for cells profiling by direct massspectrometry”，HUPO theses，5-th Annual World Congress，2006，abstract No1201)。因此，根据本发明，胰蛋白酶以及其他蛋白酶的作用会使肿瘤表面蛋白片段释放到溶液中。在胰蛋白酶作用下释放的表面肿瘤抗原(表面蛋白片段)主要为可用于免疫治疗的抗原，可用于肿瘤患者的免疫接种。

有必要指出，应在细胞脱离细胞瓶壁之前收集含有细胞上分离出的肽类的胰蛋白酶溶液，这样会避免细胞转移到样品中，不必进行额外的纯化步骤。

实验上根据每种肿瘤细胞以及所用蛋白酶的活性程度而确定用蛋白酶处理细胞的条件，这些条件可以极不相同，蛋白酶浓度可以从0.0001％到0.05％，处理时间可以从30秒到10分钟。使用不同活性的胰蛋白酶时，其浓度可以适当调整以提高或者降低酶活性。

细胞经过非致死浓度的蛋白酶处理后不会死亡，由此可以用胰蛋白酶重复处理原代培养的细胞。为了使得表面肿瘤抗原的剂量足以达到用接种疫苗的要求，可以用胰蛋白酶对所培养的活性细胞进行多次重复处理，两次处理之间应至少间隔24小时。用胰蛋白酶处理细胞的间隔期间，细胞孵育的实验方案要根据特定的细胞来确定(即培养于37℃的CO₂培养箱中，生长培养基中含有血清和必须的添加物)。

积聚的表面肿瘤抗原按照特定疫苗的制备技术处理，即，这些抗原可以经纯化、浓缩、组成分析，也可进行修饰或与佐剂混合以增强免疫原性。

在本发明的其他实施方式中，蛋白酶的处理可与细胞传代培养相结合。

胰蛋白酶溶液由无菌生理溶液或任何合适的盐溶液配制。

除了胰蛋白酶，也可采用其他蛋白酶，例如胰凝乳蛋白酶(chemotrypsin)等。

根据本发明的一个实施例，当使用细胞悬液的时候，需在积聚抗原以前，使用离心或其他合适的方法收集细胞。

本发明实施例一中所述的抗原组成分析，采用分析糖基化的肽类的质谱仪器来进行(M.Tajiri et al.，″Differential analysis of site-specific glycans on plasmaand cellular fibronectins：application of a hydrophilic  affinity method forglycopeptide enrichment″，Glycobiology，2005，v.15，1332-1340)。部分原因是由于蛋白片段通常会糖基化，另一部分原因是糖基化肽类的免疫原性最强，为疫苗抗原的有益部分(如Franco A.，″CTL-Based cancer Preventive/TherapeuticVaccines for Carcinomas ：Role of Tumour-Associated Carbohydrate Antigens″，Scand.J.Immunol.，2005，v.61，391-397)。

糖基化抗原的脱盐和浓缩可通过任何适当的方式进行，特别是高效液相色谱法(HPLC)。

在其他实施方式中，肿瘤细胞可从生物源液体中分离，如血液、尿液、体液(liquor)、淋巴液、腹水以及胸膜液。

抗肿瘤疫苗的制备方法适用于各种类型的细胞培养，包括贴壁培养、悬浮培养、与母体组织或其他培养基培养、各种形式的细胞共培养、器官培养以及细胞集合体(颗粒、球体)，也同样包括新分离的肿瘤细胞和肿瘤组织片段。

进一步的，实施例二描述了本发明采用人结肠癌细胞贴壁原代培养，制备而成的抗肿瘤疫苗和疫苗的制备方法。

1.通过肿瘤切除手术取得的结肠肿瘤组织片段，移入含RPMI1640培养基和抗生素的无菌管中，送入实验室。

2.在无菌条件下将肿瘤组织转移至有盖培养皿中，去除坏死的部分、血块、残留的脂肪以及结缔组织。

3.将组织小心地用剪刀剪成小片。

4.用10ml的甲硅烷磷酸盐缓冲液(PBS)悬浮组织碎片，强力吹打，使肿瘤组织碎片解离成细胞团块。

5.静置使剩余较大的组织碎片沉到试管底部。

6.用吸管小心收集悬浮于液体中的细胞团块，并转移到一个新的试管中。

7.试管以400g的重力加速度离心5分钟，丢弃上清。将含有细胞团块的沉淀重新悬浮于RPMI 1640培养基中。该培养基内含有胰岛素(20μg/ml)，转铁蛋白(10μg/ml)，皮质醇(50nM)，表皮生长因子(1ng/ml)，乙醇胺(10μM)，磷酸乙醇胺(10μM)，三碘甲腺原氨酸(triiodthyronine)(100pM)，牛血清蛋白(2mg/ml)，谷氨酰胺(2mM)，丙酮酸钠(sodium piruvate)(0.5mM)，胎牛血清(5％)。然后转移至25cm²的细胞瓶中进行细胞培养。

8.在37℃和5％CO₂的条件下进行细胞培养。

9.为了从基质细胞中分离肿瘤细胞，将细胞瓶紧压在震动搅拌器上数秒钟。由于肿瘤细胞附着力较弱，因而分离并进入生长培养基中。

10.用吸管收集含有漂浮细胞的培养基，然后将其转移到一个新的细胞瓶中，在37℃和5％CO₂条件下进行培养。

11.肿瘤细胞长到80％融合时，从细胞瓶中移除生长培养基，用0.9％的NaCl或甲硅烷磷酸盐缓冲液冲洗细胞三次，所用冲洗溶液的体积不少于生长培养基体积的一半。冲洗后生长培养基中的血清应除去。

12.将0.0001％的胰蛋白酶溶液(酶活性～3000U/mg)加入到细胞中，加入量为每25cm²细胞瓶的面积1ml溶液。

13.37℃孵育细胞瓶。在孵育到第5至第7分钟时，收集含有从细胞上裂解的表面抗原的溶液。收集的过程中，肿瘤细胞仍紧贴细胞瓶壁。如果一部分细胞由于胰蛋白酶的作用脱离了细胞瓶壁而漂浮于液体中，需对溶液以400g的重力加速度离心5分钟，取无细胞的上清备用。

14、为灭活培养细胞瓶中剩余的胰蛋白酶，应加入新制备的含有胎牛血清的生长培养基，并继续在37℃以及5％CO₂的条件下孵育细胞。

15、由步骤13获得的溶液在真空浓缩器中，于45℃条件下进行浓缩。浓缩前应用适当方法对溶液脱盐，如反相色谱法、凝胶过滤法等。为了除去剩余的胰蛋白酶，应预先用可滤过分子量低于4kDa肽段的过滤器对溶液进行过滤。

16、经过24小时，重复步骤11-15步骤，以使抗原达到所需的量。这些抗原对疫苗接种的有效性通过质谱仪来评定。

用蛋白酶处理细胞的次数以及数次处理间隔时间的长短，是通过分析所积聚的抗原混合物的组成来决定的。如果抗原组成开始改变，数次用蛋白酶处理细胞之间的间隔增长，不能得到由新分离出的肿瘤细胞得到的最初的抗原组成，那么这些细胞便不能用于疫苗制备。

所积聚到抗原混合物的组成，是通过质谱测定来控制的，正如本发明实施例一种所描述的。

任何合适的方法都可用于从肿瘤组织中分离细胞。用蛋白酶分离肿瘤组织，意在分离肿瘤细胞，进行表面结构的质谱分析时，必须在肿瘤细胞原代培养24小时之后进行。

根据本发明得到的表面肿瘤抗原对肿瘤细胞供体有特异性。但是细胞培养明显改变了原代培养的表型，这是因为人工重建与肿瘤细胞在供体内的生长环境体相类似的体外培养条件造成的。所以积聚的抗原需要进行严格控制。下面进一步说明根据本发明实施例二进行抗原质量鉴定的方法。

根据在对抗原混合物重复进行质谱分析后得到的数据，不少于95％质量比的糖基化肽类得到复制，可以作为两个待比较的抗原组合物的标准品。如果积聚的用于疫苗接种的抗原，其比例不少于一般新分离的肿瘤细胞中糖基化肽类质量的90％，则认为此抗原是可以用于治疗的。

从实验数据中可得知，直肠肿瘤细胞只有使用第一和第二代传代细胞在培养3-4天的情况下，才可用于制备适合免疫接种的抗原。不能否认，在生长培养基中加入一些成分，可以保持细胞表型，增加细胞传代次数，利于疫苗抗原的积聚。

当不能从肿瘤组织中制备得到足够数量的细胞时，则必须对细胞进行培养以增殖，直至达到所需数量，同时必须在细胞培养期间控制表面抗原的变异。根据本发明，在培养过程中控制抗原组成，不需另外的细胞增殖。例如，细胞培养期间，每周一次或两次的用不会使细胞致死的蛋白酶进行处理，以及进行质谱分析。

肿瘤和疫苗抗原的鉴定，保证了由疫苗诱导的抗肿瘤免疫反应的特异性。对比原肿瘤抗原和根据本发明所提供的抗原之间的质谱，可以进行鉴定。图2A所示为原肿瘤细胞表面抗原的质谱图。图2B所示为利用本发明所提供的方法制备的适用于疫苗接种的抗原质谱图(图2A和图2B的质谱具相似性)。图2C所示也是根据本发明所得到的不适用于疫苗接种的抗原的质谱图(图2A和图2C所示明显不同)。箭头指向的面积分别对应消失的抗原(图2B)和新出现的抗原(图2C)。因此，通过控制肽类的组成，可以积聚到疫苗接种所需足够数量的抗原，从而诱导特异性抗肿瘤免疫反应。

为了确定来自肿瘤细胞表面蛋白的抗原的真正起源(虽然这对发明的实现是非必要的)，给出了抗原片段的质谱图，如图3所示的图例。

为此，在加入胰蛋白酶孵育细胞的过程获得的样品，先用自动吸管的头取反相ZipTip_C18(Millipore Corp.，USA)，按照说明书的方法进行脱盐。按照前述方法将其置于质谱仪的样品板上。质谱是通过离子片段的状态进行记录的。蛋白的鉴定是通过搜索系统Mascot(MatrixScience，USA)进行，该系统建立于蛋白质序列数据库NCBI(USA)的人类分类单元，使用离子质谱‘b’和‘y’(序列标记法)和/或使用已确立的氨基酸序列。(新生法de novo method)

图3A和图3B显示了分离的质量在1640-1480Da之间的糖基化肽类的碳水化合物部分，裂解片段分子量为162Da、203Da和291Da，这分别与己糖(甘露糖，葡萄糖或者半乳糖)、乙酰葡萄糖胺和唾液酸相对应。利用肽类片段，可以确定其氨基酸序列，并可利用其免疫球蛋白重链(含大部分CD抗原，组织相容性复合体，T-细胞受体和细胞粘附分子)上的可变区和恒定区、低密度脂蛋白受体、白细胞介素IR-2受体、G蛋白偶联受体、主要组织相容性复合体I和II来确定抗原混合物中的肽类。图3C所示为一个分离片段，其中利用b-y离子指示出分子量为857.4Da的双电荷肽类，确定的氨基酸序列与G蛋白结合受体的片段相对应：

Ile Cys Cys Ala Cys Cys Leu Cys Arg Asn Asn Cys Cys Val Phe Arg

1               5                   10                  15

图3D所示为另一个分离片段，由b-y离子示出具有分子量为573.3Da的单电荷肽类，确定的氨基酸序列与主要组织相容性复合体II相对应：

Ala Val Leu Asn Arg

1               5

因此，根据本发明获得的抗原的特征如下：

1)它们是有水溶性物质组成，主要为糖基化的肝水解蛋白(当用胰蛋白酶作为蛋白酶时，它们的序列通常以赖氨酸或精氨酸结尾)，其分子量为1.2-4kDa，

2)它们来源相同——都是肿瘤细胞质膜外蛋白的胞外片段，

3)它们都是在不使得细胞死亡的浓度条件下用蛋白酶处理活的细胞而得到的。

根据本发明得到的肿瘤抗原混合物，其实际应用是由确定的氨基酸序列与细胞表面呈现的与蛋白片段混合存在的修饰的(糖基化)肽类来决定。众所周知，肿瘤疾病的发生，是免疫系统无法破坏机体中形成的肿瘤细胞的结果。经过积聚纯化的抗原，与能增强免疫反应的佐剂相混合，然后注入人体或动物体内。由于生物体细胞和体液免疫反应的存在，在机体消灭注射入体内的肽类的同时，体内已有的或新出现的肿瘤细胞也会被破坏，从而决定了抗肿瘤疫苗接种的治疗和预防效果。为了发挥免疫反应的最大作用，可重复注射抗原。

为了确定根据本发明所得抗肿瘤疫苗的活性，用20只年龄和体重相同的BALB/c系雄性小鼠做模型试验(10只作为对照，10只作为实验组)。

根据实施例一得到的肿瘤抗原，来自于培养的肝癌细胞H22。将收集的抗原采用葡聚糖凝胶G-10进行凝胶过滤脱盐，然后并用真空浓缩器SpeedVac进行浓缩。

先将抗原与完全弗氏佐剂以1∶1(体积比)的比例混合，然后取150ug进行皮下注射。使用不完全弗氏佐剂在三周内进行反复免疫(每周注射一次)。对照组动物同时注射混有生理溶液的弗氏完全佐剂。在第四次免疫接种后，用皮下注射的方法将1百万个肝细胞瘤H22接种到小鼠体内。记录三个月内对照组和实验组动物的存活率。绘制存活曲线(图4)确定根据本发明所得抗原的抗肿瘤活性。

需要注意的是，该动物实验的结果并不能认为本发明仅能在动物中成功应用，因为动物和人的抗肿瘤免疫的机制是一样的。抗原的使用方法和其在每公斤体重的使用剂量，保证了其在人类免疫疗法中的作用，但是针对每一个病人，其治疗方案可以根据病情的严重性，疾病所处的阶段，肿瘤细胞的突变性，机体针对抗原而产生显著性免疫应答的能力等，进行个体化定制。

进一步地，以下提供抗肿瘤疫苗和及其抗肿瘤疗法，该肿瘤疫苗是基于表面肿瘤抗原，根据本发明实施例二而制备，用于进行人的抗肿瘤治疗。

疫苗包含1mg肿瘤抗原混合物，该抗原是根据本发明实施例二制备的，溶于0.5ml的甲硅烷磷酸盐缓冲溶液中，并与1ml的佐剂山小星蒜碱(Montanide)ISA-51(Syntex厂利用含有角鲨烯、Plunoric L121、吐温-80的油水乳剂制备而成的佐剂)混合。

给患者皮下注射一个剂量的疫苗，每周一次，持续三周以及每月一次，持续五个月。

用注射肿瘤抗原的免疫强度来评估疫苗的效果。在注射后2-3，注射抗原引起的过敏性反应通过注射局部红斑的尺寸来衡量。以首次注射后出现的红斑尺寸作为基数。重复疫苗接种引起明显的过敏反应，表示免疫反应的发生。

根据本发明的其他实施方式，进行抗肿瘤免疫疗法也可采用静脉或肌肉注射疫苗，也可注射不含佐剂的疫苗。

由于肿瘤抗原混合物的使用，通过本发明所提供方法可确保免疫反应的发生。疫苗中存在的许多抗原，保证能对每一个细胞产生免疫反应，这些细胞自身没有具有相同氨基酸序列的表面蛋白。

因此，本发明与现有的使用单价疫苗的方法相比，其抗肿瘤免疫疗法的效果增强很多倍。

本发明提供的由肿瘤细胞表面抗原组成的富含肿瘤特异性抗原的疫苗，其应用为抗肿瘤免疫疗法的实施提供了可能。

产生这种疗效，主要是由于用不使细胞死亡浓度的蛋白酶对肿瘤细胞进行处理。采用不使细胞死亡浓度的蛋白酶，仅能使肿瘤细胞的表面抗原分离，而不会使细胞死亡。而细胞死亡会伴随着细胞膜的损坏，从而使得疫苗中出现细胞质内容物，特别出现大量的非疫苗成分的胞内蛋白。这会降低已有疫苗中肿瘤特异性抗原部分含量减少，扰乱免疫应答，从而降低免疫应答的特异性，即肿瘤抗原的特异性。

因此，使用根据本发明制备的富含肿瘤抗原的疫苗，可提高抗肿瘤免疫疗法的效果。

此外，免疫疗法的效果提高，是因为使用了积聚自培养的原代肿瘤细胞的抗原。这种制备抗肿瘤疫苗的方法，其收集抗原的步骤可以在每次蛋白酶处理之后，这样每次收集的抗原组成实际上是一样的，如此增加了用于疫苗接种的从原代细胞培养中获得的疫苗的数量。使用仅对特定肿瘤具有抗原特异性的疫苗是安全的，因为收集抗原的组分是可控的。

本发明不会导致疫苗中出现对特定肿瘤具有非特异性的抗原。这种非特异性抗原可能出现在现有的用增殖细胞制备的疫苗中，这是因为体外繁殖过程中的原代培养改变了其抗原组成。因此，从增殖细胞中收集得到的抗原混合物，其组成与通过分离(而非培养)的肿瘤细胞而得到的抗原的组成明显不同。

根据本发明制备的疫苗，可以是自体疫苗(从患者自身细胞获得)或者异体疫苗(从其他患者细胞获得)。

在两种情况下，本发明所提供的免疫疗法都是有效的，因为不同患者的肿瘤细胞，其表面的肽类具有相同的氨基酸序列。

此外，根据本发明制备的自体疫苗更有效，因为这时疫苗含有特定病人在肿瘤发展过程中所个别拥有的、符合特定疾病阶段的抗原特性。

工业应用

本发明基于细胞表面抗原制备肿瘤抗原，并在此基础上治疗肿瘤疾病，主要利用疫苗接种的方法。