一种快速筛选高油脂含量微藻种质的方法

摘要

本发明公开了一种快速筛选高油脂含量微藻种质的方法，是采集水样后进行优势藻种培养分离，然后采用酶标仪检测490nm处的吸光值来快速反映藻类的生长情况，采用脂溶性的荧光染料尼罗红对微藻进行染色，利用荧光酶标仪，485nm激发光，575nm消散光用于定量检测微藻细胞脂的含量，最终确定纯种藻株后做藻种保藏。本发明筛选过程变得简便、高效，可从自然水体大规模、高效、快速分离高油脂、高生长速率微藻种质，在微藻分离的同时，整合生物量、油脂含量的同步监测，一步筛选出合适的藻种，整个分离、筛选、检测过程中无需改变培养容器，能实现高通量筛选，通过不同的检测程序一步得到目标藻株，大大提高筛选的工作效率。

说明书

技术领域

本发明涉及可再生能源领域，具体是一种快速筛选高油脂含量微藻种质的方法，利用该方法可从自然水域(淡水或海水)快速高效分离筛选到所需人工培养条件的目标藻株，用于制备生物柴油的原料。

背景技术

随着全球经济一体化的不断发展，世界能源形势日趋紧张，并且为了顺应可持续发展的需要及愈加严格的环保要求，寻找一种绿色的可持续发展的新能源，成为各国关注的问题。开发可再生、环保的新能源已成为各国普遍关注的焦点之一，其中利用微藻制备生物柴油更以其无可比拟的优点成为生物柴油领域的热点。利用藻类生物质生产液体燃料，对缓解人类面临的粮食、能源、环境三大危机，有着巨大的潜力，同时对于减少生产生活中对石油的依赖、保证国家能源安全具有深远意义。

以微藻为原料生产生物柴油具有其他生物无可比拟的优势：单细胞微藻光合作用效率高，生长周期短、生长速度快、单位生物量大，在生产中可利用发酵技术在光生物反应器中高密度、高速率培养、不与农作物争肥争地。

目前，微藻制备生物柴油的研究主要集中在两个方面：一是对生物柴油生产工艺的研究；二是生物柴油的生产原料的研究。成本过高一直是生物柴油产业化发展的瓶颈问题，最有效的解决方式是从降低原料成本入手，这成为从源头上降低生物柴油产品成本的重中之重，筛选分离生长速度快、油脂含量高的优质微藻种质能最大限度降低原料成本，增加生物柴油大规模产业化的可行性、最终达到为社会建设和人民生活服务的目的。

现有常用的微藻种质分离技术有：1)微吸管分离法，采用口径极细的微吸管，将稀释适度藻液水样，置浅凹载玻片上，显微镜下镜下用微吸管挑选要分离的藻体，认真仔细地吸出，放入另一浅凹载片上达到分离目的。此法操作技术要求较高，往往吸取一个细胞，要反复几次才能成功，且只适于分离个体较大藻类。2)水滴分离法，用微吸管吸取稀释适度藻液，滴若干滴到无菌载片上，显微镜下观察，如一滴水中只有几个所需同种藻类，即用吸管吸取该滴培养物培养。此法也要求显微镜下观察操作，有一定操作难度，较适宜于分离已在培养液中占优势种类。使用环境、器具及培养液要求无菌。3)稀释分离法，把含有需要分离的藻类而又混杂有其他生物的水样，取其一定量，用培养液稀释。通过稀释到适宜程度的方法，达到把原混杂生物单个分离培养的目的。4)平板分离法，用接种环蘸取藻液在固体平板上划线，藻细胞就会散布在琼脂培养基的表面，经培养后，挑取单藻落。该方法较适合分离有有污染杂菌培养液的藻类。

目前，对高含油量微藻的筛选一般是以已经分离纯化的藻株为对象，采用脂肪抽提方法测定微藻细胞中的脂肪含量，然后，筛选出高含油量的藻株。脂肪抽提方法有：1)索氏抽提法：将微藻抽滤到0.45μm的滤膜上(滤膜事先已烘至恒重，记作M。)，105℃烘5h(与烘干滤膜的条件相同)，测量抽提前的滤膜和微藻总质量(M1)后，包入滤纸中，乙醚浸泡过夜，放入索氏抽提器的中结内，水浴加热30℃，蒸发回流反复抽提10h以上，取出滤纸包，将滤膜烘干称重记录为M2。根据公式计算脂肪的含量：粗脂肪含量(％)＝(粗脂肪重量/硅藻干重)×100％＝(M1-M2)/(M1-Mo)×100％。2)氯仿-甲醇抽提法：称取烘干的微藻样品5克，放入200毫升具塞三角瓶中加入60毫升氯仿-甲醇混合液.连接布氏漏斗，于60度水浴中，从微沸开始计时提取1小时，提取结束后，取下三角瓶，用布氏漏斗过滤，滤液用另一具塞三角瓶收集，用氯仿-甲醇混合液洗涤烧瓶、滤器及滤器中的试样残渣，洗涤液并入滤液中，置于65～70℃水浴中回收溶剂，至三角瓶内物料显浓稠态，但不能使其干涸，冷却。用移液管加入25ml乙醚，再加入15克无水硫酸钠，立刻加塞振荡10分钟，将醚层移入离心管中，以3000r/min离心5min进行分离。用移液管迅速吸取离心管中澄清的醚层10ml，于以衡重的称量瓶内，蒸发去除石油醚后，于100～105℃烘箱中烘至衡重(约30分钟)。根据公式计算脂肪的含量：脂类质量分数＝(称量瓶与脂类质量-称量瓶质量)×2.5(从25ml乙醇中取10ml进行干燥，故乘以系数2.5)/试样质量×100％w＝(m2-m1)×2.5/m×100％。上述方法测定脂肪含量，微藻样品需要量大，需要消耗大量的化学制剂，工序复杂，误差较大，耗时较长。

对于含油量高、生长速率快、适合产业化生产的优质微藻种质的大规模分离筛选，目前尚无高效系统的方法。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足而提供一种快速筛选高油脂含量微藻种质的方法，其是将微藻的分离和高通量的筛选高含油量的藻株有机结合在一起，采用酶标仪对生长在96孔板上的微藻样品的分离培养和含油量做全程的可持续检测分析，快捷方便，在微藻分离的同时，整合生物量、油脂含量的同步监测，一步筛选出合适的藻种，大大提高筛选的工作效率。

本发明所采用的技术原理：取水样样品采用96孔板在不同培养基种类和不同培养基浓度条件下进行分离培养，利用生物量的同步监测(根据微藻细胞在490nm处的吸光值和细胞密度的显著正相关性，采用酶标仪检测490nm处的吸光值来快速反映藻类的生长情况)、油脂含量同步监测(采用脂溶性的荧光染料尼罗红，其具有活体原位测定的特性，微藻经尼罗红染色后，在485nm激发光，荧光显微镜定性检测，中性脂发金黄色荧光，而极性脂发红色荧光，利用荧光酶标仪，485nm激发光，575nm消散光用于定量检测微藻细胞脂的含量)，最终筛选到生长速度快、油脂含量高的优质微藻种质，然后做藻种保藏。

本发明所采用的技术方案：

一种快速筛选高油脂含量微藻种质的方法，其步骤如下：

1.自然水体样品的采集

自海洋、湖泊、河流或水塘采集有可能生长所需单胞藻的水体为水样，然后将水样经350目筛绢过滤以除去浮游生物。

2.样品的培养分离

将采集的自然水样混匀，然后加入50-200μg/ml氨苄青霉素、50-100μg/ml卡那霉素和50-100μg/ml庆大霉素，用于抑制和除去自然水样中的各类细菌污染，保证微藻能够正常的生长。将水样按照1∶20的体积比分别接种于培养基AE1，AE2，AE3，AE4四种培养基中。

四种培养基的成分如下：

1.AE1：NaNO₃ 0.2～0.4g.L^-1，K₂HPO₄·3H₂O 0.05～0.08g.L^-1，MgSO₄·7H₂O 0.05～0.09g.L^-1，CaCl₂·2H₂O 0.02～0.05g.L^-1，KH₂PO₄0.1～0.3g.L^-1，NaCl 0.02～0.5g.L^-1，Soil extract 40ml，FeCl₃·6H₂O 0.002～0.006g.L^-1，Fe-EDTA 0.05～0.1g.L^-1，H₃BO₃ 2.0～3.0g.L^-1，MnCl₂·4H₂O 1.0～2.0g.L^-1，ZnSO₄·7H₂O 0.15～0.30g.L^-1，CuSO₄·5H₂O 0.60～0.90g.L^-1，(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 0.2～0.5g.L^-1。

2.AE2：NaNO₃1～3g.L^-1，K₂HPO₄·3H₂O 0.03～0.05g.L^-1，MgSO₄·7H₂O 0.05～0.08g.L^-1，CaCl₂·2H₂O 0.03～0.05g.L^-1，citricacid 0.005～0.007g.L^-1，Ferric ammonium citrate 0.005～0.007gL^-1，EDTA(dinatrium-salt)0.001～0.002g.L^-1，Na₂CO₃ 0.01～0.03g.L^-1，H₃BO₃ 2.0～3.0g.L^-1，MnCl₂·4H₂O 1.0～2.0g.L^-1，ZnSO₄·7H₂O 0.15～0.30g.L^-1，CuSO₄·5H₂O 0.60～0.90g.L^-1，Na₂MoO₄·2H₂O 0.25～0.45g.L^-1，CoCl₂·6H₂O 0.03～0.05g.L^-1。

3.AE3：Tris Base 2～3g.L^-1，Glacial acetic acid 1～3ml.L^-1，K₂HPO₄ 0.1～0.2g.L^-1，KH₂PO₄ 0.05～0.08g.L^-1，NH₄Cl 0.03～0.05g.L^-1，MgSO₄·7H₂O 0.01～0.02g.L^-1，CaCl₂·2H₂O 0.005～0.07g.L^-1，H₃PO₄ 0.001～0.003g.L^-1，MnCl₂·4H₂O 0.004～0.006g.L^-1，ZnSO₄·7H₂O0.02～0.03g.L^-1，FeSO₄·7H₂O 0.004～0.006g.L^-1，CoCl₂·2H₂O 0.001～0.002g.L^-1，(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 0.001～0.002g.L^-1。

4.AE4：NaNO₃ 0.3～0.5g.L^-1，CO(NH₂)₂ 0.1～0.3g.L^-1，K₂HPO₄·3H₂O 0.05～0.1g.L^-1，FeC₆H₅O₇ 0.005～0.008g.L^-1，CaCl₂·2H₂O 0.02～0.3g.L^-1，Soil extract 10ml.L^-1，Vb1 200～300ug.L^-1，Vb12 400～500ng.L^-1，H₃PO₄ 0.001～0.003g.L^-1，MnCl₂·4H₂O 0.004～0.006g.L^-1，ZnSO₄·7H₂O 0.02～0.03g.L^-1，FeSO₄·7H₂O 0.004～0.006g.L^-1，CoCl₂·2H₂O 0.001～0.002g.L^-1，(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 0.001～0.002g.L^-1。

将每种培养基按12个浓度梯度放入具有96孔的培养板中，将培养板置于温度为21～28℃，光照强度为1500～5000LUX的条件下培养。由于不同的藻种最适培养基的成分和浓度之间的差异，在不同的培养基种类和浓度条件下就有不同的最适生长微藻，当该种微藻大量增值，形成优势种群后，在群落间的竞争背景下，非优势种渐渐衰落，优势种渐渐增强，最终非优势种死亡，仅剩下优势藻种生长，达到分离的目的。

3.生长速率和生物量的监测

根据微藻细胞在490nm处的吸光值和细胞密度呈显著的正相关性，吸收值越大，藻的浓度就越大。利用酶标仪检测490nm处的吸光值来快速反映藻类的生长情况；每隔12～24小时用酶标仪监测光吸收值来快速反映藻类的生长情况，绘制每个培养小室的微藻生长曲线，计算生长速率，同时用倒置显微镜观察藻细胞的生长状况及培养纯度。

4.样品含油量的监测

含油量的测定采用脂溶性的荧光染料尼罗红，其具有活体原位测定的特性，微藻经尼罗红染色后，在485nm激发光，荧光显微镜定性检测，中性脂发金黄色荧光，而极性脂发红色荧光，利用荧光酶标仪，485nm激发光，575nm消散光用于定量检测微藻细胞中性脂的含量。监测藻细胞生长，待细胞生长到平台期，用尼罗红染色后用荧光酶标仪检测光密度值以确定为微藻的含油量，从而筛选到适合生产生物柴油的理想微藻种质。

5.微藻种质的最后纯化和镜检

根据所筛选到的目的藻种相对应小室内的培养基的种类和浓度制做固体培养平板，取该小室的微藻做平板划线，待长出单藻落后，从平板上挑取直径较大的藻落再做一次平板划线，得到生长速度较快和细胞体积较大的藻种的优秀藻株，同时在400X显微镜下观察该种微藻的形态和均一度，最终确定为纯种藻株后，做藻种保藏。

本发明筛选过程变得简便、高效，可从自然水体大规模、高效、快速分离高油脂、高生长速率微藻种质，在微藻分离的同时，整合生物量、油脂含量的同步监测，一步筛选出合适的藻种，整个分离、筛选、检测过程中无需改变培养容器，能实现高通量筛选，通过不同的检测程序一步得到目标藻株，大大提高筛选的工作效率。

附图说明

图1是不同小室间藻种的中性脂的含量。

图2是中性脂定量测定的吸收波长扫描曲线。

图3是不同培养基培养条件下的生长曲线。

图4是微藻含油量的定性检测及油滴的细胞定位分析。

具体实施方式

以下结合实例为本发明作进一步详细的描述。

第一步，自然水体样品的采集，2009年2月27日于海南省海口市东湖(E：110°20’20.62”N：20°02’14.29”)用2个50ml无菌离心管从自然水体中取约40ml水样盖紧管盖标清楚编号，采集的2份水样带回实验室后要经350目筛绢过滤3次以除去浮游生物，然后放置在自然环境条件下培养24h。

第二步，培养基的配制及其浓度梯度的设置，分别配制AE1、AE2、AE3、AE4四种液体培养基各50ml，配方如下：

1.AE1(1000ml)

2.AE2(1000ml)

3.AE3(1000ml)

4.AE4(1000ml)

将水样振荡混匀后，在水样中添加氨苄青霉素100μg/ml、卡那霉素50μg/ml、庆大霉素100μg/ml，添加抗生素用于抑制和除去自然水样中的各类细菌污染，保证微藻能够正常的生长。

取1块96孔板(8行×12列)，8行从上到下标记为A、B、C、D、E、F、G、H，12列从左到右标记为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12。在A、E行加AE1培养基；B、F行加AE2培养基；C、G行加AE3培养基；D、H行加AE4培养基，每个微孔添加250ul培养基，1-12行按照10倍稀释设置12个浓度梯度。

第三步，接种培养分离，取2份采集得到的淡水水样，振荡混匀该样品，按照1∶20的体积比(每个微孔接种样品12.5ul)接种，1#样品接种A-D四行12列共48个微孔中，2#样品接种E-H四行12列共48个微孔中，一块96孔培养板可培养2个样品，将接种后的培养板加盖，置于温度为25℃、光照强度为3000-5000LUX的培养箱内持续光照培养。

第四步，微藻生物量的监测，用酶标仪检测490nm处的吸光值来快速反映藻类的生长情况，每24h用酶标仪测定一次490nm处的光吸收值，测定前充分振荡培养板，混匀培养物后，用酶标仪测定490nm的光吸收值来快速反映藻类的生长情况，根据每天的监测数据结合生长时间绘制每个培养小室的微藻生长曲线，(图3)计算生长速率，同时用倒置显微镜观察藻细胞的生长状况及培养纯度。

第五步，藻细胞中脂含量的定性定量测定，通过监测藻细胞生长状况，待细胞生长到生长平台期后的第6天，向每个小孔中加入0.1mg/ml尼罗红染料0.2ul，99.9％DMSO 2μl，静置10min后，用荧光酶标仪，以485nm激发波长，扫描500nm-750nm波长范围内尼罗红染色后微藻的荧光发射光谱，找到吸收峰后，做定量测定(图2)。最后以该光密度值值减去藻液在该波长的光密度值，即为中性脂的光密度值，通过制作标准曲线，换算成不同小室间藻种的中性脂的含量。(图1)

同时，用荧光显微镜定性检测，在450-490nm激发光下，中性脂发金黄色荧光，而极性脂发红色荧光，(图4)通过荧光显微镜进行含油量的定性检测及油滴的细胞定位分析，从而筛选到适合生产生物柴油的理想微藻种质。

最后，微藻种质的最后纯化和镜检根据所筛选到的目的藻种相对应小室内的培养基的种类和浓度制做固体培养平板，取该小室的微藻做平板划线，在温度为25℃，光照强度为2000LUX的条件下培养，直到长出单藻落后，从平板上挑取直径较大的藻落再做一次平板划线，这样得到的是生长速度较快和细胞体积较大的该藻种的优秀藻株，同时在400X显微镜下下观察该种微藻的形态和均一度，最终确定为纯种藻株后，做藻种保藏。

结果显示，不同种类培养基不同浓度的培养条件下，最适藻种生长种类差异明显，达到了分离的目的，同时不同微孔间的微藻含油量差异明显，个别藻株含油量较大，筛选到的高含油藻株为下一步的生物柴油开发原料的深入研究提供了宝贵的种质资源。