使用受控剪切力从卵囊中释放孢子被的方法

摘要

本发明提供了从卵囊中释放孢子被/孢子体的方法，其中使卵囊溶液经受足以使卵囊壁破裂的受控剪切力，并从中释放孢子被/孢子体。在腔室直径、腔室几何规格和压力受到限定的条件下，使卵囊溶液通过微射流均质机处理器腔室单元。卵囊撞击腔室壁，并经受受控高剪切力，撕开卵囊壁并释放完整的孢子被/孢子体。

说明书

相关申请

本申请要求美国临时专利申请60/900,233的权益和优先权，所述申请于 2007年2月8日提出，其中公开的内容通过引用将全部内容并入本文。

技术领域

本发明一般涉及卵囊，并更具体地而言，涉及从卵囊中释放孢子被的方 法。

背景技术

家禽的球虫病是由艾美球虫属的原生寄生虫引起的疾病。艾美球虫种的 卵囊在环境中普遍存在，并且可以在家禽粪便中持续存在多月。吞食卵囊会 以物种特异性的方式在肠道内导致多处感染。这种生物可以在肠道内繁殖长 达几天，导致在粪便中分泌下一代卵囊。多个循环的感染会产生免疫力，并 且当感染幼年家禽群并在家禽群中感染剂量一致时，经过几个循环的接触后 发展得到的免疫力非常强。

相反，当鸟类感染的方式不一致时，就会出现这样的情况：幼鸟受到突 然而且大量的感染，导致饲料转化和体重增加的性能较差，并且有较高的二 次感染的风险。目前，用于控制家禽业中球虫病的最常见的方法不是接种疫 苗，而是在饲料中施用抗球虫病的药物。较低的疫苗使用率经常是因为在生 长区通过饲料或水或者在孵化时通过喷雾橱接种疫苗(这些是给药的传统途 径)给药时不确定的剂量一致性。对于提高孵化时施用期间疫苗输送的一致 性从而在家禽群中提供更一致的保护，在这方面的兴趣日益增加。

近来，已经发现胚胎疫苗接种技术适用于基于活卵囊球虫病的疫苗的施 用(参见，例如，美国专利6,500,438；美国专利6,495,146；和美国专利 6,627,205；所有上述专利都属于Pfizer，Inc.)。胚胎施用途径为向每个胚胎在 其尚在蛋中时输送一致剂量的疫苗提供了方便的方法。目前美国每年生产的 90亿肉禽中，约85％使用了鸟类疫苗胚胎输送，并且美国之外每年生产的210 亿肉禽中使用鸟类疫苗胚胎输送的比例也正在增加(参见，例如，美国专利 4,458,630，所述专利属于美国政府)。因此，向活胚胎输送的球虫病疫苗的潜 在市场比目前孵化后输送的球虫病疫苗的市场大得多。

艾美球虫卵囊在防护性卵囊壁中包含四个孢子被。孢子被可以用于多种 目的，包括疫苗、活性测试、孢子体产生等。破裂卵囊和释放孢子被的传统 方法使用玻璃珠。卵囊与玻璃珠一起震荡，导致卵囊壁破裂，并释放其中的 孢子被。然而，要使较高百分比的卵囊破裂，通常需要相当程度的震荡，并 且持续的震荡可能降解原先释放的孢子被。其他传统的释放孢子被的方法存 在类似问题，比如使用组织研磨器释放孢子被时。持续进行研磨过程能破坏 于过程早期释放的孢子被。

从卵囊中释放孢子被的其他常规方法涉及从卵囊中化学释放孢子被。通 常，将卵囊悬浮于包含例如CO₂气体的缓冲液中。也可以包含半胱氨酸盐酸 盐。这个过程可以减少卵囊卵孔区中的二硫键。最终，可以通过松开的卵孔 盖释放孢子被。遗憾的是，单独的化学释放通常不是孢子被释放的有效方法。

如上所述，从产孢卵囊中释放孢子被的常规方法不够有效，仅得到潜在 的活孢子被中的一部分。因此，需要从卵囊中释放孢子被的改进方法，其可 以克服常规方法中的相关问题。

发明内容

根据上述讨论，提供从卵囊中释放孢子被的方法，其中使卵囊溶液经受 足以使卵囊壁破裂并从中释放活孢子被的受控剪切力。根据本发明的一些实 施方式，在腔室直径、腔室的几何规格和压力受到限定的条件下，将卵囊的 水溶液通过一个或多个微射流均质机处理器腔室。卵囊撞击腔室壁，并经受 受控高剪切力，撕开卵囊壁并释放完整的孢子被。这个方法对于释放孢子被 特别有效，因为较高百分比的卵囊壁能破裂，使得可以回收较高百分比的孢 子被。此外，对释放的孢子被伤害很小，使得较高百分比的回收孢子被保持 存活。

在一些实施方式中，在使溶液经受受控剪切力之前，处理卵囊并削弱其 壁。例如，可以对卵囊进行热处理，化学处理，酶处理，或者可以对卵囊进 行热、化学和酶处理的多种组合。

在一些实施方式中，将回收的孢子被冻存用于保存。在一些实施方式中， 使用回收的孢子被制备疫苗和/或诊断试验。

在一些实施方式中，使孢子体从回收的孢子被中脱囊。这些孢子体可以 用于制备疫苗和/或诊断试验。

根据本发明，可以从中回收孢子被的示例卵囊，是艾美球虫(Eimeria)卵 囊，比如选自下组的艾美球虫卵囊：巨型艾美球虫(E.maxima)卵囊、和缓艾 美球虫(E.mitis)卵囊、柔嫩艾美球虫(E.tenella)卵囊、堆型艾美球虫(E. acervulina)卵囊、布氏艾美球虫(E.brunetti)卵囊、毒害艾美球虫(E.necatrix) 卵囊、早熟艾美球虫(E.praecox)卵囊、变位艾美球虫(E.mivati)卵囊及其任何 组合；选自下组的艾美球虫卵囊：火鸡和缓艾美球虫(E.meleagrimitis)卵囊、 腺艾美球虫(E.adenoeides)卵囊、火鸡孔雀艾美球虫(E.gallopavonis)卵囊、分 散艾美球虫(E.dispersa)卵囊、无害艾美球虫(E.innocua)卵囊和近圆艾美球虫 (E.subrotunda)卵囊及其任何组合；选自下组的艾美球虫卵囊：邱氏艾美球虫 (E.zuernii)卵囊、牛艾美球虫(E.bovis)卵囊及其任何组合；选自下组的艾美球 虫卵囊：阿撒他艾美球虫(E.ahasata)卵囊、巴库艾美球虫(E.bakuensis)卵囊、 槌形艾美球虫(E.crandallis)卵囊、浮氏艾美球虫(E.faurei)卵囊、颗粒艾美球 虫(E.granulosa)卵囊、错乱艾美球虫(E.inthcata)卵囊、马尔西卡艾美球虫(E. marsica)卵囊、类绵羊艾美球虫(E.ovinoidalis)卵囊、苍白艾美球虫(E.pallida) 卵囊、小艾美球虫(E.parva)卵囊、温布里吉艾美球虫(E.weybhdgensis)卵囊及 其任何组合；和选自下组的艾美球虫卵囊：肠艾美球虫(E.intestinalis)卵囊、 维氏艾美球虫(E.vejdovskyi)卵囊、梨形艾美球虫(E.piriformis)卵囊、盲肠艾 美球虫(E.coecicola)卵囊、无残艾美球虫(E.irresidua)卵囊、黄艾美球虫(E. flavescens)卵囊、小型艾美球虫(E.exigua)卵囊、大型艾美球虫(E.magna)卵囊、 穿孔艾美球虫(E.perforans)卵囊、中型艾美球虫(E.media)卵囊、斯氏艾美球 虫(E.stiedai)卵囊及其任何组合。

在一些实施方式中，提供从卵囊中释放孢子体的方法，其中使卵囊溶液 经受足以使卵囊壁破裂并从中释放孢子体的受控剪切力。根据本发明的一些 实施方式，在腔室直径、腔室几何规格和压力受到限定的条件下，使卵囊的 水溶液通过一个或多个微射流均质机处理器腔室。卵囊撞击腔室壁，并经受 受控高剪切力，撕开卵囊壁并释放完整的孢子体。

本发明的实施方式相比常规方法具有优势。例如，本发明的实施方式可 实现重复性的一致孢子被收率。相反，常规的玻璃珠和组织研磨方法可能由 于操作者的操作方式而发生变化，可能导致孢子被收率的不一致。此外，本 发明的实施方式可以放大规模，从而大规模经济生产孢子被。相反，常规的 玻璃珠和组织研磨方法不易由大规模生产采用。

附图说明

图1-2是根据本发明的一些实施方式从卵囊中释放孢子被的操作流程图。

图3是根据本发明的一些实施方式的微射流均质机处理器的结构图。

图4是根据本发明的一些实施方式处理释放的孢子被的操作流程图。

图5是根据本发明的一些实施方式处理释放的孢子被并从释放的孢子被 中将孢子体脱囊的操作流程图。

具体实施方式

在下文参考附图更完整地描述本发明，所述附图中表明了本发明的优选 实施方式。然而，本发明可以以很多不同的形式具体表达，并且不应解释为 限定在本文所提出的实施方式内；较为合适地是，提供这些实施方式使本公 开彻底而完整，并且能向本领域的技术人员完整传达本发明的范畴。

全文中相似的数字表示相似的部件。在图中，为清晰起见，可以将某些 线、层、组分、元件或特征的厚度放大。本文提及的所有公开出版物、专利 申请、专利和其他文献通过引用全部并入本文。

本文所用术语仅为描述具体的实施方式，不意欲限定本发明。如本文所 使用的，单数形式意欲也包括复数形式，除非上下文清楚地表明并非如此。 还应理解的是，术语“包括”当用于本说明时，说明存在所述特征、步骤、 操作、元件和/或组分，但是不排除存在或加入一种或多种其他特征、步骤、 操作、元件、组分，和/或其组别。如本文所使用的，术语“和/或”包括列出 的相关条款中的任何一项和一项或多项的全部组合。如本文所使用的，短语 如“在X和Y之间”和“在约X和Y之间”应该解释为包括X和Y。如本 文所使用的，短语如“在约X和Y之间”表示“在约X和约Y之间”。如本 文所使用的，短语如“从约X至Y”表示“从约X至约Y”。

除非特别定义，本文使用的所有项(包括技术和科学项)与本发明所属 领域中一名普通技术人员通常理解的意义相同。还应理解的是，这些项如在 常用字典中定义的那些，应该解释为与本说明的上下文和相关领域中的意义 一致，并且不应以理想化或具有过于表面化意义的方式解释，除非本文清楚 地如此定义。为简洁和/或清晰，可以不详细描述熟知的功能或构造。操作顺 序(或步骤)不限于权利要求或图中提出的顺序，除非特别说明。

本发明的实施方式适于为医药和兽医用途以及诊断和/或研究目的而从 卵囊中释放孢子被。卵囊可以来自能感染任何动物受试对象的原生动物，所 述动物受试对象包括哺乳动物和鸟类受试对象。术语“动物”和“动物受试 对象”包括但不限于哺乳动物和/或鸟类受试对象。合适的哺乳动物受试对象 包括但不限于灵长类动物受试对象(例如，人类受试对象和非人类灵长类动 物受试对象如猿)、猪科动物、牛科动物(例如，家牛)、山羊、马科动物、 猫科动物、绵羊、犬科动物、鼠科动物(例如，小鼠、大鼠)和兔科动物受 试对象。

如本文所使用的，术语“鸟类”和“鸟类受试对象”(即，“鸟”和“鸟 受试对象”)意欲包括任何鸟类的雄性和雌性，但是主要意欲包含商业饲养用 于产蛋、肉或作为宠物的家禽。因此，术语“鸟类”和“鸟类受试对象”特 别意欲包含但不限于鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑、野鸡、长尾小鹦鹉、鹦鹉、 美冠鹦鹉、澳洲鹦鹉、鸵鸟、鸸鹋等。在具体的实施方式中，鸟类受试对象 是鸡或火鸡受试对象。如本文所使用的，“鸟类”或“鸟类受试对象”可以指 鸟类胚胎或孵化后的鸟类。

本发明领域的技术人员能很好地理解术语“冻存”，所述术语指通过在非 常低的温度冷冻并保存的方式保存细胞和其他材料。

本发明通常涉及从原生动物卵囊中释放孢子被的方法。这些方法可以用 于例如制造疫苗的方法中。很多原生动物形成名为“卵囊”的生命阶段。能 够实施本发明，从包含孢子被的任何种类原生动物的卵囊中释放孢子被，所 述原生动物包括但不限于艾美球虫(Eimeria)、环孢球虫(Cyclospora)、弓形虫 (Toxoplasma)、新孢球虫(Neospora)和等孢球虫(Isospora)。

本发明还可以涉及从原生动物卵囊中释放孢子体的方法。一些原生动物 形成名为“卵囊”的生命阶段，但是可以在卵囊中包含孢子体而不产生孢子 被。这样的方法可以用于例如从卵囊释放孢子体的方法中，所述方法包括但 不限于细胞系感染、感染试验、制造疫苗或诊断试验。可以实施本发明，从 在卵囊中包含孢子体的任何种类寄生虫的卵囊中释放孢子体，所述寄生虫包 括但不限于隐孢子虫(Cryptosporidium)和原形体(Plasmodium)。

在本领域中，术语“原生动物”、“卵囊”、“孢子被”、“孢子体”和“裂 殖子”具有已被广为接受的含义。除非特别说明，尽管本领域技术人员理解 应该使用已杀死的原生动物、卵囊、孢子被、孢子体和裂殖子配制疫苗，但 是这些术语意欲表示活的原生动物、卵囊、孢子被、孢子体和裂殖子，包括 减毒形式。本领域技术人员应理解的是，已杀死的疫苗通常通过首先纯化活 生物体而制备。本文还包含基因改造的原生动物、卵囊、孢子被、孢子体和 裂殖子。

术语“艾美球虫”表示艾美球虫属的一个或多个种类。术语“艾美球虫” 包括但不限于可以感染鸟(例如，鸡、火鸡)或哺乳动物(例如，牛、羊或 兔)种类的艾美球虫的菌株或种。这样的艾美球虫种包括在鸡中发现的那些， 包括但不限于，柔嫩艾美球虫、堆型艾美球虫、巨型艾美球虫、毒害艾美球 虫、和缓艾美球虫、早熟艾美球虫、变位艾美球虫和布氏艾美球虫；还有在 火鸡中发现的那些，包括但不限于，火鸡和缓艾美球虫、腺艾美球虫、火鸡 孔雀艾美球虫、分散艾美球虫、无害艾美球虫和近圆艾美球虫；以及那些可 以感染牛的艾美球虫，比如但不限于，牛艾美球虫和邱氏艾美球虫；可以感 染羊的艾美球虫，比如但不限于，阿撒他艾美球虫、巴库艾美球虫、槌形艾 美球虫、浮氏艾美球虫、颗粒艾美球虫、错乱艾美球虫、马尔西卡艾美球虫、 类绵羊艾美球虫、苍白艾美球虫、小型艾美球虫、温布里吉艾美球虫；以及 能感染兔的艾美球虫种，包括但不限于，肠艾美球虫、维氏艾美球虫、梨形 艾美球虫、盲肠艾美球虫、无残艾美球虫、黄艾美球虫、小型艾美球虫、大 型艾美球虫、穿孔艾美球虫、中型艾美球虫和斯氏艾美球虫。此外，术语“艾 美球虫”包括前述艾美球虫种的所有菌株，包括但不限于，野生型菌株、早 熟或特别筛选的菌株、减毒菌株，和已经减毒的卵囊，例如，通过辐射、化 学处理等。此外，术语“艾美球虫”还包括任何新发现的艾美球虫菌株或种。 最后，术语“艾美球虫”包含活的和已杀死的艾美球虫，虽然除非特别说明 意欲表示的则是活的艾美球虫。

包含艾美球虫卵囊的组合物可以用于使鸟对抗球虫病免疫的方法中。为 鸟接种疫苗抗球虫病的方法在本领域中已知，并且包括胚胎(例如，美国专 利6,500,438；美国专利6,495,146；和美国专利6,627,205；Pfizer Inc.)和孵 化后(例如，属于Auburn Research Foundation的美国专利3,147,186；美国专 利5,055,292和美国专利4,438,097，两者均属于National Research Development Corporation)疫苗接种方法。

术语“原生动物”包括野生型菌株，早熟或特别筛选的菌株、减毒菌株， 和已经减毒的卵囊，例如，通过辐射、化学处理等。此外，术语“原生动物” 还包括任何新发现的原生动物菌株或种。最后，术语“原生动物”包含活的 和已杀死的原生动物，虽然除非特别说明意欲的则是表示活的原生动物。术 语“产生”或卵囊的“产生”等通常指从动物中收获卵囊并从粪便材料中纯 化卵囊的过程。

产生卵囊如艾美球虫卵囊的方法在本领域中已知(参见，例如，属于 Aubum Research Foundation的美国专利3,147,186；术语Internationale Octrooi Maatschappij”Octropa”B.V.的美国专利4,544,548；属于Unilever Patent Holdings的美国专利4,863,731；属于Pfizer，Inc.的国际专利公开WO 00/50072；属于Embrex，Inc.的WO 03/020917；和属于Novus International，Inc. 的WO 02/37961；Hammond等，(1944)Amer.J.Vet.Res.5：70；Hill等，(1961)J. Parasit.47：357；Jackson，(1964)Parasitology 54：87；Lotze等，(1961)J.Parasit. 47：588；Schmatz等，(1984)J.Protozool.31：181；Whitlock，(1959)Aust.Vet.J. 35：310；Kowalik等，(1999)Parasitol.Res.85：496-499.)。

参考图1-2，现在将讨论根据本发明的一些实施方式从产孢卵囊中释放 孢子被的方法。起初，可以用热和/或化学和/或酶预处理产孢卵囊，削弱卵囊 的壁(框100)。由热、化学和/或酶处理导致的削弱使卵囊壁容易通过之后施 加的剪切力而破裂。示例性的热处理包括但不限于，将卵囊加热至37℃和 41℃之间0.5小时至2小时。示例性的化学处理包括但不限于，次氯酸盐溶 液或包含溶解的二氧化碳和半胱氨酸盐酸盐的水溶液，以及牛磺脱氧胆酸。 示例性的酶处理包括但不限于，例如，胃蛋白酶和多种磷脂酶。热、化学和/ 或酶预处理产孢卵囊是可选的，不是本发明的实施方式所必需。此外，特定 类型的产孢卵囊可以不需要预处理来削弱其壁。可以使用热、化学和/或酶处 理的多种组合。

制备包含悬浮于其中的产孢卵囊的水溶液(框110)。示例性的水溶液包 括但不限于，Hank’s平衡盐溶液(HBSS)、磷酸缓冲盐(PBS)、RPMI培养基、 DMEM培养基，或与蛋白质如酪蛋白或蛋白质水解产物如酪蛋白水解产物或 大豆蛋白水解产物组合的上述溶液。然后使水溶液经受足以使卵囊壁破裂并 从中释放孢子被的剪切力(框120)。从水溶液中回收所释放的孢子被(框 130)。可以对回收的孢子被进行后续处理(框140)和/或可以冻存(框150)。

参考图2，根据本发明的一些实施方式，通过在压力下(例如，在约2,000 psi和约6,000psi之间)使水溶液通过微射流均质机处理器腔室(框122)， 使水溶液经受足以使卵囊壁破裂并从中释放孢子被的剪切力(框120)。可从 Microfluidics Corporation，30 Ossipee Road，Newton，MA获得微射流均质机 处理器。微射流均质机允许高压溶液流以超高速在精确设定 的微通道或腔室中撞击。(可以使用的其他细胞破裂设备包括但不限于，由 Constant System Ltd.，Daventry，Northants，NN11 4SD，England，UK生产的 Constant Cell Disruption System)。本发明的实施方式不限于使用微射流均质机 处理器腔室。

微射流均质机处理器腔室对流过其中的溶液施加剪切和撞击的组合力。 每个腔室设计有固定的几何规格，并且经过配置使产物流加速至高速。固定 几何规格的构造允许对施加的剪切力进行精确的控制与监控。

通过使用腔室几何规格、腔室直径和施加压力的有限组合，可以实现对 剪切力的控制。受控过程的其他方面包括使用溶液的性质和配制，包括参数 如粘度、比重、化学组成、渗透压、pH和温度。可以由本领域技术人员使用 常规过程确定最优条件。通过在仅使用缓冲液的有限条件下进行测试实验和 测定流速，可以确保过程的一致性。通过这样的测试在一段时间内追踪流速 可以得到设备中磨损情况或系统中其他错误的指示迹象，并且可以采取修正 措施使系统恢复标准操作条件。

根据本发明的一些实施方式可以使用的示例性微射流均质机处理器腔室 包括具有“Y-型”和“Z-型”构造的腔室。Y-型腔室包括两个交汇于一点的 进料流道和作为单独流道的出口。Z-型腔室具有Z-型的单一流道。用于孢子 被最优回收的腔室构造可以因物种而异。因此，对于不同类型的卵囊可以选 择不同的腔室构造。此外，可以串联安放微射流均质机处理器腔室。

此外，微射流均质机处理器腔室可以具有不同的直径。例如，可以采用 在约75微米(μm)和约500μm之间的直径。不同直径的微射流均质机处理器 腔室也可以串联安放。

申请人发现，直径与溶液中卵囊直径基本相等或大于卵囊直径的腔室特 别有效。例如，对于巨型艾美球虫卵囊，其直径通常约20μm至40μm，优 选直径约300μm的反应腔室。然而，也可以使用从约75μm至约400μm范 围中的直径。通常，使用的流道是Z构造，尽管也可以使用Y构造和其他构 造。流速通常在从约每分钟500mL至约每分钟2000mL的范围中，压力在 从1000至5000psi的范围中。从巨型艾美球虫卵囊释放孢子被通常需要的剪 切力的量从约每分钟3.00×10⁵sec^-1至约每分钟1.50×10⁶sec^-1。

对于柔嫩艾美球虫卵囊，其直径通常为约15μm至25μm，和堆型艾美 球虫，其直径通常为约10μm至15μm，优选直径为100μm的微射流均质机 处理器反应腔室。然而，也可以使用从约75μm至约400μm的直径。通常， 使用的流道为Z构造，尽管也可以使用Y构造或其他构造。流速通常在从约 每分钟100mL至约每分钟250mL的范围中，压力在从1000至4000psi的范 围中。从卵囊释放柔嫩艾美球虫或堆型艾美球虫孢子被通常需要的剪切力的 量从约每分钟1.00×10⁶sec^-1至约每分钟3.00×10⁶sec^-1。

对于任何种艾美球虫卵囊，可以使用产生更低剪切力的条件从卵囊释放 孢子被，特别是当卵囊已经进行了热、化学或酶预处理时。尽管可以多次通 过腔室，但是优选一次通过。

本发明的实施方式不为特定卵囊限定特定的腔室直径。本发明的实施方 式可以利用具有所有类型构造和直径的腔室。

参考图3，其中描述了微射流均质机处理器200。所描述的微射流均质机 处理器200包括入口储罐202，其中盛有产孢卵囊的水溶液。通过泵204(例 如，常压增强泵等)对水溶液加压并泵出使其通过腔室206(例如，Y-型、 Z-型腔室等)。在腔室206中对加压水溶液中的卵囊施加剪切力和碰撞力，从 卵囊壁释放孢子被。在出口储罐208中收集包含所释放的孢子被的水溶液。

回顾图1，根据本发明的一些实施方式，可以确定从卵囊释放和回收的 孢子被的百分比(即，孢子被得率)(框160)。可以通过，例如，显微镜评 价孢子被收率。由显微镜认定回收的孢子被可以是活的或死的或其混合物。 然而，仅通过显微镜不能确定存活状态。因此，还可以进行测定，确定释放 的孢子被中活孢子被的百分比(即，活性收率)。确定活性收率需要体内过程。 适当的体内过程可以包括通过经口喂食向鸟类受试对象施用孢子被制备物并 将得到的卵囊产出结果与通过施用相当数量的完整卵囊获得的结果相比较。

参考图4，可以以多种方法和为多种目的处理回收的孢子被。例如，可 以从回收的孢子被制备疫苗(框141)并冻存以保存(框142)。参考图5， 根据本发明的一些实施方式，可以处理回收的孢子被，从中释放(即，脱囊) 孢子体(框143)。可以使用释放的孢子体制备疫苗(框144)或者可以用于 一些其他目的。从脱囊孢子体制备的疫苗可以冻存以保存(框145)。

根据本发明的实施方式，可以处理任何类型的卵囊。特别合适的卵囊是 艾美球虫卵囊，包括但不限于，巨型艾美球虫卵囊、和缓艾美球虫卵囊、柔 嫩艾美球虫卵囊、堆型艾美球虫卵囊、布氏艾美球虫卵囊、毒害艾美球虫卵 囊、早熟艾美球虫卵囊、变位艾美球虫卵囊及其任何组合，火鸡和缓艾美球 虫卵囊、腺艾美球虫卵囊、火鸡孔雀艾美球虫卵囊、分散艾美球虫卵囊、无 害艾美球虫卵囊和近圆艾美球虫卵囊及其任何组合，邱氏艾美球虫卵囊、牛 艾美球虫卵囊及其任何组合，阿撒他艾美球虫卵囊、巴库艾美球虫卵囊、槌 形艾美球虫卵囊、浮氏艾美球虫卵囊、颗粒艾美球虫卵囊、错乱艾美球虫卵 囊、马尔西卡艾美球虫卵囊、类绵羊艾美球虫卵囊、苍白艾美球虫卵囊、小 型艾美球虫卵囊、温布里吉艾美球虫卵囊及其任何组合，肠艾美球虫卵囊、 维氏艾美球虫卵囊、梨形艾美球虫卵囊、盲肠艾美球虫卵囊、无残艾美球虫 卵囊、黄艾美球虫卵囊、小型艾美球虫卵囊、大型艾美球虫卵囊、穿孔艾美 球虫卵囊、中型艾美球虫卵囊、斯氏艾美球虫卵囊及其任何组合。

已经描述了本发明，同样的内容将以下述实施例更详细地解释，所述实 施例仅为说明目的包括于本文中，不意欲限定本发明。

实施例

实施例1

进行了一系列实验旨在较宽参数值范围内的孢子被回收和卵囊破裂。每 个实验使用500mL HBSS中的总数约2×10⁸的产孢卵囊(每mL 4×10⁵产孢卵 囊)；在微射流均质机处理器处理之前取部分样品计数。待测试的腔室直径根 据物种而不同：1)巨型艾美球虫：200、300、400微米直径腔室；2)柔嫩艾美 球虫：200、300微米直径腔室；3)堆型艾美球虫：125微米腔室。使用一次 通过模式。使用从2,000psig至6,000psig的压力，具体取决于研究。在通过 微射流均质机处理器之后，用HBSS将总体积调至1L，混合样品，并取部分 样品计数。通常地，使用每种条件进行三次重复实验。

使用血球计确定每次实验中回收的孢子被百分比和破裂的卵囊百分比。 理想地，孢子被回收百分比和卵囊破裂百分比均为100％。

使用微射流均质机处理器释放堆型艾美球虫孢子被

堆型艾美球虫1微射流均质机实验的结论：

1)观察到堆型艾美球虫破裂卵囊的百分比随着使用125微米腔室的压力 的增加而增加。

2)使用125微米腔室在5000psig获得孢子被回收的最佳结果(54％回收 率)。

使用微射流均质机处理器释放巨型艾美球虫1孢子被

数值为单次通过实验的至少三次重复的平均值。

巨型型艾美球虫1微射流均质机实验的结论：

1)孢子被释放过程几乎对所有腔室直径和测试压力的组合都运行得相 当好。

2)300微米腔室和3000psig压力的组合提供合适的初始标准条件，用于 使用微射流均质机处理器产生巨型艾美球虫1孢子被。

使用微射流均质机处理器释放巨型艾美球虫2孢子被

数值为单次通过实验的至少三次重复的平均值。

巨型型艾美球虫2微射流均质机实验的结论：

1)孢子被释放过程几乎对所有腔室直径和测试压力的组合都运行得相 当好。

2)300微米腔室和3000psig压力的组合被认为是最佳的。

使用微射流均质机处理器释放柔嫩艾美球虫1孢子被

数值为单次通过实验的至少三次重复的平均值。

柔嫩艾美球虫1微射流均质机实验的结论：

1)正如预期，对于测试的两种腔室，观察到柔嫩艾美球虫孢子被回收和 破裂卵囊的百分比均随着压力的增加而增加。

2)使用125微米腔室，在4000psig压力获得最佳结果。

本发明的实施方式为孢子被的回收提供超越常规组织研磨、玻璃珠和化 学释放方法的，可重复，可规模化的替代方法。提供了从巨型艾美球虫1和 巨型艾美球虫2基本定量地回收孢子被。观察到了柔嫩孢子被的接近定量回 收。堆型艾美球虫卵囊的回收率约为40-50％。

实施例2

使用细胞破裂设备释放孢子被需要优化释放条件，确保释放的孢子被的 活性。通过对鸟提供一定剂量的孢子被，并且通过计数由于感染而产生的相 关卵囊，可以评价活性。在细胞破裂设备腔室几何规格和压力不同的多种条 件下，可能在无活性状态从卵囊有效释放孢子被。即，与使用通过传统方法 如玻璃珠而释放的孢子被而实现的感染相比，由于施用孢子被而在鸟中产生 的感染可以减轻。必须认真评价腔室几何规格和压力条件，确保产生活的孢 子被。

使用玻璃珠或结构为100Z腔室的微射流均质机处理器，在2000psi或 5000psi，从堆型艾美球虫卵囊释放孢子被。然后使用每剂量1000、3000和 5000孢子被，以剂量响应模型对鸡施用由每种方法释放的孢子被。每种处理 采用三次重复实验，每次重复实验包含九只鸟。测试中还包括代表5000个孢 子被的、浓度为每剂量1250个产孢卵囊的卵囊对照。从填喂后4至7天将卵 囊收集到10％柠檬酸、0.75％过氧化氢和0.25丙酸的水溶液中。使用水使包 含卵囊的粪便的体积一致，混合并从中取样。使用McMaster的方法计数卵囊。 结果示于下表中：

压力对堆型艾美球虫孢子被的活性的影响

在接受处理的孢子被之间进行统计学比较。通常不同字母代表p＝.05的显著 差异。

结果表明，在每一剂量，使用微射流均质机在2000psi产生的孢子被和 使用传统玻璃珠方法产生的孢子被的活性相同，而使用微射流均质机处理器 在5000psi产生的孢子被活性显著低于每一剂量使用玻璃珠产生的活性。因 此必须通过实验确定获得活孢子被的压力范围。

实施例3

观察到，与更大的巨型艾美球虫种(长约40微米)相比，更小的艾美球 虫种，包括堆型艾美球虫(长约12微米)和柔嫩艾美球虫(长约20微米) 更不易受剪切影响。对于任何物种，通过在微射流均质机系统中增加压力而 产生更高水平的剪切能促进从卵囊获得孢子被的显微镜收率，但是更小的物 种特别需要有效的释放；然而，增加压力还能降低活性。降低压力来提高活 性本质上会牺牲收率。已经开发了预处理来调节卵囊壁，同时提供改进的显 微镜收率和改进的活性。

进行研究了解使用胆汁盐(牛磺脱氧胆酸(TDCA))、厌氧环境(鼓泡二 氧化碳)和温暖的温度(于37℃达1小时)的组合预处理卵囊的效果。研究 的目的是确定释放的孢子被的体外回收率(通过显微镜)和体内活性(通过 产生的卵囊)。

建立下述处理组：(1)堆型艾美球虫产孢卵囊对照；每剂1000个已产孢子 的卵囊；(2)玻璃珠产生的孢子被对照；每剂4000个孢子被；(3)微射流均质 机产生的未加预处理的孢子被对照；100μm腔室；2,000psi；4000孢子被； (4)微射流均质机产生的进行了预处理的孢子被，所述预处理包括0.75％牛磺 脱氧胆酸(TDCA)和于37℃鼓泡二氧化碳1小时；100μm腔室；2,000psi； 每剂4000孢子被；(5)微射流均质机产生的进行了预处理的孢子被，所述预处 理包括0.75％TDCA和于37℃鼓泡二氧化碳1小时；100μm腔室；3,000psi； 每剂4000孢子被；(6)微射流均质机产生的进行了预处理的孢子被，所述预处 理包括0.75％TDCA和于37℃鼓泡二氧化碳1小时；100μm腔室；4,000psi； 每剂4000孢子被。使用Percoll从孢子被制备物中去除残余的完整卵囊和卵 囊壳。将孢子被以每剂4,000个孢子被的剂量输送给鸟，提供相当于每剂1,000 个卵囊的对照的剂量，因为每个卵囊包含四个孢子被。

用显微镜评价从卵囊回收孢子被的回收率。微射流均质机产生的材料的 结果总结于下面的表中：

使用预处理的堆型艾美球虫孢子被的显微镜回收率

  处理   预处理   微射流均质机压力(psi)   回收的孢子被(％)   3   无   2000   5.42   4   有   2000   33.70   5   有   3000   54.90   6   有   4000   65.48

在2000psi，预处理将孢子被回收率提高了约六倍，并且随着压力的增加， 观察到显微镜回收率的进一步提高。

为了进行体内评价，每种处理使用5次重复实验，每次九只鸟。通过口 服填喂进行处理。填喂后4至7天，将粪便收集在10％柠檬酸、0.75％过氧化 氢和0.25％丙酸的水溶液中。使包含卵囊的粪便体积一致、混合并从中取样。 使用McMaster方法计数卵囊。

通过比较每只鸟产生的卵囊，相对于玻璃珠产生的孢子被对照，评价使 用所述释放方法产生的孢子被活性。在下表中总结了结果：

从预处理的卵囊中释放的堆型艾美球虫孢子被的活性

  处理   艾美球虫   生命阶段   预处理   释放方法   微射流均   质机压力   (psi)   每只鸟平   均产生的   卵囊   相对于玻璃   珠对照的活   性百分比   1   产孢卵囊   NA   NA   NA   3.00×10⁷  NA   2   孢子被   NA   玻璃珠   NA   2.97×10⁷  100.0   3   孢子被   无   微射流均   质机   2000   2.58×10⁷  86.9   4   孢子被   有   微射流均   质机   2000   4.05×10⁷  136.4   5   孢子被   有   微射流均   质机   3000   2.41×10⁷  81.1   6   孢子被   有   微射流均   质机   4000   4.03×10⁷  136.0

对于每只鸟平均产生的卵囊，各组处理之间没有显著差异(p＞.05)。在较 宽范围的压力下，预处理使释放的卵囊活性增加。在某些情况下，通过微射 流均质机方法从预处理的卵囊释放的孢子被活性在数值上高于玻璃珠释放的 孢子被。因此预处理的总体效果为两倍，既在释放步骤中提高从卵囊的回收 率，还提高活性。

前述为对本发明的说明，不应理解为对其的限定。尽管已经描述了本发 明的一些示例性实施方式，但是本领域的技术人员应了解的是，在不实质背 离本发明的教导和优势的情况下，实例实施方式中很多修正都是可能的。因 此，所有这些修正意欲包括在如权利要求所定义的本发明的范畴中。本发明 通过下述权利要求定义，本文包括权利要求的同义内容。