苏木素在测定细胞增殖活性和药物对细胞毒效应中的应用

摘要

本发明公开了苏木素在测定贴壁细胞增殖活性和药物对贴壁细胞毒性作用中的应用，利用苏木素对细胞进行染色，然后测定特定波长下的吸光度值，从而得出相应的数据和结论。发明人采用苏木素染色法对SGC7901、M21和Huvec等贴壁细胞不同时相(12h、24h、48h、72h)细胞增殖活性的多次测定结果均表明，此方法不仅特异性高，且CV＜3％，具有较好的可重复性。本发明具有灵敏度高、检测结果稳定、适用范围广、成本低等优点。

说明书

技术领域

本发明涉及苏木素在测定贴壁细胞增殖活性和药物对贴壁细胞毒性作用中的应用。

背景技术

随着抗肿瘤药物开发的日益深入，愈来愈多中药的抑瘤作用被世人关注，对这类药物或其提取物进行体外筛选亦是药物开发过程的重要环节。采用稳定、可靠的检测方法观察药物对不同细胞系体外增殖抑制活性是必需的。

观察细胞增殖活性及细胞毒性作用，常规采用四类方法：1、同位素方法，主要有³H-TdR掺入法、¹²⁵I-UdR及⁵¹Cr释放法，虽然这类方法敏感、特异，但存在对环境污染及需复杂昂贵的仪器设备等诸多弊端。2、流式细胞仪分析法同样具有敏感、特异等优点，但亦须昂贵复杂的仪器设备，不易在基层推广应用。3、Giemsa染色法、结晶紫、台盼兰等染色法，虽然简便、经济，但存在结果不稳定和严重的非特异性吸附等缺点。4、酶底物法主要有传统的MTT比色法等，其特点是以活细胞的某种酶和相应底物之间的反应来显示细胞数量和生存状态，优点是敏感快速及重复性较好，且对人体无损伤，通过对此方法的不断改进完善，多年来一直广泛应用于细胞增殖和细胞毒性作用等研究领域。CCK-8是MTT的一种升级替代产品，其作用原理与MTT相似，与MTT相比具有敏感性更高，且操作更简便等优点，非常适合用于细胞增殖和一般化学药物的细胞毒性实验。本研究在采用MTT比色法和CCK-8比色法观察中药提取物金荞麦对肿瘤细胞的毒性作用时发现MTT和CCK-8均与金荞麦提取物发生不同程度的非特异性反应，致使结果波动范围较大，剂量依赖关系不明显。基于上述所述，寻找特异、稳定、简便、经济的体外药物筛选方法已成当务之急。

苏木素是一种天然染料，通过氧化变为苏木红，通常用于生物组织切片细胞核的染色。本研究将苏木素用于检测贴壁细胞增殖和药物对贴壁细胞毒性作用，苏木素仅能被固定前的活细胞吸附，活细胞数量越多，状态越好，则染色越深，所测OD值越高；反之，活细胞数量越少，状态越差，则染色越浅，OD值越低，从而间接对活细胞的数量进行定量。目前尚无将其用于测定贴壁细胞系体外增殖活性和药物对贴壁细胞毒性作用的研究和报道。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了苏木素的一种新用途，即苏木素在测定贴壁细胞增殖活性和药物对贴壁细胞毒性作用中的应用。本发明还建立了一套测定贴壁细胞增殖活性和药物对贴壁细胞毒性作用的检测方法。本发明的检测方法具有特异、稳定、简便、经济等优点。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种利用苏木素测定贴壁细胞增殖活性的方法，步骤如下：取已稀释好的待测细胞悬液，置于细胞培养板的各相应孔中，每孔200μl，于37℃、体积分数为5％的CO₂饱和湿度条件下，孵育44小时，甩弃上清，立即加入4％的多聚甲醛溶液，每孔100μl，固定20分钟后收集固定液(可反复利用)，PBS洗3次，每次200μl/孔，弃上清，室温晾干；取苏木素染色液，每孔加入100μl，20分钟后收集染色液(可反复利用)，蒸馏水洗3～5次，以去除未结合的染料，室温晾干；于倒置显微镜下观察细胞着色状况，再加入1％的盐酸酒精，100μl/孔，此时各孔液体呈现不同程度的粉红色，20分钟内用酶标仪测定540nm处的吸光度值并记录，取各组OD值均数并绘制细胞系增殖曲线。

一种利用苏木素测定药物对肿瘤细胞系毒性作用的方法，步骤如下：取待测细胞液，置于细胞培养板的孔板中，每孔200μl，同时设定无药物细胞对照和培养基酶标仪调零孔，于37℃、体积分数为5％的CO₂饱和湿度条件下，孵育44小时；取出细胞培养板甩弃上清，立即加入4％的多聚甲醛溶液，150μl/孔，固定20分钟后收集固定液；PBS洗3次，每次200μl/孔，弃上清，室温晾干；取苏木素染色液，每孔加入100μl，20分钟后收集染色液；蒸馏水洗3～5次以去除未结合的染料，室温晾干；于倒置显微镜下观察细胞着色状况，再加入1％的盐酸酒精，100μl/孔，此时各孔液体呈现不同程度的粉红色，20分钟内用酶标仪测定540nm处的吸光度值并记录，按下式计算药物的抑瘤率：

其中，OD值(试验孔X)表示实验组各孔OD值的均数；OD值(细胞对照孔X)表示无药细胞对照组各孔OD值的均数。

所述4％的多聚甲醛溶液是按照文献《组织培养和细胞学技术》(鄂征，北京出版社P146)中的描述配制的，方法如下：将多聚甲醛40g溶于0.1mol PBS 1000ml中，加热至60℃左右，不断搅拌至透明，也可加少许1mol NaOH使溶液透明。

所述苏木素染色液是按文献《常用苏木素几种配方与染色结果的比较》(李文，张赛霞，解剖学杂志，2000；23(4)：393)中的描述配制的，方法如下所示：1.5g苏木素用5ml无水乙醇溶解，蒸馏水溶解钾明矾(加温至90℃，勿煮沸)，将溶解的苏木素和碘酸钠同时加入钾明矾水溶液内，流水冷却至室温，再加甘油，震荡1小时后即可使用，染液可保用6个月。

所述1％盐酸酒精溶液是指盐酸和酒精体积分数分别为1％和70％的溶液。

所述PBS是指0.01mol/L的磷酸盐缓冲液，PH＝7.2。

所述加入4％的多聚甲醛溶液、PBS和苏木素染色液是采用多通道微量移液器，不仅可简化繁琐的实验程序，而且能大大减少各孔之间的误差。

本发明的发明人采用苏木素染色法对SGC7901、M21和Huvec等贴壁细胞不同时相(12h、24h、48h、72h)细胞增殖活性的多次测定结果均表明，此方法不仅特异性高，且CV＜3％，具有较好的可重复性。

发明人在采用MTT比色法和CCK-8比色法观察葡萄籽原花青素(GSPE)对细胞的增殖效应，金荞麦提取物对肿瘤细胞毒性作用时发现，MTT和CCK-8均可与此类中药提取物产生不同程度的非特异性反应，检测结果(OD值)与未掺入MTT和CCK-8前镜检观察结果相差甚远，剂量依赖关系不明显，致使结果波动范围较大。而将苏木素染色法应用于金荞麦提取物对肿瘤细胞(M21和SGC7901细胞)的毒性测定，多次实验结果显示M21和SGC7901细胞对金荞麦提取物有较好的剂量依赖关系，并与镜检观察结果高度一致，提示此方法可较客观地反映此类物质对不同细胞的细胞毒作用。

本发明的检测方法在固定和染色结束后，固定液和苏木素染色液可回收并多次反复使用。与昂贵的CCK-8试剂相比，苏木素染色法的经济实用则显得颇为突出。本发明的检测方法具有效果好、成本低、检测结果稳定等优点。

附图说明

图1为苏木素染色法和MTT法对Huvec增殖活性的测定的比较示意图；

图2为苏木素染色法和CCK-8法对Huvec增殖活性的测定的比较示意图；

图3为苏木素染色法和MTT法对M21细胞增殖活性的测定的比较示意图；

图4为VCR对M21细胞的毒性作用示意图；

图5为VCR对SGC7901细胞的毒性作用示意图；

图6为5-Fu对M21细胞的毒性作用示意图；

图7为5-Fu对SGC7901细胞的毒性作用示意图；

图8为顺铂对VX2细胞的毒性作用示意图；

图9为苏木素染色法和CCK-8法测定金荞麦提取物对SGC7901细胞的毒性作用示意图；

图10为苏木素染色法测定金荞麦提取物对SGC7901细胞的毒性作用示意图；

图11为苏木素染色法和CCK-8法测定金荞麦提取物对M21细胞的毒性作用示意图；

图12为CCK-8法测定金荞麦提取物对M21的毒性作用示意图；

图13为金荞麦提取物对M21细胞的毒性作用示意图(100mg/L；放大250倍)；

图14为金荞麦提取物对M21细胞的毒性作用示意图(0mg/L；放大250倍)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明：

实施例1：

(1)苏木素染色法检测贴壁细胞增殖活性，如下：

取1640完全培养基加入96孔细胞培养板中，100μl/孔。0.25％胰酶分别消化Huvec和M21细胞，离心后弃上清，用完全培养基调相应的细胞浓度。然后各取100μl细胞悬液分别加入上述96孔细胞培养板各相应孔中，混匀后倍比2稀释，依次设8个稀释度，每个稀释度3复孔，然后各孔补充完全培养基至200μl，并设1孔1640培养基用于酶标仪调零。将96孔细胞培养板置37℃、体积分数为5％的CO₂饱和湿度条件下，孵育44小时。取出96孔细胞培养板甩弃上清，用8通道微量移液器立即加入4％的多聚甲醛溶液，150μl/孔，固定20分钟后收集固定液(可反复应用)。PBS洗3次，弃上清，室温晾干。用8通道微量移液器取苏木素染色液100μl加入各孔，20分钟后收集染色液(可反复利用)。蒸馏水洗3-5次以去除未结合的染料，室温晾干。于倒置显微镜下观察细胞着色状况，加入1％的盐酸酒精，100μl/孔，此时各孔液体呈现不同程度的粉红色，20分钟内用酶标仪测定540nm处的吸光度值并记录。计算各组OD值均数并绘制细胞系增殖曲线。

(2)MTT比色法观察Huvec和M21细胞系的增殖活性，按文献田志刚，张建华 MTT法在检测细胞增殖与细胞毒效应中的应用 中国肿瘤生物治疗杂志1994；1(1)：74方法进行，步骤略。

(3)CCK-8比色法观察Huvec的增殖活性，如下：

首先取100μl完全培养基加入各孔。0.25％的胰酶消化收集Huvec后，用完全培养基调相应的细胞浓度。将细胞悬液混匀后，分别取100μl加入96孔细胞培养板各相应孔中，混匀后倍比2稀释，设8个稀释度，每个浓度3复孔，并设1孔1640培养基对照用于酶标仪调零。将96孔细胞培养板置37℃、5％的CO₂饱和湿度条件下培养44小时。取CCK-8溶液10μl加入各孔，继续孵育1h后，酶标仪测定450nm处OD值并记录。计算各浓度OD值的均数并绘制细胞增殖曲线。

结果：用上述三种方法测定Huvec孵育44小时后的增殖活性，绘制的细胞增殖曲线的比较如图1、图2所示，虽然三种测定方法需选择三个不同波长(570nm、540nm和450nm)，并且所测OD值相差较大，尤其是苏木素染色法最高OD值仅为0.27，而CCK-8比色法OD值则接近3.0，但是三种方法所测OD值不仅线性关系良好，而且具有相似的反应曲线(见图1、2)。

苏木素染色法和MTT法对M21细胞增殖活性的比较如图3所示。苏木素染色法和MTT比色法测定结果显示，M21细胞孵育44小时后，在一定密度范围内细胞数量与OD值呈线性关系，而M21细胞浓度为1×10⁹/L时，由于细胞密度大或培养时间长而引起细胞所需营养消耗快，从而导致部分细胞死亡或生长不良，则OD值呈下降趋势(图3)。

实施例2：

(1)苏木素染色法检测药物对肿瘤细胞系的毒性作用

分别取M21、SGC7901和VX2细胞，用0.25％的胰酶消化离心后弃上清，用完全培养基调相应的细胞浓度，依次加入96孔细胞培养板中，100μl/孔。将96孔板置37℃、5％的CO₂饱和湿度条件下孵育过夜使其贴壁。将VCR、5-Fu、CDDP和金荞麦提取物依次稀释5或6个不同的浓度，分别加入96孔板各相应孔中，100μl/孔，3复孔/浓度，另设6-9孔无药物细胞对照和1孔1640培养基酶标仪调零孔，每孔液体总量为200μl。将96孔细胞培养板置37℃、5％的CO₂饱和湿度条件下孵育44小时。取出96孔细胞培养板甩弃上清，立即加入4％的多聚甲醛溶液，150μl/孔，固定20分钟后收集固定液；PBS洗3次，弃上清，室温晾干；取苏木素染色液，每孔加入100μl，20分钟后收集染色液；蒸馏水洗3～5次以去除未结合的染料，室温晾干；于倒置显微镜下观察细胞着色状况，再加入1％的盐酸酒精，100μl/孔，此时各孔液体呈现不同程度的粉红色，20分钟内用酶标仪测定540nm处的吸光度值并记录，不同药物的抑瘤率计算公式如下：

(2)MTT比色法检测药物对肿瘤细胞系的毒性作用：按文献田志刚，张建华 MTT法在检测细胞增殖与细胞毒效应中的应用 中国肿瘤生物治疗杂志1994；1(1)：74中的方法进行，步骤略。

结果：苏木素染色法和MTT比色法测定VCR、5-Fu对M21和SGC7901细胞的毒性作用，结果显示两种肿瘤细胞系对药物均有剂量反应关系，实验重复性较好(CV＜8％)。有趣的是苏木素染色法所测抑瘤率均高于MTT比色法所测抑瘤率(图4、5、6、7)，本研究认为苏木素染色法所测结果接近显微镜下观察结果。因为苏木素染色法仅能使固定前的活细胞着色，而固定前已死亡的细胞及碎片不能吸附染料，表明此方法具有较强的特异性和稳定性。图9显示顺铂对VX2细胞具有良好的抑瘤作用，两种方法所测结果呈现明显的剂量反应关系。

实施例3：CCK-8比色法检测金荞麦提取物对肿瘤细胞的毒性作用：

分别取M21、SGC7901细胞，用0.25％的胰酶消化离心后，完全培养基调相应的细胞浓度，依次加入96孔细胞培养板中，100μl/孔。将96孔板置37℃、5％的CO₂饱和湿度条件下孵育过夜使其贴壁。将金荞麦提取物稀释6个不同浓度，依次加入96孔细胞培养板各相应孔中，100μl/孔，3复孔/浓度，另设无药物细胞对照6孔和1孔1640培养基酶标仪调零孔，每孔液体总量为200μl。将96孔细胞培养板置37℃、5％CO₂孵箱中孵育44小时。取出96孔细胞培养板，用微量移液器轻轻吸弃100μl上清，然后加入CCK-8溶液10μl/孔。37℃继续孵育1小时，酶标仪测定450nm处OD值并记录结果。抑瘤率的计算公式同实施例2。

结果：采用MTT比色法、CCK-8比色法和苏木素染色法测定金荞麦提取物对SGC7901和M21细胞的毒性作用。MTT比色法所测OD值基本是一直线，无剂量依赖关系(结果未列)。图9表明CCK-8比色法显示金荞麦提取物在400mg/L和200mg/L对SGC7901细胞有较强的毒性作用，100mg/L以下浓度OD值均高于无药物细胞对照孔，但镜下观察发现100mg/L各孔中的细胞却有50％左右死亡破碎。同时50mg/L和25mg/L各实验孔中的细胞均有不同程度的死亡，而无药对照组各孔细胞生存状态良好，基本无细胞死亡，但OD值却呈下降趋势。苏木素染色法所测OD值不仅线性关系良好，同时镜下观察不同药物浓度各孔细胞生存状态与所测OD值相符(图10)。采用两种方法检测金荞麦提取物对M21细胞的毒性作用结果与SGC7901细胞相似。虽然CCK-8比色法所测OD值线性关系尚可(图11、12)，但在金荞麦提取物为100mg/L时，OD值虽然比无药物对照孔略低，镜下观察各孔M21细胞状态较差，细胞死亡明显(图13)与无药物细胞对照孔相比差异较大(图14)，提示CCK-8比色法和MTT比色法不能真实地反映药物作用后细胞的生存状态。苏木素染色法所测金荞麦提取物对M21细胞的毒性作用线性关系良好，证明该方法稳定、特异，具有良好的可重复性(CV＜8％)。

以上实施例所用到的材料、主要试剂及主要仪器来源如下：

A、细胞系及实验动物：

M21(人黑素瘤细胞)和Huvec(人脐静脉内皮细胞)，均可从美国菌种保藏中心购买；SGC7901(人胃腺癌细胞)可从中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库购买。VX2细胞为兔鳞状细胞癌，本实验室将VX2肿瘤组织块分离成单个细胞，并在体外连续培养了300余天，体外传100余代，冻存复苏后生物学特性未见改变，已建系，武汉大学可提供体内传代肿瘤组织块。

B、主要试剂：

苏木素(上海进口分装)，按文献李文，张赛霞常用苏木素几种配方与染色结果的比较解剖学杂志，2000；23(4)：393配制Carazzi苏木素染色液；

1％盐酸酒精溶液，盐酸和酒精体积分数分别为1％和70％；

4％的多聚甲醛，按文献《组织培养和细胞学技术》(鄂征，北京出版社P146)方法配制；

MTT(四甲基偶氮唑盐，Fluka产品)，用生理盐水溶解为5g/L，过滤除菌；

体积分数为10％的SDS(十二烷基硫酸钠，Sigma产品)水溶液；

CCK-8，日本同仁化学研究所产品；

RPMI1640培养基(GiBCO产品)，按说明书配制，内含体积分数为10％小牛血清(国产)或胎牛血清(GiBCO产品)，为完全培养基(CM)；

胰酶Hanks溶液，将体积分数为0.25％的胰酶溶于Hanks溶液中；

长春新碱(浙江海正药业有限公司)、5-氟尿嘧啶(上海旭东海普药业有限公司)、顺铂(山东省齐鲁制药厂)，均用生理盐水溶解至相应的浓度，-20℃冻存备用；

金荞麦提取物(云南曲靖格力康生物科技发展公司)，20％的乙醇溶液溶解后-20℃冻存备用。

C、主要仪器：

BioRad550酶标仪(美国BioRad公司产品)，CO₂孵育箱(日本ESPEC)，8通道微量移液器(法国吉尔森公司产品)，96孔细胞培养板(Costar公司)，100目不锈钢网等，其余略。

最后，需要指出：苏木素染色法在该领域的应用尚处于起步阶段，测定结果的最大OD值一般在1.0以下，存在线性范围较窄的问题，如何进一步提高活细胞对染料的吸附能力或寻找更合适的脱色液增强显色强度，进一步提高其灵敏度是今后需解决的关键所在。另外，在应用苏木素染色法进行上述实验时，严格控制起始细胞数量、细胞孵育时间、细胞固定、染色和脱色时间等亦是获得满意实验结果的基本条件。