一种超声波提取抗辐射氧化蕨麻多糖的方法

摘要

本发明提供了一种超声波提取抗辐射氧化蕨麻多糖的方法，它以蕨麻为原料，经超声波提取30～120分钟，在0.06～0.08MPa压力条件下过滤，滤液在压力0.06～0.08MPa、温度55℃～65℃下减压浓缩，乙醇沉淀、离心，收集下层沉淀物，冷冻干燥，再经木瓜蛋白酶酶解，正丁醇和氯仿混合液萃取，减压浓缩，透析后，得到天然蕨麻多糖，其无毒副作用，对X射线辐射引起的自由基所造成的体内氧化损伤有较好的修复作用。经3.5Gy X射线照射小鼠的抗氧化能力实验表明：7天服用该制剂使辐射损伤动物的SOD活性升高66.7％；T－AOC活力上升54.6％，CAT活力上升105.7％，MDA含量下降63.2％。

说明书

技术领域

本发明涉及天然多糖的制备方法，具体地说是一种超声波提取具有抗辐射氧化作用的蕨麻多糖的方法。

背景技术

电离辐射对生物体的损伤既有能量传递的直接作用，也有通过水的辐射反应，大量产生自由基的间接作用。DNA分子中碱基、核糖和磷酸键都可能遭受自由基的攻击，造成碱基与核糖氧化、链断裂、与蛋白质交联等多种类型的损伤。自由基引发的脂类过氧化作用可造成生物膜中饱和与不饱和脂肪酸的比例失调，改变膜结构的刚柔特性，增加膜的通透性，甚至发生崩解。MDA是脂质过氧化的分解产物，其含量可反映脂质过氧化的程度以及机体受自由基攻击的程度。SOD和CAT是催化O₂^-和分解H₂O₂的抗氧化酶，它们都反映机体的抗氧化能力。自由基作用于脂质过氧化反应，氧化终产物丙二醛等会引起蛋白质、核酸等生命大分子的交联聚合，该现象是衰老的一个基本因素。

为了减缓氧化、衰老的过程，修复治疗受伤的机体，人们通常食用一些含有天然存在的抗氧化剂的食物，如含维生素A、维生素C、维生素E、硒、锌的水果、绿叶蔬菜、浆果等。与此同时，人们也在有目的地寻找毒性低且活性高的抗氧化物质。专利CN 1143084A公开了一种抗氧化剂接枝的多糖或抗氧化剂交联的多糖在治疗关节炎、作为药物介质方面的作用，降低术后粘连的发生率、促进慢性创伤和溃疡的愈合。专利CN 101353382A公开了一种具有抗氧化活性虫草多糖的提取方法，报道了一种用虫草废液提取抗氧化活性多糖的方法，精多糖的提取率约为7.8％。专利CN 1144835A公开了一种从迷迭植物中提取抗氧化剂的方法，该方法是在提取抗氧化剂之前，先用水蒸汽或超临界提取迷迭植物中的精油，再提取其中的抗氧化剂。专利CN 101233950A公开了一种从低值海水鱼及下脚料蛋白中提取抗氧化剂的技术，得到的抗氧化剂其抗氧化活性达到维生素E的57.1～94.4％；专利CN 101099768A公开了一种从香椿老叶中提取抗氧化活性物质的方法。

蕨麻(蔷薇科委陵菜属鹅绒委陵菜的块根)具有治疗脾虚腹泻、病后贫血、营养不良、健脾益胃、生津止渴、益气补血等效果。专利CN 02138522.X公开了一种含有蕨麻提取物的保健食品及其制备，采用水和/或乙醇提取蕨麻，制得蕨麻提取物，加入或不加食品添加剂制成保健食品，具有调解人体免疫功能、抗疲劳的功效。专利CN 101001842A公开了蕨麻在制备抗缺氧药物中的应用，可显著提高窒息性缺氧和急性减压缺氧小鼠的存活率和存活时间。专利ZL200610090097.5公开了一种抗辐射蕨麻多糖的制备方法，得到了能增强动物抗辐射能力的多糖，纯化后多糖得率为6.32％；专利CN 101358222A公开了一种以蕨麻为原料微波辅助提取抗辐射多糖的方法，纯化后多糖的得率为12.18％，用于治疗X射线引起的辐射损伤。

超声波的优点是并不能使样品内的分子产生极化，而是在溶剂和样品之间产生声波空化作用，导致溶液内气泡的形成、增长和爆破压缩，从而使固体样品分散，增大样品与萃取溶剂之间的接触面积，提高目标物从固相转移到液相的传质速率。专利ZL200610166326.7授权了一种米糠多糖的超声波提取方法，超声波功率200～400W，并未考虑到提取条件对样品纯度的影响，纯化后多糖的得率较低，仅为2.87％，很难应用于实际生产。

上述技术中，常规提取多糖方法存在耗时长、溶剂消耗量大、提取效率低及运行成本高等问题；而微波提取会对多糖分子结构产生影响，可能导致大分子链的降解。抗辐射氧化作用不同于单纯的抗辐射作用，需以机体各器官的抗氧化物酶、抗氧化系统综合评价。而多糖结构的变化会对其生物活性产生巨大的影响，因此，在提取过程中如何能避免上述技术问题、克服现有技术缺陷，得到目标生物活性物质是亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种超声波提取抗辐射氧化蕨麻多糖的方法，它首次使用超声波法提取蕨麻多糖，提取效率高、运行成本低，且能最大限度地减小对多糖分子结构及其生物活性产生影响。

本发明的另一目的在于提供一种蕨麻多糖在制备具有修复X-射线引发的自由基氧化损伤功能的天然制品或保健食品中的应用。

本发明提供的超声波提取抗辐射氧化蕨麻多糖的方法，可以通过以下技术方案来实现，其步骤为：

1)称取一定量蕨麻干粉，置于超声波提取设备中，加入20～50倍(m/v)蒸馏水，搅拌、混匀；在超声波功率为100～180W、温度为40℃～70℃下提取30～120分钟，在0.06～0.08MPa压力条件下过滤，滤液在压力为0.06～0.08MPa、温度为55℃～65℃的条件下减压浓缩至原体积的1/9～1/3，在浓缩液中加入乙醇，所述的乙醇含量占加入乙醇后溶液总体积的70～80％，室温下静置24～36小时后在4000～5000转/分钟的转速下离心，收集下层沉淀物，并在-60～-50℃、1～13Pa的条件下冷冻干燥24～30小时，得物质A；

2)称取一定量物质A，用6～9倍重量的蒸馏水溶解，后加入10μg/ml木瓜蛋白酶液，酶液与A液的体积比为1∶100，在温度40～50℃下酶解10～12小时，再用正丁醇和氯仿体积比为1∶2～4的混合液，萃取3～5次，收集上层水溶液，在温度40～50℃、压力0.06～0.08MPa条件下，减压浓缩至原水溶液体积的1/10～1/12，放入截留分子量6000～8000Da的透析袋中，流水透析20～24小时，再用蒸馏水透析18～36小时，将透析袋内液体在温度40～50℃、压力0.06～0.08MPa条件下减压浓缩至原水溶液体积的1/10～1/12，加入乙醇，所述的乙醇含量占加入乙醇后溶液总体积的70～80％，静置10～14小时，在4000～5000转/分钟的转速下离心，收集沉淀物在温度-60～-50℃、压力1～13Pa条件下冷冻干燥30～36小时，得纯化的蕨麻多糖。

纯化后的蕨麻多糖经红外扫描，红外光谱显示如图5：在2829.67cm^-1处有一特征峰，是分子中C-H键的变角振动引起的；在3423.56cm^-1处有一特征峰，是O-H的伸缩振动引起的；802.3cm^-1附近吸收峰表明了α-D-吡喃半乳糖的存在；862.67cm^-1处的吸收峰说明含有β-D-吡喃甘露糖，这些均为多糖的吸收峰。

本发明提供的上述超声波提取抗辐射氧化蕨麻多糖的方法，与热水浸提和微波萃取工艺相比，超声波提取具有如下突出特点：无需高温，萃取效率高，纯度高，对活性物质破坏小，具有广谱性，能耗较小，工艺成本低，综合经济效益显著(见下表)。本发明是以蕨麻为原料，经过超声波提取、纯化制备的一种可以修复由辐射引起的氧化损伤的天然产品，此天然产品无毒副作用，且抗辐射氧化效果好。对X射线辐射引起的自由基所造成的体内氧化损伤有较好的疗效。经3.5Gy X射线照射小鼠的抗氧化能力实验表明：7天服用该制剂使辐射损伤动物的SOD活性升高66.7％；T-AOC活力54.6％，CAT活力上升105.7％，MDA含量下降63.2％。

超声波取法与传统提取法、微波法比较

  实验  温度(℃) 时间(min)  料液比  提取率(％)  总糖含量(％)  实施例1  50  60  1∶20  9.8625  93.5  实施例2  70  30  1∶35  10.5965  90.3  实施例3  40  120  1∶50  11.787  92.2  传统提取  70  180  1∶45  5.73  85.6  微波提取  55  45  1∶40  12.18  80.6

本发明蕨麻多糖抗辐射氧化效果动物试验

实验用小鼠60只，随机分成5组，每组12只，分别如下：正常对照组、辐射对照组、多糖高/中/低三个剂量组(240mg/(kgb.w.)；120mg/(kgb.w.)；60mg/(kgb.w.))，正常对照组灌胃生理盐水。辐射前给药15天，辐射后12h内给药，以后每天给药一次，7天后测小鼠的体内抗氧化指标。照射条件为：X射线，小鼠单次全身照射剂量3.5Gy，剂量率1Gy/min，源皮距1m。除正常对照组不进行照射外，其他组均进行照射。

由实验结果图1可知，辐射对照组与正常对照组相比，肝脏CAT活力明显降低正常对照组的CAT的活性明显高于辐射对照组(p＜0.01)。照射后7d，各喂药组间CAT活性与辐射对照组相比均有所增高；其中低剂量组CAT活性恢复达到显著水平(p＜0.05)。

由实验结果图2可知，X射线照射过的小鼠的MDA含量明显高于正常对照组。照射后7d，各喂药组间MDA含量与辐射对照组相比均有所下降，其中低剂量组的MDA含量下降的最为明显。

由实验结果图3可知，正常对照组的SOD的活性明显高于辐射对照组。照射后7d，各喂药组间SOD活性与辐射对照组相比均有所增高。

由实验结果图4可知，辐射对照组与正常对照组相比，肝脏T-AOC活力明显降低，达到极显著水平(p＜0.01)。照射后7d，各喂药组间T-AOC活性与模型对照组相比均有所增高。

通过上述动物实验结果表明：本发明制备的蕨麻多糖可以应用于制备具有修复X-射线引发的自由基氧化损伤功能的天然制品或保健食品中。

附图说明

图1是蕨麻多糖制剂对辐射小鼠肝脏CAT活力的影响

图2是蕨麻多糖制剂对辐射小鼠肝脏MDA含量的影响

图3是蕨麻多糖制剂对辐射小鼠肝脏SOD活力的影响

图4是蕨麻多糖制剂对辐射小鼠肝脏T-AOC活力的影响

图5是对蕨麻多糖制剂的红外扫描图

具体实施方式

下面结合实施例及比较例对本发明作进一步说明：

实施例1：

1)称取一定量蕨麻干粉，置于超声波提取设备中，加入20倍(m/v)蒸馏水，搅拌、混匀；在超声波功率为100W、温度为50℃条件下提取60分钟，在压力0.07MPa的条件下过滤，滤液在压力0.08MPa、温度为60℃条件下减压浓缩至原体积的1/3，在浓缩液中加入乙醇(乙醇含量占加入乙醇后溶液总体积的75％)，室温下静置30小时后，在4000转/分钟的转速下离心，收集下层沉淀物在-55℃，在压力1Pa的条件下冷冻干燥28小时，得物质A；

2)称取一定量物质A，用6倍重量的蒸馏水溶解，后加入10μg/ml木瓜蛋白酶液，酶液与A液的比例为1∶100(v/v)，在45℃下酶解11小时，再用正丁醇和氯仿混合液(1∶3，v/v)萃取4次，收集上层水溶液，在温度45℃、压力0.07MPa条件下减压浓缩至原水溶液体积的1/11，放入截留分子量6000～8000Da的透析袋中，流水透析22小时，再用蒸馏水透析24小时。将透析袋内液体在温度45℃、压力0.07MPa条件下减压浓缩至原水溶液体积的1/11，加入乙醇(乙醇含量占加入乙醇后溶液总体积的75％)，静置12小时，在4500转/分钟的转速下离心，收集沉淀物在温度-55℃、压力1Pa条件下冷冻干燥33小时，得纯化的蕨麻多糖。

纯化多糖的得率为9.8625％，经苯酚-硫酸法检测其总糖含量为93.5％。

实施例2：

1)称取一定量蕨麻干粉，置于超声波提取设备中，加入35倍(m/v)蒸馏水，搅拌、混匀；在超声波功率为180W、温度为70℃条件下提取30分钟，在压力0.06MPa的条件下过滤，滤液在压力0.07MPa、温度为55℃条件下减压浓缩至原体积的1/9，在浓缩液中加入乙醇(乙醇含量占加入乙醇后溶液总体积的80％)，室温下静置36小时后，在5000转/分钟的转速下离心，收集下层沉淀物在-60℃，13Pa的条件下冷冻干燥30小时，得物质A；

2)称取一定量物质A，用9倍重量的蒸馏水溶解，后加入10μg/ml木瓜蛋白酶液，酶液与A液的比例为1∶100(v/v)，在40℃下酶解12小时，再用正丁醇和氯仿混合液(1∶2，v/v)萃取5次，收集上层水溶液，在温度40℃、压力0.08MPa下减压浓缩至原水溶液体积的1/12，放入截留分子量6000～8000Da的透析袋中，流水透析24小时，再用蒸馏水透析18小时。将透析袋内液体在温度50℃、压力0.06MPa条件下减压浓缩至原水溶液体积的1/12，加入乙醇(乙醇含量占加入乙醇后溶液总体积的80％)，静置10小时，在4000转/分钟的转速下离心，收集沉淀物在温度-50℃、压力13Pa条件下冷冻干燥30小时，得纯化的蕨麻多糖。

纯化多糖的得率为10.5965％，经苯酚-硫酸法检测其总糖含量为90.3％。

实施例3：

1)称取一定量蕨麻干粉，置于超声波提取设备中，加入50倍(m/v)蒸馏水，搅拌、混匀；在超声波功率为150W、温度为40℃条件下提取120分钟，在压力0.08MPa的条件下过滤，滤液在压力0.06MPa、温度为65℃条件下减压浓缩至原体积的1/6，在浓缩液中加入乙醇(乙醇含量占加入乙醇后溶液总体积的70％)，室温下静置24小时后在4000转/分钟的转速下离心，收集下层沉淀物在50℃，在压力8Pa的条件下冷冻干燥24小时，得物质A；

2)称取一定量物质A，用8倍重量的蒸馏水溶解，后加入10μg/ml木瓜蛋白酶液，酶液与A液的比例为1∶100(v/v)，在50℃下酶解10小时，再用正丁醇和氯仿混合液(1∶4，v/v)萃取3次，收集上层水溶液，在温度50℃、压力0.06MPa条件下减压浓缩至原水溶液体积的1/10，放入截留分子量6000～8000Da的透析袋中，流水透析20小时，再用蒸馏水透析36小时。将透析袋内液体在温度40℃、压力0.08MPa条件下减压浓缩至原水溶液体积的1/10，加入乙醇(乙醇含量占加入乙醇后溶液总体积的80％)，静置14小时，在5000转/分钟的转速下离心，收集沉淀物在温度-60℃、压力10Pa条件下冷冻干燥36小时，得纯化的蕨麻多糖。

纯化多糖的得率为11.787％，经苯酚-硫酸法检测其总糖含量为92.2％。

比较例1：

以实施例1的方法和热水浸提来进行实验。两实验的差别在于热水浸提采用70℃加热提取180min、蕨麻干粉中加入45倍蒸馏水来代替实施例步骤1中的超声波提取。

1)称取一定量蕨麻干粉，置于2000ml烧杯中，加入45倍(m/v)蒸馏水，搅拌、混匀；在温度为70℃下提取180分钟，在压力0.07MPa的条件下过滤，滤液在压力0.08MPa、温度60℃条件下减压浓缩至原体积的1/3，在浓缩液中加入乙醇(乙醇含量占加入乙醇后溶液总体积的75％)，室温下静置30小时后在4000转/分钟的转速下离心，收集下层沉淀物在温度-55℃、压力1Pa的条件下冷冻干燥28小时，得物质A；

2)称取一定量物质A，用6倍重量的蒸馏水溶解，后加入10μg/ml木瓜蛋白酶液，酶液与A液的比例为1∶100(v/v)，在45℃下酶解11小时，再用正丁醇和氯仿混合液(1∶3，v/v)萃取4次，收集上层水溶液，在温度45℃、压力0.07MPa条件下减压浓缩至原水溶液体积的1/11，放入截留分子量6000～8000Da的透析袋中，流水透析22小时，再用蒸馏水透析24小时。将透析袋内液体在温度45℃、压力0.07MPa条件下减压浓缩至原水溶液体积的1/11，加入乙醇(乙醇含量占加入乙醇后溶液总体积的75％)，静置12小时，在4500转/分钟的转速下离心，收集沉淀物在温度-55℃、压力1Pa的条件下冷冻干燥33小时，得纯化的蕨麻多糖。

纯化多糖的得率为5.73％，经苯酚-硫酸法检测其总糖含量为85.6％。

比较例2：

以实施例2的方法和微波辅助提取来进行实验。两实验的差别在于微波辅助提取采用频率915MHz，功率300W，温度55℃加热提取45min以及蕨麻干粉中加入40倍蒸馏水来代替实施例步骤1中的超声波提取。

1)称取一定量蕨麻干粉，置于微波提取设备中，加入40倍(m/v)蒸馏水，搅拌、混匀；在频率915MHz、功率300W、温度为55℃条件下提取45分钟，在压力0.06MPa的条件下过滤，滤液在压力0.07MPa、温度为55℃条件下减压浓缩至原体积的1/9，在浓缩液中加入乙醇(乙醇含量占加入乙醇后溶液总体积的80％)，室温下静置36小时后在5000转/分钟的转速下离心，收集下层沉淀物在温度-60℃、压力13Pa的条件下冷冻干燥30小时，得物质A；

2)称取一定量物质A，用9倍重量的蒸馏水溶解，后加入10μg/ml木瓜蛋白酶液，酶液与A液的比例为1∶100(v/v)，在40℃下酶解12小时，再用正丁醇和氯仿混合液(1∶2，v/v)萃取5次，收集上层水溶液，在温度40℃、压力0.08MPa条件下减压浓缩至原水溶液体积的1/12，放入截留分子量6000～8000Da的透析袋中，流水透析24小时，再用蒸馏水透析18小时。将透析袋内液体在温度50℃、压力0.06MPa条件下减压浓缩至原水溶液体积的1/12，加入乙醇(乙醇含量占加入乙醇后溶液总体积的80％)，静置10小时，在4000转/分钟的转速下离心，收集沉淀物在温度-50℃、压力13Pa的条件下冷冻干燥30小时，得纯化的蕨麻多糖。

纯化多糖的得率为12.18％，经苯酚-硫酸法检测其总糖含量为80.6％。