香蕉苞片花叶病毒实时荧光RT－PCR检测试剂及制备方法和应用

摘要

本发明公开了香蕉苞片花叶病毒实时荧光RT－PCR检测试剂及制备方法和应用，系选择香蕉苞片花叶病毒特异且各株系之间比较保守的CP编码基因片段为靶目标序列，经过精心设计并合成，包含一对特异性引物和一条特异性荧光探针，扩增目标核苷酸序列的片段长度为74bp，引物序列为BBrMV TF：5′－caaaaactacgaacagggctagaga－3′，BBrMVTR：5′－ccgagtgtttgatccacgaa－3′，探针序列为5′－FAM－cacacacgcagatgaaagctgcagc－Eclipse－3′；本发明克服了常规RT－PCR费时、易污染以及扩增后需电泳检测等缺点，可对样品中的BBrMV进行快速准确的定性检测，具有简单、易操作、结果直观、敏感性高、重复性好等优点。

说明书

技术领域

本发明涉及检测香蕉苞片花叶病毒的生物制剂，具体涉及香蕉苞片花叶病毒实时荧光RT-PCR检测试剂及制备方法和应用。

背景技术

香蕉苞片花叶病毒(Banana bract mosaic virus，BBrMV)属于马铃薯Y病毒属，病毒粒子线形，长660～760nm，直径12nm，主要侵染芭蕉属植物。病毒侵染香蕉后，病叶上沿着叶柄产生深绿色或褐色的梭条斑，而病株花序苞片上则出现黑色斑点，能够引起香蕉的减产和品质下降。在自然条件下，BBrMV的传播主要依赖蚜虫的非持久性传播，长距离扩散则随感病植株的无性繁殖材料传播。目前，BBrMV主要分布于菲律宾和印度等国，在国内未见有分布，是我国新颁布的进境植物检疫性有害生物。

香蕉苞片花叶病毒的检测方法主要包括生物学鉴定、血清学检测和逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术等。生物学鉴定方法耗工费时，需要隔离温室，检测周期较长；血清学方法常用的是双抗体夹心酶联检测技术，适用于多样本的初筛，具有操作简单的优点，但其检测灵敏度较低，且常常由于抗体制备的质量问题而出现非特异性反应。RT-PCR是用于检测病毒核酸的技术方法，具有较好的敏感性和特异性，但需要进行DNA电泳等PCR后处理，接触有毒试剂溴化乙锭，易发生交叉污染而造成假阳性结果。

实时荧光RT-PCR(Real-time fluorescent RT-PCR)是近几年发展起来的RT-PCR技术与荧光检测相结合的方法，其原理是使用能特异标记核苷酸序列的荧光物质，利用荧光信号的积累实时监测整个PCR过程，具有检测周期短、特异性与灵敏度高以及无需PCR后处理等优点。以TaqMan水解探针为例，探针一端标记荧光基团，另一端标记淬灭基团，通常状态下，荧光基团与淬灭基团发生荧光共振能量转移现象，荧光基团的荧光被淬灭基团吸收。当PCR进入退火阶段时，荧光探针特异的结合在两条引物之间，在延伸阶段被聚合酶的5′端外切酶活性切开。荧光基团与淬灭基团分离，仪器检测出荧光。荧光PCR仪在反应过程中连续的检测荧光信号的变化，当荧光信号增强到某一阈值时，此时的循环次数(Ct)就被记录下来。由于荧光信号伴随着PCR模板的扩增而增长，因此可以根据荧光信号是否增长来确定模板是否扩增。

因此，研究建立特异、快速、可对低含量BBrMV病毒侵染、隐性感染或持续带毒寄主进行准确检测的方法，在检疫、诊断、分子流行病学研究等方面具有重要的实际应用价值。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种对香蕉苞片花叶病毒具有特异性高、敏感性强和快速检测的实时荧光RT-PCR检测试剂。

本发明还提供了该检测试剂的制备方法和应用。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：系选择香蕉苞片花叶病毒CP编码基因的保守片段为靶目标，应用primer Express 3.0软件，设计合成引物和探针；将设计的多对引物和探针进行最佳配对筛选实验，得到最合适的引物和探针。

本发明所述的香蕉苞片花叶病毒实时荧光RT-PCR检测试剂包含一对特异性引物和一条特异性荧光探针，扩增目标核苷酸序的片段长度为74bp，引物和探针序列为：

引物：BBrMV TF：5′-caaaaactacgaacagggctagaga-3′

BBrMV TR：5′-ccgagtgtttgatccacgaa-3′

探针：5′-FAM-cacacacgcagatgaaagctgcagc-Eclipse-3′。

本发明所述的香蕉苞片花叶病毒实时荧光RT-PCR检测试剂的制备方法，由下述步骤组成：

一、选择香蕉苞片花叶病毒CP编码基因的保守片段为靶目标，该保守片段的扩增目标核苷酸序列为：

caaaaactac gaacagggct agagaagcac acacgcagat gaaagctgca 50

gctattcgtg gatcaaacac tcgg                             74

二、应用primer Express 3.0软件，设计合成引物和探针；

三、引物和探针的合成采用β-乙腈磷酸胺化学合成法，使用全自动DNA合成仪进行OligoDNA的合成；

四、探针合成同时进行两端荧光标记，探针5′端标记的荧光报告基团为FAM，3′端标记的是不发荧光的淬灭基团Eclipse；荧光报告基团FAM也可以用TET、VIC、JOE等发光基团代替；

五、将设计合成的多对引物和探针进行最佳配对筛选实验后，初步确定候选引物和探针；

六、经过大量的反应条件优选、对比试验和验证试验，并经过大量实际样品的检测应用评估，得到扩增效率和特异性好的所述的引物和所述的探针。

与现有技术相比，本发明的优点在于香蕉苞片花叶病毒实时荧光RT-PCR检测试剂是将RT-PCR技术与荧光检测相结合，构建并筛选出上述扩增效率和特异性好的一对引物和一条探针，克服了常规RT-PCR费时、易污染以及扩增后需电泳检测等缺点，可对样品中的BBrMV进行快速准确的定性检测，具有简单、易操作、结果直观、敏感性高、重复性好等优点。具体优点如下：

1、本发明与常规RT-PCR的检测试剂相比，具有特异、敏感的优点；本发明可对样品中低含量的BBrMV病毒、隐性感染或持续带毒寄主进行准确检测，是一种非常适合BBrMV检测的试剂。

2、本发明与常规RT-PCR的检测试剂相比，具有适用范围广，使用安全的优点；可对果实、种子、叶片、茎秆、土壤、媒介昆虫等多种样品中的BBrMV进行快速检测，适用范围广；本发明克服了常规RT-PCR的产物须电泳检测、接触有毒试剂的缺点，降低了生物安全隐患，提高了使用安全性。

3、本发明与常规RT-PCR的检测试剂相比，具有检测量大和快速的优点；可同时进行大量样品检测，具有高通量性，可减少RNA、cDNA或PCR产物污染的风险；常规RT-PCR的检测时间一般6小时以上，本发明无需扩增后的电泳分析，样品检测时间在4小时之内。更重要的是实时荧光RT-PCR特别适用于保存时间长而无法进行分离病毒的大批量样品的检测。

4、与常规RT-PCR相比，实时荧光RT-PCR依靠仪器做出客观的估计，判断出阳性、阴性和可疑结果，Ct值为40.0可确定为阳性和阴性的临界值。

5、本试剂所组成的试剂盒可在收到样品后4小时之内作出定性检测结果。该实时荧光RT-PCR试剂盒是一种检测实际样品中BBrMV的特异、敏感和稳定的方法。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。

1、设计引物和探针

本发明选择BBrMV外壳蛋白编码基因的保守片段为靶目标，通过GenBank中报道的BBrMV各株系的CP编码基因序列进行同源性分析比较，选定BBrMV特征基因的保守片段(74bp)，应用primer Express 3.0软件，设计引物和探针。引物和探针的合成采用β-乙腈亚磷酸胺化学合成法，使用全自动DNA合成仪进行OligoDNA的合成探针，合成同时进行两端荧光标记，探针5′端标记的荧光报告基团是FAM，3′端标记的是不发荧光的淬灭基团Eclipse。将设计合成的多对引物和探针进行最佳配对筛选实验后，确定扩增效率和特异性最好的一对引物和一条探针。

2、RNA提取

取100μL体积的研磨匀浆样品上清液，加入700μL Trizol试剂，室温振荡充分混匀5min，加入200μL氯仿，充分颠倒混匀15sec，12000r/min(4℃)离心10min，小心吸取上清，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀后室温静置10min，12000r/min(4℃)离心10min，弃上清，沉淀用70％乙醇洗涤一次，干燥后溶于20μL经焦碳酸二乙酯(DEPC)处理过的双蒸水中。

3、BBrMV实时荧光RT-PCR扩增

BBrMV实时荧光RT-PCR采用25μL体积反应液，在ABI7000型实时荧光PCR仪中，按下列反应参数进行：42℃反转录5min，95℃预变性10sec；95℃变性5sec，60℃延伸31sec，扩增40个循环。

引物和探针的浓度进行精确筛选，以获得最低的Ct值和较高的荧光强度增加值(ΔRn)。每次检测时，设立阳性对照和阴性对照：阳性对照采用感染BBrMV的叶片，经Trizol试剂方法提取得到的含有BBrMV核酸的总RNA；阴性对照采用健康香蕉组织，经Trizol试剂方法提取得到的植物组织总RNA。每个样品检测做3管平行试验。在阴性对照为阴性、阳性对照为阳性时，整个试验有效，可进一步判断结果。每个样品须作多个备份，以进行稳定性、重复性试验。

4、BBrMV实时荧光RT-PCR的特异性和敏感性试验

采用马铃薯Y病毒(Potato virus Y，PVY)、李痘病毒(Plum pox virus，PPV)、小麦线条花叶病毒(Wheat streak mosaic virus，WSMV)、李属坏死环斑病毒(Prunus necroticringspot virus，PNRSV)、桃丛簇花叶病毒(Peach rosette mosaic virus，PRMV)以及健康香蕉组织进行特异性比较检测。对感染BBrMV的叶片样品，采用Trizol试剂方法提取得到含有BBrMV核酸的总RNA，用常规RT-PCR和实时荧光RT-PCR检测，比较它们的敏感性，常规RT-PCR采用的引物与实时荧光RT-PCR的引物一致。

5、BBrMV实时荧光RT-PCR的稳定性和重复性试验

在评估实时荧光RT-PCR检测BBrMV方法中的组内和组间试验的重现性、稳定性时，用阳性样品和阴性样品，在同样反应条件下，反复进行实时荧光RT-PCR检测，每次试验的每个样品做6个平行的反应管，重复12次。

6、引物和探针及其浓度的筛选

选择引物、探针、模板的最佳浓度配比，获得实时荧光RT-PCR反应的最低Ct值和最高ΔRn，提高扩增效率和敏感性。应用不同RNA模板浓度的标准阳性样品，对设计的引物与探针，选用50nM、100nM、200nM、300nM、400nM和500nM的使用终浓度，采用矩阵法优选引物和探针的最佳浓度。

7、对样品的检测

对进境香蕉样品、PVY、PPV、WSMV、PNRSV、PRMV以及健康香蕉组织进行实时荧光RT-PCR检测，结果表明，阳性样品均具有典型的扩增曲线，Ct值小于35.0，阴性对照及阴性样品均无典型扩增曲线，也无Ct值。三个平行试验的结果稳定一致。证明实时荧光RT-PCR检测BBrMV的特异性强、敏感度高和重复性好。

8、BBrMV实时荧光RT-PCR标准化试剂盒和检测程序

8.1按如下表配置标准化试剂盒组份(25μL反应×100次)：

  溶液I(Trizol)  35mL×2瓶  溶液II(2×一步RT-PCR缓冲液，含引物和探  针)  1.25mL  溶液III(Taq DNA聚合酶，5U/μL)  50μL  溶液IV(RNA酶抑制剂和逆转录酶混合液)  50μL  溶液V(DEPC处理水)  1.25mL×2支  阳性对照(含有BBrMV的植物组织冻干粉)  0.2克  阴性对照(不含有BBrMV的植物组织冻干粉)  0.2克

按照优化的反应条件配制。

8.2操作方法

8.2.1总RNA提取

(1)阳性对照、阴性对照与样品的总RNA提取过程一致。取0.1～10克组织样品，按1∶10(克：mL)加入蒸馏水，充分研磨匀浆，2000r/min，4℃，离心10min。

(2)取100μL上清液加入700μL溶液I，充分振荡混匀，室温静置5min，彻底裂解。

(3)加200μL氯仿，小心盖上帽盖，用力快速振荡15sec。12000r/min，4℃，离心10min。

(4)小心吸取上层水相，转移至一新的1.5mL管中，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀后室温静置10min。12000r/min，4℃，离心10min，弃上清液。

(5)沉淀用70％乙醇洗涤一次，晾干后，溶于20μL经焦碳酸二乙酯(DEPC)处理过的双蒸水中。可直接用于扩增或-70℃保存备用。

8.2.2反应组份配制

(1)取一支200μL光学PCR反应管，反应总体积为25μL，向反应管中加入下列表中的反应物：

  组分  检测管  溶液II  12.5μL  溶液III  0.5μL  溶液IV  0.5μL  样品RNA  0.5μL  溶液V  11μL  总体积  25μL

(2)设立对照

阳性对照和阴性对照各设2管。

8.2.3扩增

在ABI7000型实时荧光PCR仪中，按下列反应参数进行：42℃反转录5min，95℃预变性10sec；95℃变性5sec，60℃延伸31sec，扩增40个循环。

8.2.4结果分析和判定

(1)结果分析条件设定

阈值线设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。

(2)质控标准

——阴性对照无Ct值，并且无典型扩增曲线。

——阳性对照的Ct值应小于35.0，并出现典型的扩增曲线，2个阳性对照扩增曲线基本重合，特别是在荧光临界值(Ct值)附近。否则，此次实验视为无效。

(3)结果描述及判定

——阴性

无Ct值或无扩增曲线，表示样品中无香蕉苞片花叶病毒。

——阳性

Ct值应小于等于35.0，且出现典型的扩增曲线，表示样品中存在香蕉苞片花叶病毒。

——有效原则

Ct值在35.0～40.0的样本建议重做。重做结果无Ct值或无典型扩增曲线判为阴性，否则判为阳性。

序列表

<110>宁波检验检疫科学技术研究院

<120>香蕉苞片花叶病毒实时荧光RT-PCR检测试剂及制备方法和应用

<160>4

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于检测香蕉苞片花叶病毒的特异性荧光探针序列

<400>1

5′-FAM-cacacacgca gatgaaagct gcagc-Eclipse-3′25

<210>2

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于检测香蕉苞片花叶病毒的特异性引物BBrMV TF序列

<400>2

5′-caaaaactac gaacagggct agaga-3′25

<210>3

<211>20

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于检测香蕉苞片花叶病毒的特异性引物BBrMV TR序列

<400>3

5′-ccgagtgttt gatccacgaa-3′20

<210>4

<211>74

<212>RNA

<213>香蕉苞片花叶病毒的保守片段

<400>4

caaaaactac gaacagggct agagaagcac acacgcagat gaaagctgca  50

gctattcgtg gatcaaacac tcgg                              74