基于肿瘤内皮标记物－8基因的双靶标肿瘤疫苗及其制备方法

摘要

本发明公开了基于肿瘤内皮标记物－8基因的双靶标肿瘤疫苗及其制备方法，该肿瘤疫苗由肿瘤内皮标记物－8基因重组真核表达载体和穿膜肽HIV－Tat49－57与RGD肽的融合肽以非共价键结合而成；其制备方法是分别制得肿瘤内皮标记物－8基因重组真核表达载体和穿膜肽HIV－Tat49－57与RGD肽的融合肽，再将二者通过静电相互作用聚合形成复合物；本发明肿瘤疫苗既保留了多肽疫苗安全、易于制备纯化等优点，又克服了多肽分子小、免疫原性弱以及不易被抗原递呈细胞摄取等不足，可以发挥同时抑制肿瘤血管生成和诱导肿瘤细胞凋亡的作用，大大提高肿瘤治疗的有效性和安全性，在肿瘤治疗领域具有良好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及一种肿瘤疫苗，特别涉及基于肿瘤内皮标记物-8(TEM-8)基因的双靶标肿瘤疫苗，还涉及该肿瘤疫苗的制备方法。

背景技术

肿瘤是严重威胁人类健康的高发病率和高死亡率疾病。继手术、放射治疗和化学治疗后，生物治疗已经成为肿瘤综合治疗的重要手段。当前，肿瘤生物治疗策略有肿瘤相关基因或肿瘤抑制基因的靶向治疗、肿瘤相关抗原的免疫治疗等。

研究发现，90％以上的人类肿瘤为实体瘤，实体瘤的生长和转移需要新生血管形成，抑制新生血管形成能够在一定程度上有效抑制肿瘤的生长和转移，因此，抑制肿瘤血管生成成为肿瘤治疗中一个重要的补充策略。过去十年中，国内外研究者致力于各种肿瘤血管生成抑制剂的研究，但迄今为止尚未取得令人满意的效果。近年来研究发现，单纯抑制肿瘤血管生成在肿瘤治疗中仍存在一定局限性，若同时联用针对肿瘤细胞的治疗手段，将会产生更加理想的抗瘤效果。因此，以肿瘤新生血管内皮细胞和肿瘤细胞为双靶标的治疗策略成为肿瘤治疗的新方向。

TEM-8在肿瘤血管内皮上大量表达，在成熟组织血管和组织愈合的新生血管上几乎没有表达。研究发现，TEM-8与胶原蛋白α3的C5结构域结合，可以促进血管内皮细胞的粘附和增殖，提示其在肿瘤血管生成中发挥重要作用，可能成为抑制肿瘤血管生成的理想靶点。由于TEM-8是一种自身抗原，机体免疫系统对其往往处于耐受状态，通过主动免疫方式可能打破这种免疫耐受，因此，选择理想的疫苗形式和/或联合应用有效的免疫佐剂是关键。

来源于人类免疫缺陷病毒(HIV)I型的穿膜肽HIV-Tat49-57为带正电荷的短肽，可通过静电作用与带负电荷的质粒DNA聚合形成致密颗粒，显著增强质粒DNA在体内外的转染效率。而且，穿膜肽HIV-Tat49-57为天然活性肽，可携带多肽、蛋白、寡核苷酸甚至脂质体等大颗粒物质以非内吞的方式进入胞浆，并促进其进入主要组织相容性复合体(MHC)I类抗原呈递途径，从而激活细胞免疫应答。

RGD肽是一类含有RGD序列的小肽，广泛存在于多种生物体内及同一种生物体的各种组织中。作为一种重要的细胞识别位点与信号启动分子，RGD肽在许多生命活动中发挥着重要的调节作用，目前研究主要集中在RGD肽竞争结合到细胞表面的整合素受体上从而产生抗血小板凝聚、抗肿瘤迁移以及抗肿瘤血管生成作用等方面。研究证实，整合素家族中α_vβ₃与细胞粘附和新生血管形成的关系最为密切，其配体RGD肽对肿瘤新生血管内皮细胞的粘附和迁移有明显抑制作用，且可诱导肿瘤细胞中半胱天冬蛋白酶(caspase)3/7表达增高，从而促进肿瘤细胞的凋亡。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种基于TEM-8基因的双靶标肿瘤疫苗，既保留了多肽疫苗安全、易于制备纯化的优点，又克服了多肽分子小、免疫原性弱、在体内不易被抗原递呈细胞(APC)摄取等不足，可在体内激发有效的特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答，同时发挥抑制肿瘤血管生成和诱导肿瘤细胞凋亡的作用；本发明的目的之二在于提供一种制备所述基于TEM-8基因的双靶标肿瘤疫苗的方法。

为达到上述目的，在本发明的第一方面，提供了一种基于TEM-8基因的双靶标肿瘤疫苗，由TEM-8基因重组真核表达载体和穿膜肽HIV-Tat49-57与RGD肽的融合肽以非共价键结合而成。

进一步，所述TEM-8基因重组真核表达载体由TEM-8基因和真核表达载体组成，所述TEM-8基因具有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；

进一步，所述真核表达载体为pcDNA3.1；

进一步，所述穿膜肽HIV-Tat49-57与RGD肽的融合肽具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。

在本发明的第二方面，提供了一种制备所述基于TEM-8基因的双靶标肿瘤疫苗的方法，包括以下步骤：于室温、涡旋条件下，向含有肿瘤内皮标记物-8基因重组真核表达载体的等渗电解质溶液中，滴加穿膜肽HIV-Tat49-57与RGD肽的融合肽溶液，滴加完毕后，室温下继续涡旋5～60分钟，再静置5～60分钟，即得肿瘤疫苗。

进一步，所述肿瘤内皮标记物-8基因重组真核表达载体由以下方法制得：先克隆获得核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的肿瘤内皮标记物-8全长编码基因，再将其插入真核表达载体pcDNA3.1的多克隆位点之间，即得肿瘤内皮标记物-8基因重组真核表达载体pcDNA3.1/TEM-8；

进一步，所述穿膜肽HIV-Tat49-57与RGD肽的融合肽具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，由固相合成法制得；

进一步，所述肿瘤疫苗是于室温、涡旋条件下，向1体积份含有浓度为500μg/ml的pcDNA3.1/TEM-8和浓度为1mg/ml的NaCl的水溶液中，滴加1体积份浓度为200μg/ml的穿膜肽HIV-Tat49-57与RGD肽的融合肽溶液，滴加完毕后，继续涡旋30分钟，再静置30分钟，即得肿瘤疫苗。

本发明的有益效果在于：穿膜肽HIV-Tat49-57与RGD肽的融合肽带正电荷，可以与带负电荷的TEM-8基因重组真核表达载体通过静电作用聚合形成与天然病毒大小相近的致密颗粒，该颗粒性疫苗因具有颗粒性和穿膜肽HIV-Tat49-57的穿膜活性，在体内易于被APC摄取；而且，TEM-8基因重组真核表达载体在APC细胞内表达TEM-8，穿膜肽HIV-Tat49-57可有效促进TEM-8进入MHC-I类抗原呈递途径，从而激发有效的针对肿瘤新生血管内皮细胞的特异性CTL应答；同时，该颗粒性疫苗因具有RGD肽，可以被肿瘤新生血管内皮细胞及肿瘤细胞表面的整合素受体介导摄取，从而抑制肿瘤新生血管内皮细胞的粘附和迁移，并且通过诱导肿瘤细胞中caspase-3和caspase-7表达增高而促进肿瘤细胞凋亡。综上所述，本发明肿瘤疫苗既保留了多肽疫苗安全、易于制备纯化等优点，又克服了多肽分子小、免疫原性弱以及不易被APC摄取等不足，可以同时发挥抑制肿瘤血管生成和诱导肿瘤细胞凋亡的作用，大大提高肿瘤治疗的有效性和安全性，在肿瘤治疗领域具有良好的应用前景。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中：

图1为TEM-8基因PCR产物的琼脂糖凝胶电泳鉴定图；

图2为TEM-8基因重组真核表达载体双酶切产物的琼脂糖凝胶电泳鉴定图；

图3为穿膜肽HIV-Tat49-57与RGD肽的融合肽的高效液相色谱鉴定图；

图4为穿膜肽HIV-Tat49-57与RGD肽的融合肽的质谱鉴定图；

图5为荷瘤裸鼠使用本发明肿瘤疫苗后60天的生存率变化图；

图6为荷瘤裸鼠使用本发明肿瘤疫苗后30天的肿瘤生长曲线图；

图7为荷瘤裸鼠使用本发明肿瘤疫苗后第30天的肿瘤新生血管密度检测结果图。

具体实施方式

以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

一、肿瘤疫苗的制备

1、TEM-8基因重组真核表达载体pcDNA3.1/TEM-8的制备

(1)TEM-8全长编码基因的克隆

根据GenBank登录号为NM 018153.3的TEM-8基因序列，设计并合成如下PCR引物以扩增TEM-8全长编码基因：引物F 1：5′-gccacctttgcgaccctcctgagcttagg-3′(SEQ ID No.3)；引物R 1：5′-tatttccctgcctccattatactgactcaagcag-3′(SEQID No.4)；以人胎盘cDNA文库为模板进行PCR，PCR条件为：94℃预变性3分钟，然后94℃变性30秒、56℃退火30秒，72℃延伸30秒，共30个循环，最后72℃延伸5分钟；PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定、凝胶回收试剂盒切胶回收纯化后，与克隆载体pGEM-T连接，连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取质粒，委托上海生工公司测定基因序列，将序列正确的阳性克隆质粒命名为pGEM-T/TEM-8；

TEM-8基因PCR产物的琼脂糖凝胶电泳鉴定图如图1所示，其中M泳道为DNA分子量标准，1泳道为PCR产物，可见1泳道在约1000bp处呈单一特异性条带，与预期结果相符；质粒测序结果显示插入基因序列与SEQ ID No.1所示的TEM-8全长编码基因序列一致。

(2)TEM-8基因重组真核表达载体的制备

根据TEM-8全长编码基因序列和真核表达载体pcDNA3.1的多克隆位点，设计并合成如下PCR引物以扩增包含TEM-8全长编码基因、5’端PstI酶切位点和3’端XhoI酶切位点的cDNA片段；引物F2：5′-agccctgcaggccacctttgcgaccctcctgagcttagg-3′(SEQ ID No.5)，下划线部分为PstI酶切位点；引物R2：5′-cgtactcgagtatttccctgcctccattatactgactcaagcag-3′(SEQ ID No.6)，下划线部分为XhoI酶切位点；以步骤(1)所得质粒pGEM-T/TEM-8为模板进行PCR，PCR条件与步骤(1)相同；PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定、凝胶回收试剂盒切胶回收纯化后，用限制性内切酶PstI和XhoI进行双酶切，双酶切产物经凝胶回收试剂盒切胶回收纯化后，与同样经PstI和XhoI双酶切的pcDNA3.1在T4DNA连接酶的作用下进行连接，连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取质粒，用PstI和XhoI进行双酶切鉴定，并委托上海生工公司测定基因序列，序列和阅读框架正确的阳性克隆质粒即为构建成功的TEM-8基因重组真核表达载体，命名为pcDNA3.1/TEM-8；

TEM-8基因重组真核表达载体双酶切产物的琼脂糖凝胶电泳鉴定图如图2所示，其中M泳道为DNA分子量标准，1泳道为双酶切产物，可见1泳道在约3500bp和1000bp处出现两条电泳带，与预期结果相符；质粒测序结果显示插入基因序列无突变，阅读框架正确，无移码。

2、穿膜肽HIV-Tat49-57与RGD肽的融合肽HIV-Tat49-57-RGD的制备

HIV-Tat49-57-RGD由穿膜肽HIV-Tat49-57的羧基端与RGD肽的氨基端直接连接而成，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

HIV-Tat49-57-RGD在AB-431A型多肽合成仪上固相合成，采用标准芴甲氧羰基(Fmoc)方案，以0.25mmol的对羟甲基苯氧甲基聚苯乙烯(HMP)树脂为起始树脂，按照HIV-Tat49-57-RGD的氨基酸序列，使肽链自羧基端向氨基端逐个延伸，肽链合成完毕后，将含有肽链的树脂转移至切割液(由酒石酸乙二胺0.25mL、三氟乙酸9.5mL和去离子水0.25mL组成)中，室温下搅拌反应使肽链从树脂上裂解下来，反应液用G6玻砂漏斗过滤，收集滤液，室温下低压蒸干，残余物用去离子水溶解后，用explorer 100型中压液相色谱仪进行纯化，色谱柱为C18柱，流动相A为质量分数为0.1％的三氟乙酸水溶液，流动相B为质量分数为0.1％的三氟乙酸乙腈溶液，二元线性梯度洗脱，流动相B的体积分数在0～15分钟内由10％上升至50％，流速为1mL/min，收集HIV-Tat49-57-RGD的洗脱液，取样进行纯度和分子量鉴定，冷冻干燥，即得HIV-Tat49-57-RGD，用去离子水溶解制成浓度为3mg/ml的溶液，用孔径为0.20μm的微孔滤膜过滤除菌，-70℃冻存备用。

HIV-Tat49-57-RGD的洗脱液用Delta 600型反相高压液相色谱仪进行纯度鉴定，色谱柱为Symmetry C18柱，流动相A为质量分数为0.1％的三氟乙酸水溶液，流动相B为质量分数为0.1％的三氟乙酸乙腈溶液，二元线性梯度洗脱，流动相B的体积分数在0～15分钟内由10％上升至60％，流速为1mL/min，所得高效液相色谱鉴定图如图3所示，经峰面积归一化法计算，HIV-Tat49-57-RGD的纯度为99％。

HIV-Tat49-57-RGD的洗脱液用API 2000LC/MS/MS型质谱仪进行分子量鉴定，所得质谱鉴定图如图4所示，HIV-Tat49-57-RGD的分子量测定值与理论值相符。

3、肿瘤疫苗的制备

于室温、涡旋条件下，向含有浓度为500μg/ml的pcDNA3.1/TEM-8和浓度为1mg/ml的NaCl的水溶液100μl中，以5μl/min的速度滴加浓度为200μg/ml的HIV-Tat49-57-RGD溶液100μl，滴加完毕后，室温下继续涡旋30分钟，再静置30分钟，得pcDNA3.1/TEM-8与HIV-Tat49-57-RGD的复合物，即本发明所述肿瘤疫苗。

二、肿瘤疫苗的活性检测

1、抑制肿瘤血管生成活性的检测

将荷结肠癌细胞CT-26的裸鼠随机分为三组：实验组，对照组I和对照组II，实验组尾静脉注射本发明所述肿瘤疫苗，对照组I尾静脉注射按照同样方法制得的空载体pcDNA3.1与HIV-Tat49-57-RGD的复合物，对照组II尾静脉注射生理盐水，观察各组小鼠的生存率和肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线；取小鼠肿瘤组织，用免疫组化法检测肿瘤新生血管密度(以抗CD31单克隆抗体为一抗)。

结果：荷瘤裸鼠使用本发明肿瘤疫苗后60天的生存率变化图如图5所示，对照组I和对照组II的小鼠分别于第35天和第30天全部死亡，而实验组小鼠60天的生存率为50％，与对照组I和对照组II相比，实验组小鼠生存率高；荷瘤裸鼠使用本发明肿瘤疫苗后30天的肿瘤生长曲线图如图6所示，第30天时，对照组I和对照组II的小鼠肿瘤体积达到5000mm³，而实验组小鼠肿瘤生长缓慢，肿瘤体积仅为2000mm³；荷瘤裸鼠使用本发明肿瘤疫苗后第30天的肿瘤新生血管密度检测结果如图7所示，第30天时，对照组I和对照组II的小鼠CD31阳性细胞数为35个，而实验组小鼠的CD31阳性细胞数为12个，与对照组I和对照组II相比，实验组小鼠的肿瘤新生血管密度低。

2、诱导肿瘤细胞凋亡活性的检测

实验分为三组：实验组、对照组I和对照组II，实验组用本发明所述肿瘤疫苗处理小鼠结肠癌细胞CT-26，对照组I用按照同样方法制得的空载体pcDNA3.1与HIV-Tat49-57-RGD的复合物处理CT-26细胞；对照组II用PBS处理CT-26细胞，共培养48小时，PBS洗涤细胞，加入浓度为250μg/ml的异硫氰酸荧光素标记的磷脂结合蛋白V(Annexin V)5μl和浓度为250μg/ml的碘化丙啶(PI)5μl，冰浴避光孵育10分钟，PBS洗涤细胞，用FACS Calibur流式细胞仪检测细胞凋亡情况：Annexin V和PI均低染的细胞为正常活细胞；AnnexinV高染而PI低染的细胞为凋亡细胞，Annexin V和PI均高染的细胞为坏死细胞。

结果：实验组、对照组I和对照组II的细胞凋亡率分别为51.5％、4.7％和3.8％，表明本发明所述肿瘤疫苗能够有效诱导肿瘤细胞的凋亡。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

序列表

<110>中国人民解放军第三军医大学

<120>基于肿瘤内皮标记物-8基因的双靶标肿瘤疫苗及其制备方法

<160>6

<210>1

<211>1002

<212>DNA

<213>智人(homo sapiens)

<220>

<221>CDS

<222>(1)......(1002)

<400>1

atggccacgg cggagcggag agccctcggc atcggcttcc agtggctctc tttggccact   60

ctggtgctca tctgcgccgg gcaaggggga cgcagggagg atgggggtcc agcctgctac  120

ggcggatttg acctgtactt cattttggac aaatcaggaa gtgtgctgca ccactggaat  180

gaaatctatt actttgtgga acagttggct cacaaattca tcagcccaca gttgagaatg  240

tcctttattg ttttctccac ccgaggaaca accttaatga aactgacaga agacagagaa  300

caaatccgtc aaggcctaga agaactccag aaagttctgc caggaggaga cacttacatg  360

catgaaggat ttgaaagggc cagtgagcag atttattatg aaaacagaca agggtacagg  420

acagccagcg tcatcattgc tttgactgat ggagaactcc atgaagatct ctttttctat  480

tcagagaggg aggctaatag gtctcgagat cttggtgcaa ttgtttactg tgttggtgtg  540

aaagatttca atgagacaca gctggcccgg attgcggaca gtaaggatca tgtgtttccc  600

gtgaatgacg gctttcaggc tctgcaaggc atcatccact caattttgaa gaagtcctgc  660

atcgaaattc tagcagctga accatccacc atatgtgcag gagagtcatt tcaagttgtc  720

gtgagaggaa acggcttccg acatgcccgc aacgtggaca gggtcctctg cagcttcaag  780

atcaatgact cggtcacact caatgagaag cccttttctg tggaagatac ttatttactg  840

tgtccagcgc ctatcttaaa agaagttggc atgaaagctg cactccaggt cagcatgaac  900

gatggcctct cttttatctc cagttctgtc atcatcacca ccacacactg tagcctccac  960

aaaattgcat caggccccac aacagctgct tgcatggaat ag                    1002

<210>2

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：穿膜肽HIV-Tat49-57与RGD肽的融合肽

<400>2

Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Arg Gly Asp

<210>3

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物F1

<400>3

gccacctttg cgaccctcct gagcttagg              29

<210>4

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物R1

<400>4

tatttccctg cctccattat actgactcaa gcag        34

<210>5

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物F2

<400>5

agccctgcag gccacctttg cgaccctcct gagct tagg                      39

<210>6

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物R2

<400>6

cgtactcgag tatttccctg cctccattatac tgactcaa gcag                 44