山竹子果壳总提取物在制备抗炎镇痛药物中的应用

摘要

本发明公开一种山竹子果壳总提取物在制备抗炎镇痛药物中的应用。采用95体积％乙醇对山竹子果壳进行浸提处理，收集浸提液，经过滤、浓缩和干燥后得到山竹子果壳总提取物，对山竹子果壳总提取物进行急性毒性、镇痛活性、抗炎活性以及对羟基自由基清除作用的试验，结果发现该提取物具有很好的镇痛、抗炎活性，可用于制备抗炎镇痛药物。与传统的非甾体类消炎镇痛药相比，其对胃肠的毒副反应明显降低；且对羟基自由基也具有一定的清除作用，具有抗氧化，神经保护的作用。

说明书

技术领域

本发明涉及天然产物化学和药物化学领域，具体涉及山竹子果壳中有效成分的应用，尤其涉及山竹子果壳总提取物在制备抗炎镇痛药物中的应用。

背景技术

疼痛与炎症反应是一种警戒信号，表示机体已经发生组织损伤或预示即将遭受损伤，是机体自我保护的一种防御反应。如果疼痛与炎症长期持续不止，会对机体构成一种难以忍受的精神折磨，严重影响学习、工作、饮食和睡眠，最终因生活质量降低而产生不可忽视的经济和社会问题。

疼痛与炎症是一个连锁反应，二者互为因果，互相影响，由此产生了消炎镇痛药物，目前市场上主流的消炎镇痛药为非甾体类药物(NSAID)，其通过抑制环氧合酶，减少前列腺素的合成而发挥抗炎镇痛作用。

前列腺素对许多组织本有保护作用，用非甾体抗炎药抑制其生物合成，在抑制了炎症组织合成前列腺素的同时使得患者体内其他各种组织失去前列腺素的保护而受到损害。非甾体抗炎药会引起很多不良作用，如胃肠道受损、肾功能异常、干细胞损害坏死等。鉴于非甾体类抗炎药物严重的副反应，开发新的消炎镇痛药刻不容缓。

山竹子(Garcinia mangostana L.)为藤黄科(Guttiferae)山竹子属植物，又称倒捻子、凤果或莽吉柿，属热带常绿中型乔木，其果壳被广泛用于治疗腹泻、疟疾、抗炎、抗溃疡以及抗白血病和败血病等。

山竹子果壳提取物的主要有效成分是口山酮及其衍生物，口山酮又称苯并色原酮，是一类黄色或白色的酚性化合物，该类化合物通常与黄酮类化合物有相似的颜色反应和色谱特征。口山酮母核有8个可取代位置，其结构式如式(I)所示，常见的为羟基、甲氧基核糖基等基团所取代。口山酮类化合物具有广泛的生理活性，是良好的神经抑制剂和心血管兴奋剂，具有解肝毒、保肝、抗惊厥、抑制单胺氧化酶等作用，另外研究表明，该类化合物具有降血糖、抗肿瘤和免疫等生物活性，目前尚未有将山竹子果壳提取物用于消炎镇痛药的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供山竹子果壳总提取物在制备抗炎镇痛药物中的应用。

本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的：

山竹子果壳总提取物是从山竹子果壳中提取的有效成分，其提取方法可采用现有技术中对山竹子果壳进行提取的常规操作，也可以采用95体积％乙醇对山竹子果壳进行浸提处理，收集浸提液，经过滤、浓缩和干燥后得到山竹子果壳总提取物(简称CEM)，将该提取物进行急性毒性和药理实验(包括镇痛活性、抗炎活性以及对羟基自由基清除作用的试验)，结果发现该提取物具有很好的镇痛、抗炎活性，而且对羟基自由基也具有一定的清除作用，可用于制备抗炎镇痛药物，可用于治疗神经病理性疼痛，炎性疼痛，癌症性疼痛，糖尿病、风湿病等病理性疼痛，其单次服用剂量范围为10~200mg/kg。

上述提取方法中，山竹子果壳在粉碎前可先进行预处理：将山竹子果壳清洗干净后，60℃干燥至恒重，将干燥的山竹子果壳掰碎或粉碎后用于后期的提取。

将山竹子果壳用95体积％乙醇分别以1∶5，1∶1.25，1∶1.25的比例浸提3次，浸提总时间为一周左右，收集浸提液，将该浸提液过滤，取滤液浓缩，将得到的浓缩液真空干燥24小时，得到真空干燥的提取物；所述过滤、浓缩和干燥均为本领域的常规操作。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1.本发明采用95体积％乙醇浸提从山竹子果壳中得到山竹子果壳有效成分——山竹子果壳总提取物，该提取物毒性小，且具有较好的镇痛消炎作用；

2.本发明的山竹子果壳总提取物对热敏感性疼痛和炎症性疼痛均有较好的治疗作用，并有较好的胃肠道保护作用；

3.本发明的山竹子果壳总提取物具有较好的消炎作用；

4.本发明的山竹子果壳总提取物均具有较好的羟自由基清除作用，具有抗氧化和神经保护的作用。

附图说明

图1为热板致痛法测定CEM镇痛活性的柱状图；

其中，^*表示与对照组相比P＜0.05，^**表示与对照组相比P＜0.01，1为对照组，2为吲哚美辛组，3为CEM低剂量组，4为CEM中剂量组，5为CEM高剂量组；

图2为扭体法测定CEM镇痛活性柱状图；

其中，^*表示与对照组相比P＜0.05，^**表示与对照组相比P＜0.01，1为对照组，2为浓度10mg/kg的吲哚美辛组，3为CEM低剂量组，4为CEM中剂量组，5为CEM高剂量组；

图3为小鼠耳朵肿胀法测定CEM抗炎活性柱状图；

其中，^*表示与对照组相比P＜0.05，^**表示与对照组相比P＜0.01，1为对照组，2为吲哚美辛组，3为CEM低剂量组，4为CEM中剂量组，5为CEM高剂量组；

图4为CEM对·OH的清除作用折线图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步地解释，但具体实施例并不对本发明做任何限定。

实验动物：清洁级昆明小鼠，雌雄各半，体重18-24g，动物均购自中山大学医学院实验动物中心

本实施例涉及的各实验试剂均为市售：乙醇，甲醇，乙酸乙酯(EtOAC)，石油醚，二甲苯，氯仿，乙酸，二甲亚砜(DMSO)，甘油，FeSO₄·7H₂O，30％H₂O₂，水杨酸钠，连苯三酚，消炎痛肠溶包衣片

各实验组的剂量设置：

(1)山竹子果壳总提取物(CEM)做的药理实验均设高中低三个剂量组，其浓度分别为80、40和20g/kg；

(2)对照组给10ml/kg的生理盐水

(3)吲哚美辛组浓度为10mg/kg；

上述各组均为灌胃给药(i.g.)。

实施例1山竹子果壳总提取物的制备

把山竹子果壳洗干净，置于恒温干燥箱中，60℃干燥至恒重，称重得到4.37kg；把干燥的山竹子果壳掰碎，加入6.4L 95体积％乙醇浸提。一周后，过滤浸提液，取滤液，浓缩；浓缩液真空干燥24小时，制备得到真空干燥的提取物，该提取物即为山竹子果壳总提取物(简称CEM)。

实施例2CEM的急性毒性实验

本实施例对实施例1制备得到的山竹子果壳总提取物(简称CEM)进行急性毒性试验。

1.最大耐受量实验(MTD)

20只小鼠雌雄各半，分成两组，实验前禁食12小时，分别给予两种不同浓度的山竹子粗提物溶液(2gCEM/ml浓度组和5.8gCEM/ml浓度组)每次每鼠i.g.5.8gCEM/ml和2g生药/ml。每次灌胃溶液0.4ml，每隔2小时灌一次，连续灌五次，然后观察7天并记录动物的摄食、精神状态、活动和死亡情况，期间小鼠自由进食及饮水。一旦发现小鼠出现死亡，立即停止每隔2小时进行一次的灌胃，剩余的小鼠观察7天。以死亡前一次的总灌胃量作为小鼠的最大耐受量。

2gCEM/ml浓度组：每次灌胃后，小鼠活动均正常；灌胃后观察一周，发现小鼠活动正常，敏捷，摄食饮水情况正常。

5.8gCEM/ml浓度组：在第二次灌胃后，部分小鼠表现异常兴奋，剩余部分蜷伏不动；从第三次灌胃开始，每次灌胃后都有小鼠相继死亡，但尸检发现心、肺和肝脏无异常，只有胃体积增大两、三倍，使腹部鼓起来；五次灌胃后只剩下五只小鼠，也毫无生气，只是蜷伏不动，不吃也不喝；次日，发现四只小鼠死亡，尸检情况与此前相同。剩下的最后一只雌性小鼠，趴伏不动，不吃，甚少喝水，两天后，才恢复正常活动。

故山竹子果壳总提取物(CEM)的最大浓度、最大灌胃量为药物溶液浓度5.8g/ml，一次灌胃0.8ml/只。小鼠的最大耐受量为5.8g/ml×0.4ml×2＝4.64g·20g^-1体重＝232g·Kg^-1体重。

实施例2热板致痛法测定CEM的镇痛活性

热板致痛法采用本领域技术人员的常规操作，对本实施例1制备所得山竹子果壳总提取物(CEM)进行镇痛活性测定。

给药前先测定每只小鼠的痛阈，以平均值不超过30s者合格，出现跳跃现象的弃之不用。

选取符合上述条件的雌性小鼠50只，分为生理盐水组、吲哚美辛组、CEM低剂量组(20g/kg)、CEM中剂量组(40g/kg)和CEM高剂量组(80g/kg)，10只/组，其中生理盐水组为对照组，吲哚美辛组为阳性对照组。

实验前禁食12小时，给药后1小时开始测定，以后每隔1小时测定一次，4小时后结束。金属盘放在事先调至55±0.5℃水浴锅中，加热后作热刺激，秒表记录小鼠自投入热板至出现舔足时间(s)作为该鼠的痛阈值，如痛阈值超过60s，即停止测试，按60s计算。

痛阈提高百分率＝(用药后平均痛阈值一对照组平均痛阈值)/组照组平均痛阈值×100％。

如图1所示，在CEM的镇痛活性测定中，作为阳性对照药物的吲哚美辛的痛阈提高百分率是237％，CEM低、中、高剂量组的痛阈提高百分率分率是307％、686％和424％。

实验表明CEM对热板引致的疼痛反应有抑制作用，能使小鼠舔后足现象出现的潜伏期延长，说明具有中枢镇痛活性。

实施例3扭体法测定CEM的镇痛活性

本实施例采用本领域技术人员的常规操作进行扭体法对实施例1制备所得CEM进行镇痛活性测定。

选择50只小鼠，雌雄各半，分为生理盐水组、吲哚美辛组、CEM低剂量组(20g/kg)、CEM中剂量组(40g/kg)和CEM高剂量组(80g/kg)，共五组，10只/组，其中生理盐水组为对照组，吲哚美辛组为阳性对照组。

实验前禁食12小时，给药1小时后，腹腔注射0.6％的乙酸，0.2ml/只，数20min内小鼠的扭体次数。小鼠腹部和后肢因刺激而伸长一次定义为一次扭体反应。实验结果通过抑制百分率反映。

抑制百分率＝(生理盐水组平均扭体数一给药组平均扭体数)/生理盐水组平均扭体数×100％。

实验结果：如图2所示，CEM和阳性药物吲哚美辛都显著地抑制醋酸引起的扭体反应，使小鼠扭体次数减少，说明两种药物都具有外周镇痛活性。CEM的镇痛活性具有剂量依赖性，其低、中、高剂量组的抑制率分别是47％、76％和97％，吲哚美辛组的抑制率只有50％。可见，CEM低剂量组的镇痛效果与吲哚美辛相近，两者没有统计学差异。而CEM中、高剂量组镇痛效果显著，与对照组相比，具有非常显著的差异，并且CEM高剂量组的镇痛作用远比阳性药物(吲哚美辛)好。

实施例4小鼠耳朵肿胀法测定CEM的抗炎活性

本实施例的小鼠耳朵肿胀法采用本领域技术人员的常规操作对实施例1制备所得CEM进行镇痛活性测定。

50只小鼠，雌雄各半，分为生理盐水组、吲哚美辛组、CEM低剂量组、CEM中剂量组和CEM高剂量共五组，10只/组，其中生理盐水组为对照组，吲哚美辛组为阳性对照组

实验前禁食12小时，给药1小时后，用二甲苯涂在小鼠右耳致炎，4小时后把小鼠断颈处死，沿耳廓基线剪下两耳，用7mm直径打孔器分别在同一部位打下圆耳片用电子天平称重。每鼠的左耳片重量减右耳片重量即为肿胀度。

实验结果：如图3所示，山竹子和吲哚美辛都能够抑制二甲苯引致的小鼠耳朵肿胀，说明两种药物都具有消肿、抗炎作用。但是山竹子抑制肿胀的作用并不呈现剂量依赖性。山竹子低、中剂量组的肿胀抑制率分别是11％和58％，吲哚美辛的肿胀抑制率是36％，可见三者之中，山竹子中剂量组的抗炎作用最强，与模型组相比，具有显著性差异(p＜0.05)，其抗炎效果比很多已报导的抗炎中药更好。

实施例5CEM对羟自由基(·OH)的清除作用

用DMSO(二甲基亚砜)溶解实施例1制备所得CEM，然后用蒸馏水稀释成不同质量浓度(20，40，80，100，200，400，800μg/ml)的CEM溶液。

根据FeSO₄+H₂O₂产生·OH，以·OH氧化水杨酸所得产物的吸光值示·OH多少，吸光值越大，·OH越多。3mL反应液中含0.15mol/LFeSO4，6mmol/LH₂O₂，2mmol/L水杨酸钠和不同质量浓度的CEM溶液，最后加H₂O₂启动反应，37℃反应1h，测510nmOD值，吸光值越小，清除效果越好。用{[A₀-(A_i-A_0i)]/A₀}×100％计算·OH的清除率，其中A₀为对照，不加CEM；A_i为某质量浓度的CEM时的吸光值，A_0i为无水杨酸时CEM的吸光值。

实验结果：如图4所示，从整体看，粗提物的·OH清除作用呈现一定的量效效应，随着粗提物浓度的增大，其清除作用增强，但增幅不高。各浓度组与对照组相比，具有非常显著的差异性(p＜0.01)。

实施例6山竹子提取物对肠胃道的影响

每十只老鼠算一个实验组，分别分为山竹子果壳总提取物组和吲哚美辛组。

连续灌胃的四天内，吲哚美辛组先后有六只小鼠死亡，雌雄各半，死亡概率60％，且尸检发现的情况相似，即心肺正常，但胃肠及肝都呈现黑色，并发出恶臭，显微镜下观察发现胃粘膜内大面积出血。而山竹子果壳总提取物组没有老鼠死亡。

显微镜下，正常小鼠的胃呈现鲜亮的颜色，小肠可看到微绒毛的存在。

山竹子果壳总提取物组小鼠的胃、肠正常，没有充血，与正常组的相同。而吲哚美辛组小鼠的胃严重充血，显微镜下，整个胃显得黯淡无光，更没有了立体感，仿佛只剩一层薄薄的膜。小肠充血情况严重，多处出现上图的空泡，微绒毛也消失了。吲哚美辛组存活的小鼠胃、肠道都没有发现异常的充血情况，只是表明上看没有了亮泽感。

由此说明本发明的山竹子果壳总提取物与传统的非甾体类抗炎药相比其对动物肠胃毒副作用明显降低，使用更安全。