鉴别中国地方猪抗F4ac仔猪腹泻的分子标记及选育应用

摘要

本发明公开了一种鉴别中国地方猪种新生和断奶仔猪F4ac腹泻易感性/抗性的分子标记及其在中国地方猪种种猪遗传改良中的应用，它通过克隆得到如序列表中所示的DNA片段，并在该序列的第183bp处鉴别到一个单核苷酸多态性(SNP)A183G，再采用SNaPshot方法对SNPA183G进行基因分型。本发明还公开了获得上述分子标记及相关引物的制备方法以及利用本发明克隆的分子标记进行中国地方猪腹泻性状关联分析的方法。本发明通过现代分子生物学技术检测该多态位点，利用标记辅助选择(MAS)选择有利的基因型个体留种，可以显著提高中国地方猪种种群断奶仔猪的抗腹泻病能力，大大减少仔猪死亡率。

说明书

技术领域

本发明涉及动物分子生物学技术及育种领域，尤其是涉及一个鉴别中国地方猪种新生和断奶仔猪F4ac腹泻易感性/抗性的分子标记及其在中国地方猪种猪遗传改良选育中的应用。

背景技术

仔猪腹泻是养猪生产中的常见传染病，给世界养猪业造成了巨大经济损失。丹麦养猪业大规模的场间调查表明：6％-7％的新生仔猪患有腹泻病，使断奶前仔猪的死亡率达2.7％，占此期间整个死亡率的11.9％。即使是病愈个体，也会严重影响生长发育，有的形成僵猪，导致饲养成本增加，销售收入下降。

产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC)F4是引发新生和断奶前仔猪腹泻病的最主要致病菌，以我国和丹麦为例，分别有约35％和40％的仔猪腹泻病是因ETEC F4侵染而引起的。在我国，其致死率在10％-30％之间，在个别地方甚至比这个比例更高。

ETEC F4根据免疫学特征分为ab，ac和ad三种亚型，其中F4ac是最主要的致病原，在美国、西班牙和韩国，ETEC仔猪腹泻病例中只分离到F4ac亚型。ETEC F4入侵猪肠道后，通过其特异性黏附素附着于小肠上皮细胞表面的受体，大量繁殖产生肠毒素，致使肠上皮细胞分泌功能亢进，大量水和电解质进入肠腔，造成肠腔中大量液体积蓄，超过了肠壁重吸收能力而引起腹泻。由此可见，仔猪小肠上皮细胞有无ETEC F4受体，特别是有无F4ac受体是仔猪被ETEC F4感染时是否发病的关键。无受体猪表现为抵抗型，有受体猪则表现为易感型。分离和鉴别猪ETEC F4ac受体基因及其抗性位点因而成为猪ETEC F4ac腹泻抗病育种的关键。

1995年，瑞典LeifAndersson小组利用欧洲野猪×大白猪资源家系群体为材料，经过三代系谱的连锁分析，首次将ETEC F4ac受体定位于13号染色体，与Tf基因紧密连锁。2002年，瑞士Peter Vogeli小组以大白猪和大白×长白三代家系为材料，利用13号染色体更多的微卫星标记信息，将F4ac受体进一步定位于S0068和Sw1030之间，与其中的S0075和Sw225高度连锁(θ＝0.00)。这一结果在一年后瑞典LeifAndersson小组和丹麦小组联合开展的基因定位研究中得到了验证，他们还利用FISH和辐射杂种细胞克隆板技术揭示F4ac受体位于13号染色体q41区(SSC13q41)，分别与人3号染色体的q28-29和q21区同源。最近，Joller等通过精细定位进一步将ETEC F4ac受体基因定位于q41区域SW207与S0283之间。本研究小组通过利用大规模白色杜洛克×二花脸资源家系群体在13号染色体上采用高密度微卫星标记将F4ac受体基因精细定位于S0283邻近区域。

此外，Grange等对F4受体的性质做了一系列详细的研究，在猪小肠上皮细胞分离到两种粘液型唾液酸糖蛋白(Intestine mucus glycoprotein，IMTGP)，分子量分别为210kDa(IMTGP-1)和240kDa(IMTGP-2)，这两种蛋白被认为是猪对F4ac易感性和抗性重要的决定因子。而研究表明表达粘液素蛋白的MUC4基因位于猪13号染色体S0283邻近区域，结合其生理生化功能分析，认为MUC4基因极有可能是肠毒素大肠杆菌F4ac受体的一个重要候选基因。

鉴于以上背景情况，申请人深入开展了猪MUC4基因及其邻近区域多态性的搜寻、鉴别及其影响仔猪ETEC F4ac腹泻病性状的研究，以期建立标记辅助选择技术开展断奶仔猪腹泻病的抗病育种工作。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一个鉴别中国地方猪种断奶仔猪F4ac腹泻易感性/抗性的分子标记，通过现代分子生物学技术检测该多态位点，利用标记辅助选择(MAS)选择有利的基因型个体留种，可以显著提高中国地方猪种种群断奶仔猪的抗腹泻病能力，大大减少仔猪死亡率。

本发明的第二个目的是该分子标记在选育改良中国地方猪种种猪抗腹泻病性状中的应用。

本发明的第一个目的是这样实现的：

(1)MUC4基因邻近区域大规模多态位点(SNP)搜寻：

自ENSEMBLE网站(http://www.ensembl.org/index.html)上搜寻到微卫星标记S0283在猪13号染色体位置为94，369，614bp-94，369，755bp。以S0283为中心，前后延伸5Mb，即以chromosome 13：89，369，614bp-99，369，755bp为查询号，提交到ENSEMBLE网站上，下载得到猪13号染色体S0283附近10Mb的DNA序列。同时自NCBI网站(National Center forBiotechnology Information，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下载到29369bp的猪MUC4基因的部分DNA序列(序列号：DQ848681)。用该29369bp序列锚定下载的SSC13序列，前后再分别延伸约50kb，则得到一段130kb的DNA序列，囊括了猪MUC4基因的全部DNA序列。

选取白色杜洛克和二花脸8个ETEC F4ac黏附表型极端的个体，其中4个为强黏附型，4个为不黏附型。在已获得的130kb的DNA片段中共设计34对引物，其中MUC4基因外的侧翼序列每5kb设计一对引物，MUC4基因内每2kb设计一对引物，均对以上8个个体进行PCR扩增，采用比较测序法鉴别多态性位点，以大规模搜寻单核苷酸多态标记(SNPs)。

在130kb范围内共鉴别到了104个SNPs。选择其中分布均匀和具有代表性的70个多态位点，在12个中国地方猪种的148头远缘群体中进行基因分型，有64个SNP位点成功分型。随后利用分型成功的基因型数据开展大规模SNP位点多态性与ETEC F4ac黏附表型之间的单点和多点关联性分析。关联性分析结果表明，MUC4基因邻近区域的SNP A183G位点多态性与中国地方猪ETEC F4ac黏附表型关联性最显著(P＝2.68E-12)。

(2)SNP A183G的具体鉴别过程：

利用上述来自ENSEMBLE网站(http://www.ensembl.org/index.html)的囊括了猪MUC4基因的一段130kb的DNA序列，使用公用的Primer 5.0软件设计引物F1和R1(F1：5‘-G CTT AGA CAG TGA GAC ATC AACATC-3’和R1：5’-AAT TAC AGG TGA CAC GCT TCC-3’)扩增猪基因组DNA(脱氧核糖核酸)。25μl的聚合酶链式反应(PCR)反应体系中，包括25ng猪基因组DNA，1.0mM MgCl₂，100mM dNTP(合成DNA的四种脱氧核苷酸底物)，正反向引物各10pmol，2单位DNA聚合酶(Taq酶)及1×PCR buffer(缓冲液)(上海生物工程公司，中国)。扩增条件为：94℃ 4min；94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 60s，共34个循环；最后在72℃延伸10min。扩增片段采用QIAquickPCR产物纯化试剂盒(QIAGEN，德国)纯化，由华大基因上海测序中心测序。采用美国国家生物技术信息中心(NCBI，National Center for Biotechnology Information，http://www.ncbi.nlm.nih.gov)网站公用的BLAST软件，将测序后获得的DNA序列与上述130kb的DNA序列进行同源性比较，结果显示该序列与已公布序列同源性在99％以上，由此说明此段序列为目的序列。然后选取8个ETEC F4ac黏附表型极端个体，其中4个为强黏附型，4个为不黏附型。采用上述引物F1和R1对以上8个个体进行PCR扩增，采用比较测序法测序，使用公用的DNAStar软件包中的SeqMan软件分析测序结果时，发现在该序列的第183个核苷酸处存在一个单核苷酸多态位点(SNPs)，即SNP A183G位点。

(2)位于猪13号染色体MUC4基因邻近区域、包含183bp处突变位点(SNPA183G)的部分基因序列如下：

tgttagaaag tccttgggct ttaacccaaa taacactgct gtaactttaa aggggacttt     60

tttttattca gaattatgaa tagatttgtt tctaggactc taagtcctat acctgctccc    120

tcctcagtaa agttcataaa cttcgtttct ctagctaagg tttagattgg aagacataca    180

ccrtgaaatt attattaagc ttatttcctc ttcctaagaa cataaataaa agcaacgctc    240

tgtcttctgg ctttgagtca ccagatagaa gctagttaca tgccaaactt actaataaac    300

ttattataga ttcttggcaa ttaatatact tttggagcct gcatcacctc tgttaaaatc    360

aatattagca gcaaaagttt catgattgca cagtccaagt tttttaaagt aaagatttgt    420

atttgtttgt tcataaaagt agtacagctc tactcccagc aatatggcag aagagacaaa    480

cctttaacta gagaacatgc aaatgccaga taatgtgtaa taaatatttt ctgaatgctg    540

agctgagatc cgaagaaaga aagggagacg ctcaggagtg aaggagttga aaactaagat    600

gataagtaag tgctctcata caatttggag atttctgaga tctagagttt ggcattttaa    660

tggctgcatg gagaaaggaa acaatcttag atcaggacac tgtagactga atattttctg    720

cataaagctg gaaacctcag tgaaaaggtg gtctagaaaa atcaaaaaga aaaaagaaaa    780

aggaggagtt ccctggtggc tcagtgggtt aaggatccag cgttttcact gctggggctc    840

tggttactgc tgag

(3)SNP A183G的基因分型：

使用SNaPshot试剂盒(ABI公司，美国)开展基因分型。方法如下：

1)引物设计

设计引物对F2和R2(F2：5’-ACG TTG GAT GCT TAG GAA GAGGAAATAAGC-3’和R2：5’-ACG TTG GAT GCT TCG TTT CTC TAG CTAAGG-3’)扩增包含要检测SNP A183G位点的DNA片段以及一条SNaPshot延伸引物(5’-A AAA AAA AAA AAA GGA AAT AAG CTT AATAAT AAT TTC-3’)。

2)PCR扩增条件及产物纯化

使用上述引物对F2和R2扩增猪基因组DNA。25μl的PCR反应体系中，包括25ng猪基因组DNA，1.0mM MgCl₂，100mM dNTP，正反向引物各10pmol，2单位Taq酶及1×PCR buffer(上海生物工程公司，中国)。扩增条件为：94℃ 4min；94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 30s，共35个循环；最后在72℃延伸10min。PCR产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测并拍照。取3μl PCR产物，加入1μl ExoSAP-IT酶(上海国药集团公司，中国)37℃孵育15min，然后80℃处理15min灭活酶。PCR产物纯化后稀释4倍备用。

3)SNaPshot反应及产物纯化

SNaPshot反应体系为：SNaPshot反应混合物(Multiplex Ready ReactionMix)2μl；SNaPshot延伸引物0.5μl(引物终浓度为0.2μmol/L)；上述纯化稀释PCR产物1.5μl；去离子水1μl。SNaPshot循环参数为96℃ 10s，50℃5s，60℃ 30s，共25循环。取5μl SNaPshot反应产物加入0.57μl 10×buffer和0.1μl CIP(SNaPshot反应产物纯化酶)在37℃下孵育1h，然后75℃处理15min灭活酶达到产物纯化效果，-20℃保存备用。

4)3130XL遗传分析仪电泳：

电泳混合体系包括：9.25μl Hi-Di formamide(甲酰胺变性剂)；0.5μl上述经纯化后的SNaPshot反应产物；0.25μl GeneScan 120LIZ size standard(电泳分子内标)。体系混合后于95℃变性5min然后立即置于冰上处理2min。离心上样。

具体判型方法如附图2所示。

本发明的第二个目的是这样实现的：本发明利用这个多态位点及侧翼DNA序列信息，采用分子生物学技术鉴别个体基因型，针对抗腹泻病性状选育中国地方猪种种猪。

本发明鉴别了一个影响中国地方猪种断奶仔猪抗腹泻病性状的单核苷酸多态性(SNP)位点，通过现代分子生物学技术检测该多态位点，利用标记辅助选择(MAS)选择有利的基因型个体留种，可以显著提高中国地方猪种种群断奶仔猪的抗腹泻病能力，大大减少仔猪死亡率。

附图说明

图1为本发明鉴别的猪SNP A183G突变位点的序列峰图；

图2为SNP A183G位点的SNaPshot判型图，其中a为GG型；b为AG型；c为AA型；

图3为ETEC F4ac与刷状缘的黏附检测结果，(a)为不黏附型，(b)为黏附型。

具体实施方式

下面结合实施例并对照附图对本发明作进一步详细说明。

选择中国地方猪种种猪核心群个体，利用上述的SNaPshot方法鉴别猪13号染色体MUC4基因邻近区域SNP A183G位点的基因型，选择有利的基因型个体(AA型)留种，群体继代选育后改良中国地方猪种种群的抗仔猪腹泻病性能。

实施例：

利用148头代表我国6个生态类型(包括华北、华南、华中、江海、西南、高原型等)的12个地方猪种纯种仔猪作为实验动物，每个猪种选取至少3个父系家系，每个家系选择3-4个1-2月龄个体；148头纯种仔猪屠宰后，取小肠空肠部分，提取小肠上皮细胞刷状缘，利用E.coli F4ac菌株黏附猪小肠上皮细胞刷状缘，通过相差显微镜检测细菌的黏附结果。每个样品检测20个以上的刷状缘，若有10％以上的刷状缘上至少有2个细菌黏附，判该样品为黏附型，若至少有2个细菌黏附的刷状缘不到10％，但有1-2个细菌黏附的刷状缘多于10％，判该样品为弱黏附型，否则判为不黏附型。黏附效果图如附图3所示。

使用上述SNaPshot方法对148头纯种仔猪进行SNP A183G基因型判定，采用SHE在线公用软件分析这个SNP位点多态性与实验猪只ETEC F4ac黏附表型性状之间的关联性(见表1)。结果表明SNP A183G多态性与ETECF4ac的侵染易感性呈极显著相关(P＝2.68E-12；LogP＝11.57)，G等位基因为易感基因，A等位基因为抗性基因；基因型GG和AG个体对ETEC F4ac的侵染易感，AA型个体对ETEC F4ac的侵染具有抵抗性(表2)。AA型个体是抗腹泻病型猪的选育改良所需的基因型个体。在商业种猪核心群中，继代选育AA型个体，可以进一步改良中国地方猪种种群的抗腹泻病性状，减少仔猪的死亡率。

表1SNP A183G多态性与ETEC F4ac黏附表型的关联分析

表2SNP A183G位点在实验猪群体中的基因型和ETEC F4ac黏附表型分布