核糖核酸酶与毒蛋白膜转位结构域融合蛋白及其制备方法和用途

摘要

本发明提供了核糖核酸酶(Onc)与细菌毒蛋白膜转位结构域的融合蛋白，编码该融合蛋白的DNA序列，含该DNA序列的载体，含该载体的宿主细胞，用基因工程制备该融合蛋白的方法。本发明的融合蛋白既保有原来的Onc的活性，又具有更强的杀死肿瘤细胞的能力，可以更广谱地用于抗肿瘤治疗。

说明书

技术领域

本发明属于DNA重组技术和生物医药领域。更具体地，本发明涉及核糖核酸酶与细菌毒蛋白(毒素)膜转位结构域的融合蛋白，编码该融合蛋白的DNA序列，含该DNA序列的载体，含该载体的宿主细胞，利用基因工程技术制备该融合蛋白的方法，以及该融合蛋白在肿瘤治疗方面的应用。

背景技术

核糖核酸酶(Onconase又称：P30蛋白，Ranpirnase，简称Onc)是从北方豹蛙(Rana pipiens)的卵母细胞和早期胚胎中分离得到的一种核酸酶，属于RNaseA超家族。研究表明Onc通过胞吞作用进入哺乳动物细胞，在胞浆内选择性地降解tRNA，抑制蛋白质生物合成进而抑制细胞增殖和引起细胞凋亡。体外实验表明，Onc对多种肿瘤细胞具有抗增殖和细胞毒性作用，如：人的恶性间皮细胞瘤，非小细胞肺癌，前列腺癌细胞、胰腺癌细胞和白血病细胞等。小鼠模型的体内实验证明，Onc可以抑制肿瘤生长，延长小鼠存活时间，增强多种抗肿瘤药物的效果。目前，Onc作为一种抗恶性间皮细胞瘤的药物已经进入三期临床，是一种具有良好前景的抗肿瘤药物。最近，美国和澳大利亚已批准Onconase作为非常见病药物(Orphan Drug)投放市场。

然而，进一步的研究发现，不同肿瘤细胞对Onc的敏感性不同(UlrichArnold&Renate Ulbrich-Hofmann.Natural and engineered ribonucleases aspotential cancer therapeutics.Biotechnol Lett(2006)28：1615-1622)。这大大限制了Onc在肿瘤治疗中的适用范围。

因此，本领域需要进一步开发具有更好的抑制肿瘤效果且广谱性更强的抗肿瘤药物。

发明内容

本发明的目的在于提供核糖核酸酶与细菌毒蛋白膜转位结构域的融合蛋白，编码该融合蛋白的DNA序列，含该DNA序列的载体，含该载体的宿主细胞，利用基因工程制备该融合蛋白的方法，以及该融合蛋白在肿瘤治疗方面的应用。

在本发明的第一方面，提供一种融合蛋白，所述的融合蛋白包括：

(1)核糖核酸酶(Onc)；

(2)细菌毒蛋白的膜转位结构域；

(3)位于(1)和(2)之间的由0-50个(较佳地为5-30个，更佳的为10-20个)氨基酸构成的连接肽。

在另一优选例中，所述的核糖核酸酶位于融合蛋白的氨基端；所述的细菌毒蛋白的膜转位结构域位于融合蛋白的羧基端。

在另一优选例中，所述的细菌毒蛋白的膜转位结构域位于融合蛋白的氨基端，所述的核糖核酸酶位于融合蛋白的羧基端。

在另一优选例中，所述的融合蛋白基本上由(1)、(3)、(2)相连接而构成。更佳地，所述的融合蛋白由(1)、(3)、(2)相连接而构成。

在另一优选例中，所述的连接肽的序列中包括至少一个胞内蛋白酶的酶切位点序列，从而在进入胞内后将(1)和(2)分离。

在另一优选例中，所述的酶切位点序列不存在于核糖核酸酶序列或细菌毒蛋白的膜转位结构域序列上。

在另一优选例中，所述的胞内蛋白酶是特异性位于细胞内的蛋白酶。

在另一优选例中，所述的胞内酶选自(但不限于)：Furin、基质金属蛋白酶、前列腺特有抗原和组织蛋白酶。

在另一优选例中，所述的融合蛋白在进入细胞后被胞内酶酶切。

在另一优选例中，所述的细胞毒蛋白选自(但不限于)：白喉毒素(DT)或绿脓杆菌外毒素A(PE)。

在另一优选例中，所述的白喉毒素的膜转位结构域是：

(a)如SEQ ID NO：2中第121-308位的氨基酸序列的蛋白；或

(b)将(a)所限定的蛋白的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)所限定的蛋白功能的由(a)衍生的多肽；和/或

所述的核糖核酸酶是：

(a1)如SEQ ID NO：2中第1-104位所示的氨基酸序列(较佳地由SEQ IDNO：2中第1-104位的氨基酸序列构成)；或

(b1)将(a1)所限定的蛋白的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a1)所限定的蛋白功能的由(a1)衍生的多肽；和/或

所述的连接肽具有SEQ ID NO：2中第105-120位所示的氨基酸序列(较佳地由SEQ ID NO：2中第105-120位的氨基酸序列构成)。

较佳地，所述的融合蛋白具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

在本发明的第二方面，提供一种核酸分子，所述的核酸分子编码所述的融合蛋白。

在另一优选例中，所述的核酸分子具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

在本发明的第三方面，提供一种载体，它含有所述的核酸分子。

在本发明的第四方面，提供一种基因工程化的细胞，所述的细胞含有所述的载体；或所述的细胞基因组中整合有所述的核酸分子。

在本发明的第五方面，提供一种产生所述的融合蛋白的方法，所述的方法包括：

(A)培养所述的宿主细胞，从而表达所述的融合蛋白；

(B)分离出所述的融合蛋白。

在本发明的第六方面，提供所述的融合蛋白的用途，用于制备抑制肿瘤细胞生长或治疗肿瘤的组合物。所述的肿瘤选自(但不限于)：恶性间皮细胞瘤；肺癌；白血病；恶性淋巴瘤；骨髓瘤；恶性黑色素瘤；乳腺癌；神经系统肿瘤；肝癌；鼻咽癌；食管癌；胃癌；结肠癌；前列腺癌；宫颈癌；口腔癌；唾液腺肿瘤；鼻腔与鼻旁窦恶性肿瘤；喉癌；耳部肿瘤；眼部肿瘤；甲状腺肿瘤；纵隔肿瘤；胸壁；胸膜肿瘤；小肠肿瘤；胆道肿瘤；胰腺与壶腹周围肿瘤；肠系膜与腹膜后肿瘤；肾脏肿瘤；肾上腺肿瘤；膀胱肿瘤；前列腺癌；睾丸肿瘤；阴茎癌；子宫内膜癌；卵巢恶性肿瘤；恶性滋养细胞肿瘤；外阴癌与阴道癌；软组织肿瘤；骨肿瘤；或皮肤及附件肿瘤。

在本发明的第七方面，提供一种抑制肿瘤细胞生长或治疗肿瘤的组合物，所述的组合物含有：

(i)有效量的所述的融合蛋白；和

(ii)药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述的组合物是药物组合物。

另一方面，还提供一种抑制(如体外抑制)肿瘤细胞生长的方法，所述的方法包括利用所述的融合蛋白处理肿瘤细胞。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1显示了含ONC-DT融合蛋白基因的大肠杆菌表达质粒pET22b-ONC-DT_203-390的示意图。

图2显示了本发明Onc-DT_203-390的表达纯化效果蛋白SDS-PAGE电泳图。其中，

泳道1.蛋白分子量标准；

泳道2.诱导前菌体总蛋白；

泳道3.诱导3h后菌体总蛋白；

泳道4.诱导后菌体包涵体；

泳道5.复性并纯化后Onc-DT_203-390。

图3显示了MTT法测Onc-DT_203-390对小鼠骨髓瘤细胞SP2/0和人类白血病细胞K562的细胞毒性效果图。其中，

A：Onc-DT_203-390和Onc对小鼠骨髓瘤细胞SP2/0的细胞毒性作用比较。

B：Onc-DT_203-390和Onc对人白血病细胞K562的细胞毒性作用比较。

C：Onc-DT_203-390和Onc对人神经母细胞瘤SH-SY5Y的细胞毒性作用比较。

D：Onc-DT_203-390和Onc对人急性髓系白血病细胞株HL60的细胞毒性作用比较。

具体实施方式

本发明人经过长期的研究和试验，首次将核糖核酸酶(Onc)基因和细菌毒蛋白的膜转位结构域基因融合在一起，并在大肠杆菌中进行了高效表达，经纯化获得了核糖核酸酶-细菌毒蛋白膜转位结构域的融合蛋白。所述融合蛋白良好地保留了Onc的核酸酶活性，又提高了Onc进入细胞胞质的能力和抗肿瘤的广谱性，具有比Onc更优异的杀肿瘤效果，对肿瘤细胞(包括一些原来对Onc不敏感的肿瘤细胞)的毒性大为增强(对不同细胞的毒性可分别提高10-1000倍)，从而可作为一种新的更有效更广谱的抗肿瘤药物。

含有核糖核酸酶和细菌毒蛋白膜转位结构域的融合蛋白

如本文所用，术语“核糖核酸酶和白喉毒蛋白膜转位结构域的融合蛋白”、“ONC-DT融合蛋白”等可互换使用，都指由核糖核酸酶氨基酸序列和白喉毒蛋白膜转位结构域氨基酸序列融合而成的蛋白，其中在两者之间可以有或者没有连接肽序列。

本发明提供一种融合蛋白，该蛋白包括Onc蛋白或其生物活性片段，和细菌毒蛋白膜转位结构域或其生物活性片段，该分子能用于抑制肿瘤。更优选的，所述的融合蛋白是一种分离的蛋白，与其它蛋白、多肽或分子无联系，是重组宿主细胞培养的纯化产物或作为一种纯化的提取物。

如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由......构成”、“基本上由......构成”、和“由......构成”；“主要由......构成”、“基本上由......构成”和“由......构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。

核糖核酸酶

任何适合的Onc均可用于制备本发明的融合蛋白。本发明中的Onc是指一种多肽，能通过胞吞作用进入哺乳动物细胞(特别是肿瘤细胞)，在胞浆内选择性降解tRNA，或其它RNA，从而抑制蛋白质合成，并进而抑制细胞增殖和引起细胞凋亡。Onc对多种肿瘤细胞具有抗增殖和细胞毒性作用。

Onc或其中的生物活性片段包括一部分保守氨基酸替代序列，所述经氨基酸替换的序列并不影响其活性。适当替换氨基酸是本领域的公知的技术，所述技术可以很容易地被实施并且确保不改变所得分子的生物活性。这些技术使人们认识到，一般来说，在一种多肽的非必要区域改变单个氨基酸基本上不会改变生物活性。见Watson等Molecular Biology of The Gene，第四版，1987，TheBenjamin/Cummings Pub.Co.P224。表1是这种替换的一些示例。

表1

  原氨基酸残基  保守性置换  Ala(A)  Gly；Ser  Arg(R)  Lys  Asn(N)  Gln；His  Cys(C)  Ser  Gln(Q)  Asn  Glu(E)  Asp  Gly(G)  Ala；Pro  His(H)  Asn；Gln  Ile(I)  Leu；Val  Leu(L)  Ile；Val  Lys(K)  Arg；Gln；Glu  Met(M)  Leu；Tyr；Ile  Phe(F)  Met；Leu；Tyr  Ser(S)  Thr  Thr(T)  Ser  Trp(W)  Tyr  Tyr(Y)  Trp；Phe  Val(V)  Ile；Leu

可能还有其它的类似的可替换性，这种可替换性往往可以根据经验确定或者根据已知的保守序列进行确定。

任何一种Onc的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，Onc的生物活性片段的含义是指作为一种多肽片段，在与毒蛋白膜转位结构域连接并形成融合蛋白后，其仍然能保持全长的Onc的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持50％的全长Onc的抑制肿瘤活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的抑制肿瘤活性。

经过一个或多个(如1-30个，较佳地1-20个，更佳的1-10个，进一步的1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的Onc的氨基酸序列也包括在本发明中。所述的经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的Onc也具有抑制肿瘤的活性。

本发明也可采用经修饰或改良的Onc，比如，可采用为了延长其半衰期、改善其稳定性或增强其杀伤肿瘤细胞能力而加以修饰或改良的Onc。所述经过修饰或改良的Onc或者基因可以是与天然存在的Onc或基因虽然具有一定的不同点，但也能杀伤肿瘤细胞，且不会带来其它不良影响或毒性。也就是说，任何不影响Onc的生物活性或者说是基因的生物功能的变化形式都可用于本发明中。

在本发明的优选方式中，所述的Onc的氨基酸序列可以与SEQ ID NO：2中第1-104位所示的序列基本上相同。优选的，所述的Onc具有SEQ ID NO：2中第1-104位所示的序列；更优选的，所述的Onc由SEQ ID NO：2中第1-104位所示的序列构成。

细菌毒蛋白膜转位结构域

本发明的细菌毒蛋白的膜转位结构域是一类对毒素的的内吞有作用的蛋白质结构域。所述的细菌毒蛋白包括(但不限于)：DT或PE。尽管已知DT与PE的膜转位结构域有助于增强多种分子的内吞，然而以往并不知道它们对于Onc的内吞是否有作用。

作为本发明的优选方式，所述的细菌毒蛋白是DT，DT是白喉杆菌产生的细菌外毒素，其由三个结构域组成，N端为催化结构域，中间为膜转位结构域，C端为受体结合结构域。膜转位结构域的作用为帮助催化结构域穿过胞内体质膜进入胞质，发挥催化结构域的细胞毒性作用。

DT膜转位结构域或其中的生物活性片段包括一部分保守氨基酸替代序列，所述经氨基酸替换的序列可能并不影响其活性。可采用的一部分氨基酸替换的示例见表1。可能还有其它的类似的可替换性，这种可替换性往往可以根据经验确定或者根据已知的保守序列进行确定。

任何一种DT膜转位结构域的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，DT膜转位结构域的生物活性片段的含义是指作为一种多肽片段，在与Onc连接并形成融合蛋白后，其仍然能保持完整的DT膜转位结构域的全部或部分功能。正常情况下，所述的生物活性片段至少保持50％的完整DT膜转位结构域的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的活性。

经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的DT膜转位结构域的氨基酸序列也包括在本发明中。所述的经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的DT膜转位结构域也具有帮助Onc穿透肿瘤细胞膜的功能。

本发明也可采用经修饰或改良的DT膜转位结构域，比如，可采用为了延长其半衰期、改善其稳定性、增强其穿透细胞的能力或增强其穿透细胞的特异性而改良的DT膜转位结构域。所述经过修饰或改良的DT膜转位结构域或者基因可以是与天然存在的DT膜转位结构域或基因虽然具有一定的不同点，但也能帮助Onc穿透细胞膜，且不会带来其它不良影响或毒性。也就是说，任何不影响DT膜转位结构域的生物活性或者说是基因的生物功能的变化形式都可用于本发明中。

作为本发明的优选方式，所述的DT膜转位结构域的氨基酸序列可以与SEQ ID NO：2中第121-308位所示的序列基本上相同。优选的，所述的DT膜转位结构域具有SEQ ID NO：2中第121-308位所示的序列；更优选的，所述的DT膜转位结构域由SEQ ID NO：2中第121-308位所示的序列构成。

连接

所述的Onc或其活性片段和细菌毒蛋白膜转位结构域或其活性片段之间可以直接相连接，或者通过多肽连接子(连接肽)连接。作为本发明的一种优选的方式，所述的Onc或其活性片段和细菌毒蛋白膜转位结构域或其活性片段通过多肽连接子(连接肽)连接，从而形成融合蛋白。所述的连接子包括0-50个氨基酸；较佳地为5-30个氨基酸，更佳地为10-20个氨基酸。

作为本发明的优选方式，所述的连接肽的序列中包括至少一个胞内酶的酶切位点序列，且该酶切位点序列不存在于Onc序列或细菌毒蛋白膜转位结构域序列上。因而，融合蛋白在细胞外不被酶切而高效地进入到细胞内，当进入到细胞内后，在胞内酶的作用下Onc与细菌毒蛋白膜转位结构域分离。

作为本发明的一种特别优选的方式，所述的连接肽是含有Furin酶切位点的连接肽。细胞外环境通常为中性或微碱性的，而Furin只有在酸性条件下才发挥作用，当融合蛋白进入胞内后，可在酸性小泡中被Furin酶切，从而使得Onc与毒蛋白膜转位结构域更易于被释放到胞质中。更优选的，所述的连接肽具有SEQ ID NO：2中第105-120位所示的氨基酸序列。

作为一种优选的方式，所述的Onc或其活性片段位于融合蛋白的氨基端(N端)；所述的毒蛋白膜转位结构域或其活性片段位于融合蛋白的羧基端(C端)。可选择地，也可互换两种蛋白所处的位置，也即：所述的Onc或其活性片段位于融合蛋白的羧基端；所述的毒蛋白膜转位结构域或其活性片段位于融合蛋白的氨基端。

作为另一种方式，将所述的Onc和细菌毒蛋白膜转位结构域或它们的活性片段直接连接，比如把细菌毒蛋白膜转位结构域与Onc的编码基因直接连接，融合表达，二者之间不加氨基酸连接子。本发明人的结果显示，Onc与细菌毒蛋白膜转位结构域之间加上本发明优选的连接子比不加连接子所获得的蛋白的抗肿瘤活性更佳。

此外，可选择地，所述的融合蛋白的氨基端(或羧基端)还可含有一个或多个多肽片段，作为蛋白标签。任何合适的标签都可以用于本发明。例如，所述的标签可以是FLAG，HA，HA1，c-Myc，6-His或8-His等。这些标签可用于对融合蛋白进行纯化。

实验结果证明，本发明所构建的Onc-DT融合蛋白对肿瘤细胞(包括一些原来对Onc不敏感的细胞)的毒性大为增强。Onc-DT融合蛋白不仅可以代替传统的毒蛋白构建免疫毒素，因为Onc本身有识别肿瘤细胞的能力，其本身也能成为一个独立的抗癌药物。较之单独应用Onc，Onc-DT融合蛋白对肿瘤的杀伤力更强，适用范围更广。

核酸分子

另一方面，本发明还提供了编码所述的融合蛋白的分离的核酸，也可以是其互补链。

任何编码Onc或其活性片段的合适的DNA结构都适用于本发明。任何编码细菌毒蛋白膜转位结构域或其活性片段的合适的DNA结构也适用于本发明。下文实例中提及的序列都适用于本发明的方法。

作为本发明的优选方式，编码融合蛋白的核酸具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

编码本发明融合蛋白的DNA序列，可以全序列人工合成，也可用PCR扩增的方法获得编码Onc和细菌毒蛋白膜转位结构域氨基酸的DNA序列，然后将其拼接起来，形成编码本发明融合蛋白的DNA序列。

表达载体

在获得了编码本发明融合蛋白的DNA序列之后，将其连入合适的表达载体，再转入合适的宿主细胞。最后通过培养转化后的宿主细胞，通过分离纯化得到本发明的融合蛋白。

因此，本发明还提供了包含编码所述融合蛋白的核酸分子的载体。所述的载体还可包含与所述核酸分子的序列操作性相连的表达调控序列，以便于所述融合蛋白的表达。

如本文所用，“操作性相连”或“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其它部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它就是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般“可操作地连于”意味着相邻近，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。

在本发明中，任何合适的载体都可以使用，比如一些用于细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞的克隆和表达的载体，如Pouwels等，克隆载体：实验室手册(Elsevier最新版)中所描述的。可选用本领域已知的各种载体如市售的载体。比如，选用市售的载体，然后将编码本发明新融合蛋白的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成蛋白表达载体。在本发明的一种实施方式中，所述的载体为原核载体，如pET载体。

表达载体包括连接有合适的转录和翻译调控序列的融合蛋白DNA序列，如来源于哺乳动物、微生物、病毒或昆虫的基因。调控序列可包括转录启动子、操纵子、增强子、核糖体结合位点或控制转录和翻译起始和终止的合适序列。在融合蛋白序列需要调节序列功能的时候，则连接合适的调控序列。这样，启动子序列被连接在编码融合蛋白DNA序列前端。在宿主细胞内的复制的能力通常由复制起始点控制。用于转化株识别的筛选基因也可加入表达载体。

另外，非天然的Onc或细菌毒蛋白膜转位结构域的信号肽的编码序列可以引入表达载体。例如：信号肽(分泌引导物)序列可以和与融合蛋白编码序列融合，从而使翻译的融合蛋白可分泌到细胞外。信号肽可增强宿主细胞向胞外分泌嵌合多肽。信号肽在多肽从细胞内分泌出来的过程中可被切去。

宿主细胞

此外，含有编码所述融合蛋白的核酸序列的重组细胞也包括在本发明中。

在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞包括大肠杆菌、枯草杆菌等；例如可为大肠杆菌细胞(E.coli)，如大肠杆菌HMS174(DE3)、或BL21(DE3)。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。

在本发明的优选实施方式中，采用原核细胞作为宿主细胞，经表达、复性、纯化后获得保留了良好的Onc抗肿瘤活性且细胞膜穿透性良好的融合蛋白。

生产融合蛋白的方法

生产融合蛋白的方法也已包括在本发明中。所述方法包括培养含有融合蛋白编码核酸的重组细胞。所述的融合蛋白包括Onc或其有活性的片段以及细菌毒蛋白膜转位结构域或其活性片段。所述方法可包括让细胞表达编码的融合蛋白，以及使表达的融合蛋白的复性。在一个实例中，所述方法还可包括复性的融合蛋白的分离和/或纯化。

可将上述制备获得的融合蛋白纯化为基本均一的性质，例如在SDS-PAGE电泳上呈单一条带。例如，当重组蛋白为分泌表达时，可以采用商品化的超滤膜来分离所述蛋白，例如Millipore、Pellicon等公司产品，首先将表达上清浓缩。浓缩液可采用凝胶层析的方法进一步加以纯化，或采用离子交换层析的方法纯化。例如阴离子交换层析(DEAE等)或阳离子交换层析。凝胶基质可为琼脂糖、葡聚糖、聚酰胺等常用于蛋白纯化的基质。Q-或SP-基团是较为理想的离子交换基团。最后，还可用羟基磷灰石吸附层析，金属螯合层析，疏水相互作用层析和反相高效液相色谱(RP-HPLC)等方法对上述纯化产物进一步精制纯化。上述所有纯化步骤可利用不同的组合，最终使蛋白纯度达到基本均一。

可利用含有Onc或细菌毒蛋白膜转位结构域的特异性抗体、受体或配体的亲和层析柱对表达的融合性多肽进行纯化。根据所使用的亲和柱的特性，可利用常规的方法，如高盐缓冲液、改变pH等方法洗脱结合在亲和柱上的融合性多肽。

重组蛋白以及编码该重组蛋白的核酸可利用适当的方法制备，例如，化学合成、重组表达，或其合并应用。参见John Wiley&Sons，Inc 2000年出版的《Current Protocols in Molecular Biology》，以及Cold Spring Harbor LaboratoryPress1989年出版的《Molecular Coning：A Laboratory Manual》。在一个实例中，编码融合蛋白的核酸序列是利用PCR技术制备的，方法参见Prodromou等(Protein Eng.5(8)：827-29；1992)论著。

融合蛋白的用途

本发明的Onc与细菌毒蛋白膜转位结构域的融合蛋白可用于制备抑制肿瘤的组合物。本发明的融合蛋白不仅具有良好的杀肿瘤生物活性，而且进入肿瘤细胞胞质的能力比单纯的Onc更强，因而具有比Onc更优异的杀肿瘤效果，从而可用于开发一种更有效的抗肿瘤药物。

本发明的融合蛋白比单纯的Onc具有更为广谱的抑制肿瘤细胞的功能。由本发明的具体实例可见，所述的融合蛋白对于骨髓瘤细胞、白血病细胞、神经母细胞瘤、急性髓系白血病细胞均具有优异的抑制效果。

因此，本发明的“肿瘤”可以是多种类型的，例如可包括(但不限于)：恶性间皮细胞瘤；肺癌；白血病；恶性淋巴瘤；骨髓瘤；恶性黑色素瘤；乳腺癌；神经系统肿瘤；肝癌；鼻咽癌；食管癌；胃癌；结肠癌；前列腺癌；宫颈癌；口腔癌；唾液腺肿瘤；鼻腔与鼻旁窦恶性肿瘤；喉癌；耳部肿瘤；眼部肿瘤；甲状腺肿瘤；纵隔肿瘤；胸壁；胸膜肿瘤；小肠肿瘤；胆道肿瘤；胰腺与壶腹周围肿瘤；肠系膜与腹膜后肿瘤；肾脏肿瘤；肾上腺肿瘤；膀胱肿瘤；前列腺癌；睾丸肿瘤；阴茎癌；子宫内膜癌；卵巢恶性肿瘤；恶性滋养细胞肿瘤；外阴癌与阴道癌；软组织肿瘤；骨肿瘤；或皮肤及附件肿瘤。

在用于抑制哺乳动物肿瘤时，所述的融合蛋白可全身性给药，或者局部给药，具体可视肿瘤的种类、生长部位、进展程度等因素决定。

组合物

本发明还提供一种组合物，所述的组合物含有：(i)有效量(如0.0001-1000uM)的本发明所述的Onc与细菌毒蛋白膜转位结构域的融合蛋白；和(ii)药学上可接受的载体。所述的组合物通常是药物组合物，用于抑制肿瘤细胞生长或治疗肿瘤。

如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的载体的充分说明。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和山梨醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质和稳定剂，如白蛋白等。

可将所述的组合物制成各种适合于哺乳动物给药的剂型，所述剂型包括但不限于：注射剂、胶囊剂、片剂、乳剂、栓剂和喷雾剂。

在使用时，是将安全有效量的本发明所述的具有融合蛋白施用于哺乳动物(如人)，其中该安全有效量通常至少约1微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约10毫克/千克体重，较佳地该剂量是约1微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明的组合物可直接用于杀伤肿瘤细胞。此外，还可同时与其它治疗剂或辅剂联合使用。

本发明的主要优点在于：

(1)首次提供且制备出Onc与细菌毒蛋白膜转位结构域的融合蛋白，经证实细菌毒蛋白膜转位结构域与Onc的融合良好地保留了Onc的核酸酶活性，又显著提高了Onc进入细胞胞质的能力和抗肿瘤的广谱性，具有比Onc更优异的杀肿瘤效果，对肿瘤细胞(包括一些原来对Onc不敏感的肿瘤细胞)的毒性大为增强。

(2)本发明的融合蛋白可已知多种肿瘤的生长，对于治疗许多肿瘤均可用，广谱性更佳。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，所列举实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体实验条件的，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册第三版(ColdSpring Harbor Laboratory Press，2001)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1Onc-DT_203-390融合基因的合成以及大肠杆菌表达质粒的构建

为了便于Onc-DT_203-390从胞内体释放到胞质，以一段16个氨基酸的含furin酶切位点的连接肽将Onc和DT连接起来，furin-DT的DNA序列为全基因合成，为了便于PCR将Onc与furin-DT序列连接起来，全基因合成时在furin 5’端添加了25个Onc末端碱基序列。全基因合成序列见SEQ ID NO：3。根据Onc和DT的基因序列设计并合成了下列一对引物：

Onc-DT-U(SEQ ID NO：4)：

5’CCCAGGACTGGCTGACTTTCCA 3’；

Onc-DT-L(SEQ ID NO：5)：

5’GGGTCGACTTATTCCGGACCACCAGAAGC 3’。

其中，Onc-DT-U为Onc成熟蛋白N端的编码序列；Onc-DT-L为DT C端编码序列加终止密码子和SalI酶切位点的反向互补序列。

以Onc-DT-U和Onc-DT-L为引物，含Onc基因片断和furin-DT基因片断的混合物为模板，用高保真DNA聚合酶PCR扩增Onc-DT基因序列，产物经凝胶纯化后用SalI酶切，1％琼脂糖凝胶电泳割胶回收得到Onc-DT的插入片断。将质粒pET22b(+)(Novagen)分别用BalI和SalI酶切，1％琼脂糖凝胶电泳割胶回收得到pET22b的载体片断，将插入片断和载体片断用T4DNA连接酶连接得到pET22b-Onc-DT_203-390质粒，该重组质粒的示意图见图1。

实施例2Onc-DT_203-390融合蛋白的表达

将构建的表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，隔夜挑单克隆于50ml LB培养基中，于37℃培养过夜。次日按1∶20转接1L TB培养基，于37℃培养至A₆₀₀＝2.0，加IPTG浓度至0.5mM诱导3.5小时，4℃、6000rpm×10min离心收集菌体，菌体用于下一步的包涵体收集和纯化。

实施例3包涵体收集和洗涤

将收集到的菌体悬浮在缓冲液SSB_A(20mM Tris-HCl，10mM EDTA，pH 8.0)中，用超声波破碎仪破碎菌体；4℃，12000rpm×10min离心，收集包涵体；WIBB(20mM Tris-HCl，1M盐酸胍，65mM DTT，2mM EDTA，pH 8.0)悬浮包涵体，搅拌过夜，4℃，12000rpm×10min收集包涵体。

实施例4蛋白变复性

将1L菌液得到的包涵体溶解于6ml DIBB(20mM Tris-HCl，7M盐酸胍，65mM DTT，2mM EDTA，pH 8.0)中，充氮气后，搅拌过夜；4℃，12000rpm×15min，离心收集上清，将蛋白定量至浓度为10mg/ml；将1ml包涵体溶液缓慢稀释到200ml RB(0.5M Arginine-HCl，20mM Tris-HCl，0.9mM氧化型谷胱甘肽，1mM EDTA，pH 9.0)，4℃，12000rpm×30min离心弃沉淀；在复性缓冲液RB中4℃复性36～48小时后，用透析液(0.5M尿素，20mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 9.0)透析去盐。蛋白溶液存于4℃备用。

实施例5蛋白纯化

将复性好的蛋白溶液定量后上强阴离子交换柱。

(1)层析柱为Q-Sepharose(2×2cm，pharmacia)，用20mM Tris-HCl，1mMEDTA，pH 9.0平衡，流速1ml/min。用1M NaCl洗脱30个柱体积并弃用，将上样流出液pH调至10.0备用。

(2)层析柱为Q-Sepharose(2×2cm，pharmacia)，用20mM Tris-HCl，1mMEDTA，pH 10.0平衡，然后用0.4M Nacl，流速1ml/min洗脱20个柱体积，1M NaCl洗脱20个柱体积并分步收集，考马斯亮兰G250检测含有目的蛋白的样品。收集含有蛋白的样品并用透析液20mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 10.0去盐后，备用。

(3)将去盐后的样品溶液定量过强阴离子交换柱。层析柱为预装柱MonoQ(HR5/5，1ml，pharmacia)，流动相为LB2(20mM Tris-HCl，l mM EDTA，pH10.0)和WB2(1M NaCl，20mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 10.0)，流速1ml/min。

洗脱方法：0-100％WB洗脱30个柱体积并分步收集，收集处相当于30％左右处的蛋白峰。

本发明Onc-DT_203-390蛋白的表达纯化效果蛋白凝胶图谱见图2。

实施例6Onc-DT_203-390蛋白的细胞毒性测定

1.Onc-DT_203-390对骨髓瘤细胞SP2/0的细胞毒性测定

骨髓瘤SP2/0细胞(购自中科院上海生命科学研究院细胞库)培养于含10％小牛血清，青霉素(100单位/ml)，链霉素(100μg/ml)的RPMI 1640(GIBICO)培养基中。96孔板培养，每孔加90μl培养液(5×10⁴细胞/ml)，CO₂(5％)培养箱中培养1小时后，按设定的浓度梯度加蛋白样品(分别是Onc(制备方法参见：onconase对B16黑色素瘤细胞的体内外生长抑制作用；沈如凌，孙瑞林，王庆诚，欧伶，费俭；细胞生物学杂志，2007年29卷6期：901-904)和前述制备的Onc-DT_203-390(溶于PBS中)10μl，对照组加PBS，培养72小时后，MTT法检测细胞存活率。

Onc-DT_203-390和Onc对骨髓瘤细胞SP2/0的细胞毒性作用比较结果如图3A所示。可见Onc-DT_203-390的IC₅₀约为2×10^-8mol/L；Onc的IC₅₀大于8×10^-6mol/L，说明Onc-DT_203-390对肿瘤细胞的毒性显然比Onc增强约400倍。

2.Onc-DT_203-390对人白血病细胞K562的细胞毒性测定

人白血病细胞K562(购自中科院上海生命科学研究院细胞库)培养于含10％小牛血清，青霉素(100单位/ml)，链霉素(100μg/ml)的DMEM(GIBICO)培养基中。96孔板培养，每孔加90μl培养液(5×10⁴细胞/ml)，CO₂(5％)培养箱中培养12小时后，按设定的浓度梯度加蛋白样品(分别是Onc蛋白和Onc-DT_203-390蛋白)10μl，对照组加PBS，培养72小时后，MTT法检测细胞存活率。

Onc-DT_203-390和Onc对人白血病细胞K562的细胞毒性作用比较如图3B所示。可见Onc-DT_203-390的IC₅₀约为2.5×10^-8mol/L；Onc的IC₅₀约为1×10^-6mol/L；说明Onc-DT_203-390对肿瘤细胞的毒性比Onc增强约40倍。

3.Onc-DT_203-390对人神经母细胞瘤SH-SY5Y的细胞毒性测定

神经母细胞瘤SH-SY5Y(购自中科院上海生命科学研究院细胞库)培养于含10％胎牛血清，青霉素(100单位/ml)，链霉素(100μg/ml)的DMEM(GIBICO)培养基中。96孔板培养，每孔加90μl培养液(5×10⁴细胞/ml)，CO₂(5％)培养箱中培养12小时后，按设定的浓度梯度加蛋白样品(分别是Onc和Onc-DT_203-390)10μl，对照组加PBS，培养72小时后，MTT法检测细胞存活率。

Onc-DT_203-390和Onc对人神经母细胞瘤SH-SY5Y的细胞毒性作用比较如图3C所示。Onc-DT_203-390的IC₅₀约为3×10^-7mol/L；Onc的IC₅₀大于8×10^-6mol/L；说明Onc-DT_203-390对肿瘤细胞的毒性比Onc增强约27倍。

4.Onc-DT_203-390对人急性髓系白血病细胞株HL60的细胞毒性测定

人急性髓系白血病细胞株HL60(获自中科院上海生命科学研究院生物化学与细胞所)培养于含10％小牛血清，青霉素(100单位/ml)，链霉素(100μg/ml)的RPMI 1640(GIBICO)培养基中。96孔板培养，每孔加90μl培养液(5×10⁴细胞/ml)，CO₂(5％)培养箱中培养12小时后，按设定的浓度梯度加蛋白样品(分别是ONC和Onc-DT_203-390)10μl，对照组加PBS，培养72小时后，MTT法检测细胞存活率。

Onc-DT_203-390和Onc对人急性髓系白血病细胞株HL60的细胞毒性作用比较如图3D所示。可见Onc-DT_203-390的IC₅₀约为3×10^-7mol/L；Onc的IC₅₀大于1×10^-5mol/L；Onc-DT_203-390对肿瘤细胞的毒性比Onc增强约33倍。

实施例7Onc-DT跨膜结构域融合蛋白变体

为了便于纯化，本发明人还制备了N端含有6His-tag的融合蛋白。重组载体的转化、表达同实施例2-4。

采用实施例6的方法对纯化后获得的融合蛋白进行细胞毒性测定，结果发现带有His-tag的融合蛋白对肿瘤细胞的毒性接近于前述Onc-DT_203-390。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>上海南方模式生物科技发展有限公司，

     上海南方模式生物研究中心

<120>核糖核酸酶与白喉毒蛋白膜转位结构域融合蛋白及其制备方法和用途

<130>080999

<160>5

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>924

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>融合基因

<400>1

caggactggc tgactttcca gaaaaaacat atcactaaca ctcgtgacgt tgactgcgac    60

aacatcatgt ctactaacct gttccattgc aaagacaaaa acactttcat ctactctcgt   120

ccggaaccgg ttaaagctat ctgcaaaggt atcatcgctt ctaaaaacgt tctgactact   180

tctgaattct acctgtctga ctgcaacgtt acttctcgtc cgtgcaaata caaactgaaa   240

aaatctacta acaaattctg cgttacttgc gaaaaccagg ctccggttca tttcgttggt   300

gttggttctt gctgcgctgg taaccgtgtt cgtcgttctg ttggttcttc tctgtcttgc   360

atcaacctgg attgggatgt tatccgtgat aaaactaaga ccaagatcga gtctctgaaa   420

gagcacggcc cgatcaaaaa caaaatgagc gaaagcccga acaaaactgt atctgaggaa   480

aaagctaaac agtacctgga agaatttcac cagactgcac tggagcaccc ggaactgtct   540

gaactgaaaa ccgttactgg taccaacccg gtattcgctg gtgctaacta cgcggcgtgg   600

gcagtaaacg ttgctcaggt tatcgatagc gaaactgctg ataacctgga aaagactact   660

gctgctctgt ctatcctgcc gggtatcggt agcgtaatgg gcattgcaga cggtgccgtt   720

caccataaca ctgaagagat cgtggcacag tctatcgctc tgtcctctct gatggttgct   780

caggctattc cgctggtagg tgagctggtt gatattggtt tcgctgcata caactttgta   840

gagagcatta tcaacctgtt tcaggtagtt cacaactctt acaaccgtcc ggcgtactct   900

ccgggtcaca aaactcagcc gttt                                          924

<210>2

<211>308

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>MISC_FEATURE

<223>融合蛋白

<400>2

Gln Asp Trp Leu Thr Phe Gln Lys Lys His Ile Thr Asn Thr Arg Asp

1               5                   10                  15

Val Asp Cys Asp Asn Ile Met Ser Thr Asn Leu Phe His Cys Lys Asp

            20                  25                  30

Lys Asn Thr Phe Ile Tyr Ser Arg Pro Glu Pro Val Lys Ala Ile Cys

        35                  40                  45

Lys Gly Ile Ile Ala Ser Lys Asn Val Leu Thr Thr Ser Glu Phe Tyr

    50                  55                  60

Leu Ser Asp Cys Asn Val Thr Ser Arg Pro Cys Lys Tyr Lys Leu Lys

65                  70                  75                  80

Lys Ser Thr Asn Lys Phe Cys Val Thr Cys Glu Asn Gln Ala Pro Val

                85                  90                  95

His Phe Val Gly Val Gly Ser Cys Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg Arg

            100                 105                 110

Ser Val Gly Ser Ser Leu Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp Val Ile

        115                 120                 125

Arg Asp Lys Thr Lys Thr Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His Gly Pro

    130                 135                 140

Ile Lys Asn Lys Met Ser Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser Glu Glu

145                 150                 155                 160

Lys Ala Lys Gln Tyr Leu Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu Glu His

                165                 170                 175

Pro Glu Leu Ser Glu Leu Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro Val Phe

            180                 185                 190

Ala Gly Ala Asn Tyr Ala Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln Val Ile

        195                 200                 205

Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala Leu Ser

    210                 215                 220

Ile Leu Pro Gly Ile Gly Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly Ala Val

225                 230                 235                 240

His His Asn Thr Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser Ser

                245                 250                 255

Leu Met Val Ala Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp Ile

            260                 265                 270

Gly Phe Ala Ala Tyr Asn Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu Phe Gln

        275                 280                 285

Val Val His Asn Ser Tyr Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly His Lys

    290                 295                 300

Thr Gln Pro Phe

305

<210>3

<211>589

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>融合基因

<400>3

ttctgttggt tcttctctgt cttgcatcaa cctggattgg gatgttatcc gtgataaaac   60

taagaccaag atcgagtctc tgaaagagca cggcccgatc aaaaacaaaa tgagcgaaag  120

cccgaacaaa actgtatctg aggaaaaagc taaacagtac ctggaagaat ttcaccagac  180

tgcactggag cacccggaac tgtctgaact gaaaaccgtt actggtacca acccggtatt  240

cgctggtgct aactacgcgg cgtgggcagt aaacgttgct caggttatcg atagcgaaac  300

tgctgataac ctggaaaaga ctactgctgc tctgtctatc ctgccgggta tcggtagcgt  360

aatgggcatt gcagacggtg ccgttcacca taacactgaa gagatcgtgg cacagtctat  420

cgctctgtcc tctctgatgg ttgctcaggc tattccgctg gtaggtgagc tggttgatat  480

tggtttcgct gcatacaact ttgtagagag cattatcaac ctgtttcagg tagttcacaa  540

ctcttacaac cgtccggcgt actctccggg tcacaaaact cagccgttt              589

<210>4

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>4

cccaggactg gctgactttc ca                                            22

<210>5

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>5

gggtcgactt at tccggacc accagaagc                                    29