一种耐热角质酶－CBD的制备及其在棉纤维精练中的应用

摘要

一种耐热角质酶－CBD的制备及其在棉纤维精练中的应用，属于酶基因工程领域。本发明以pET20b－Tfu_0883质粒DNA及嗜热子囊菌WSH03－11总DNA为模板，设计引物分别PCR得到编码角质酶Tfu_0883基因和纤维素酶Tfu_1074中CBD基因，再通过重叠PCR获得编码角质酶－纤维素结合域(cellulose－bindingdomain，CBD)的融合基因，简写为耐热角质酶－CBD；以pET20b(+)为表达载体，以E.coli BL21(DE3)为表达宿主，实现了耐热角质酶－CBD基因的高效表达。该融合酶具有角质酶活性，最适温度为50℃，最适pH 8，在50℃下保温50h，酶活仍可达50％以上。角质酶－CBD对棉纤维的吸附率为50％，6h达到反应平衡，生成180μmol脂肪酸。此融合酶非常适合在棉纤维精练中的应用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种耐热角质酶-CBD基因的制备，及其在棉纤维精练中的应用，属于酶基因工程和酶工程领域。

背景技术

在棉织物精练过程中，为了使棉纤维获得优良的润湿性和白度，需要去除严重影响棉织物外观、服用性能和染整加工的角质、棉蜡、果胶质和蛋白质等各种伴生物。目前国内一直采用传统的强碱高温处理方法，它存在许多不足之处，流程复杂冗长，设备庞大、纤维损伤大，水耗和能耗大，产生大量污水，对生态环境极为不利等。随着社会对纺织品和环境的环保问题日益重视，酶用于纺织中，易于生物降解，不会污染环境与纺织品。用酶对棉织物进行前处理是国内外公认的21世纪的环保型染整技术。今后对纺织专用酶制剂的需求必将逐渐增大，推广应用前景广阔。

角质酶可分解棉纤维表面的角质，并将附着的脂质等杂质一同从棉纤维表面除去，同时对棉籽壳也有一定的降解作用，可提高原棉的润湿性；与果胶裂解酶具有较好的协同效应，能更好地去除角质层、果胶层，保证织物的良好纺织性能；与其他纺织酶制剂复合使用可实现纺织的绿色加工。角质酶在纺织行业具有较强的应用潜力。

纤维素结合域(cellulose-binding domain，CBD)在结构上和功能上都是纤维素酶独立的结构域，能够提高底物在酶周边的浓度或破坏底物多糖结构进而增强了酶催化能力。CBD作为最普遍的结构组成已有大量数据显示与酶和纤维素的有效结合密切相关，尤其对结晶纤维素的降解是必须的。CBD对于提高酶与纤维的可及度，增强纤维素酶解效率，揭示纤维素酶解过程具有重要意义。将CBD与精练用酶(如角质酶)融合可以增加酶对棉纤维的结合能力，从而更好地水解棉纤维表面杂质，这种提高角质酶催化效率的分子改造策略目前国内外未见报道。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种耐热的角质酶-CBD，其具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

本发明的另一个目的是提供一种编码本发明的耐热角质酶-CBD的DNA分子，所述的DNA分子具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

本发明的再一个目的是提供包含本发明基因的表达载体。

本发明的又一个目的是提供包含本发明表达载体的宿主细胞。

本发明的技术方案：一种耐热角质酶-纤维素结合域融合酶，缩写为耐热角质酶-CBD，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

所述的耐热角质酶-CBD的基因，它具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

所述的耐热角质酶-CBD基因的表达方法：以pET20b-Tfu_0883质粒DNA及嗜热子囊菌(Thermobifida fusca)WSH03-11总DNA为模板，设计引物分别PCR得到编码角质酶Tfu_0883的基因及纤维素酶Tfu_1074中CBD的基因，再通过重叠PCR获得编码角质酶-CBD的融合基因SEQ ID NO：1。角质酶-CBD基因以质粒pET20b(+)为表达载体，以E.coli BL21(DE3)为表达宿主，实现耐热角质酶-CBD基因的高效表达；

(1)Thermobifida fusca WSH03-11总DNA的提取：

Thermobifida fusca WSH03-11菌株(该菌株巳在【化工进展】2006年第25卷第5期公开)，在LB液体培养基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L)中50℃培养2天，取3mL菌液12000rpm离心收集菌体，按照北京博大泰克细菌基因组DNA提取试剂盒方法提取Thermobifida fusca WSH03-11总DNA；

(2)耐热角质酶-CBD编码基因的克隆：

根据NCBI上登录的Tfu_0883及Tfu_1074的基因序列分别设计两对引物P1、P2和P3、P4。下划线为酶切位点NcoI和EcoRI，

P1：5’-GGAATACCATATGTCCATGGCCAACCCCTACGAGCGCGG-3’

P2：5’-CGCGGCGATCGCCATGAACGGGCAGGTGGA-3’

P3：5’-TCCACCTGCCCGTTCATGGCGATCGCCGCG-3’

P4：5’-CATCTCGAGAGAATTCGGGCAGGTAAGGGTCGGAACAG-3’

以pET20b-Tfu_0883质粒DNA为模板，以P1、P2为引物，PCR扩增角质酶的基因。以Thermobifida fusca WSH03-11总DNA为模版，以P3、P4为引物，PCR扩增纤维素酶CBD的基因。PCR反应在50μL体系(参照TaKaRa Ex Taq^TM试剂盒)中进行，反应条件为在95℃变性5min后开始循环，然后95℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1.5min，共35个循环后，再于72℃延伸10min。分别扩增得到780bp及381bp的PCR片段，割胶回收。然后再以角质酶基因与CBD基因PCR割胶回收片断为模板，以P1、P4为引物，再进行PCR反应。扩增得到1161bp的PCR片段，割胶回收。回收片段与pMD18-T simple载体连接，连接产物转化大肠杆菌JM109，转化产物涂布含100mg/L氨苄青霉素的LB平板。经37℃培养过夜，挑选菌落，接入LB液体培养基，8～10h后提取质粒，命名为Tfu_0883-CBD/pMD18-T simple，将此质粒进行序列测定。

(3)耐热角质酶-CBD基因在大肠杆菌表达载体上的构建程序：

用于构建大肠杆菌表达载体的质粒是pET20b(+)，带有pelB信号肽和His-tag标记。将pET20b(+)质粒与耐热角质酶-CBD基因进行Nco I和EcoR1双酶切，酶切产物割胶回收后，再用T4连接酶16℃连接过夜，连接产物转化E.coli JM109感受态细胞，经37℃培养过夜，挑选转化子在100mg/L氨苄青霉素LB液体培养基中进行液体培养，然后提取质粒，得富集的Tfu_0883-CBD/pET20b(+)质粒。

(4)大肠杆菌宿主转化和筛选重组菌：

将质粒Tfu_0883-CBD/pET20b(+)转化E.coli BL21(DE3)宿主菌，再在含氨苄青霉素(100mg/L)的LB平板上经37℃培养过夜，挑选转化子(重组菌Tfu_0883-CBD/pET20b(+)/E.coli BL21(DE3))在LB培养基中37℃液体培养过夜，后接入TB(甘油5g/L，蛋白胨12g/L，酵母膏24g/L，K₂HPO₄ 12.54g/L，KH₂PO₄ 2.31g/L)发酵液体培养基25℃培养48h时产酶达40U/mL。

(5)耐热角质酶-CBD的纯化：

将步骤(4)所得耐热角质酶-CBD发酵液于4℃、10000rpm离心30min除菌体；上清液中加入70％固体硫酸铵盐析过夜，4℃、10000rpm离心30min，沉淀用缓冲液A(含20mM磷酸钠、0.5M氯化钠、20mM咪唑，pH 7.4)溶解，并在缓冲液A中透析过夜后，通过0.22μm膜过滤后制成上样样品；Ni亲和柱用缓冲液A平衡后，将上样样品吸入Ni柱，使之完全吸附后，用缓冲液(含20mM磷酸钠、0.5M氯化钠、0-500mM咪唑，pH 7.4)线性梯度洗脱，流速1mL/min，检测波长为280nm，分部收集含角质酶酶活的洗脱液；活力组分用30000道尔顿膜离心浓缩，得纯化耐热角质酶-CBD酶制品；纯化后耐热角质酶-CBD达到电泳纯，表观分子量45000道尔顿。纯化过程电泳图见图1。

所述耐热角质酶-CBD的应用，用于棉纤维的精练；耐热角质酶-CBD具有角质酶活性，最适温度为50℃，最适pH 8，在50℃下保温50h，酶活仍达50％以上，耐热角质酶-CBD对棉纤维的吸附率为50％，6h达到反应平衡，生成180μmol脂肪酸。

(1)耐热角质酶-CBD对棉纤维的吸附效果：

10mL反应体系中，分别加入1mL耐热角质酶-CBD(或天然角质酶)的酶液(酶活力100U/mL)，1mL果胶酶液(酶活力100U/mL)，8mL 25mM磷酸钾(pH8.0)，0.5g原棉纤维和50μL渗透剂TX-10。对照样与上述条件一致但处理液中不加棉纤维。室温反应，定时取样。取出的样液经离心3min后按照测定酶活的方法测上清液中酶活。被吸附的酶量为对照溶液中的酶活减去上清液中的酶活。

(2)耐热角质酶-CBD对棉纤维的精练效果：

10mL反应体系包括0.5g原棉纤维、8mL 25mM磷酸钾缓冲液(pH 8.0)、1mL耐热角质酶-CBD(或天然角质酶)酶液(酶活力100U/mL)，1mL果胶酶液(酶活力100U/mL)和50μL渗透剂TX-10，在50℃保温。不同时间取样，用0.02mol/LNaOH溶液滴定生成的脂肪酸。

本发明的有益效果：本发明提供了耐热角质酶-CBD基因的高效表达方法。以pET20b-Tfu_0883质粒DNA及Thermobifida fusca WSH03-11总DNA为模板，设计引物分别PCR得到编码角质酶Tfu_0883基因与纤维素酶Tfu_1074中CBD的基因，再通过重叠PCR获得编码角质酶-纤维素结合域(CBD)的融合基因，它具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，该基因全长1161个核苷酸，编码387个氨基酸。以pET20b(+)为表达载体，以E.coli BL21(DE3)为表达宿主，实现了耐热角质酶-CBD基因的高效表达。该耐热角质酶-CBD具有角质酶活性，最适温度为50℃，最适pH 8，在50℃下保温50h，酶活仍可达50％以上。在与果胶酶协同作用下，天然角质酶对棉纤维的吸附率为10％，15h达到反应平衡，生成160μmol脂肪酸；耐热角质酶-CBD对棉纤维的吸附率为50％，6h达到反应平衡，生成180μmol脂肪酸；此融合酶非常适合在棉纤维精练中的应用。

附图说明

图1耐热角质酶-CBD分离纯化SDS-PAGE图谱。

1、发酵上清液；2、硫酸铵盐析后样品；3、通过Ni柱纯化后样品；4、标准蛋白分子量。

图2耐热角质酶-CBD最适温度(对硝基苯丁酸酯pNPB为底物)。

图3耐热角质酶-CBD最适pH(对硝基苯丁酸酯pNPB为底物)。

pH 6-7，使用磷酸钾缓冲液；pH 7-9，使用Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷-盐酸)缓冲液。

图4耐热角质酶-CBD 50℃稳定性研究(对硝基苯丁酸酯pNPB为底物)。

具体实施方式

实施例1：本实施例说明Thermobifida fusca WSH03-11总DNA的提取。

Thermobifida fusca WSH03-11菌株在LB液体培养基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L)中50℃培养2天，取3mL菌液12000rpm离心收集菌体，按北京博大泰克细菌基因组DNA提取试剂盒方法提取WSH03-11总DNA；

实施例2：本实施例说明耐热角质酶-CBD编码基因的克隆程序。

根据NCBI上登录的Tfu_0883和Tfu_1074的基因序列分别设计两对引物P1、P2和P3、P4。下划线为酶切位点Nco I和EcoR I，

P1：5’-GGAATACCATATGTCCATGGCCAACCCCTACGAGCGCGG-3’

P2：5’-CGCGGCGATCGCCATGAACGGGCAGGTGGA-3’

P3：5’-TCCACCTGCCCGTTCATGGCGATCGCCGCG-3’

P4：5’-CATCTCGAGAGAATTCGGGCAGGTAAGGGTCGGAACAG-3’

以pET20b-Tfu_0883质粒DNA为模板，以P1、P2为引物，PCR扩增角质酶的基因。以Thermobifida fusca WSH03-11总DNA为模版，以P3、P4为引物，PCR扩增纤维素酶CBD的基因。PCR反应在50μL体系(参照TaKaRa Ex Taq^TM试剂盒)中进行，反应条件为在95℃变性5min后开始循环，然后95℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1.5min，共35个循环后，再于72℃延伸10min。分别扩增得到780bp与381bp的PCR片段，割胶回收。然后再以角质酶基因与CBD基因PCR割胶回收片断为模板，以P1、P4为引物，再进行PCR反应。扩增得到1161bp的PCR片段，割胶回收。回收片段与pMD18-T simple载体连接，连接产物转化大肠杆菌JM109，转化产物涂布含100mg/L氨苄青霉素的LB平板。经37℃培养过夜，挑选菌落，接入LB液体培养基，8～10h后提取质粒，将此质粒进行序列测定。结果表明插入片段含有一个长1161bp的开放阅读框(ORF)，编码一个由387个氨基酸编码的蛋白质。

实施例3：本实施例说明耐热角质酶-CBD基因在大肠杆菌表达载体上的构建程序。

用于构建大肠杆菌表达载体的质粒是pET20b(+)，带有pelB信号肽和His-tag标记。将pET20b(+)质粒和角质酶-CBD基因进行Nco I和EcoR1双酶切，酶切产物割胶回收后，再用T4连接酶16℃连接过夜，连接产物转化E.coli JM109感受态细胞，经37℃培养过夜，挑选转化子100mg/L氨苄青霉素LB进行液体培养，然后抽提质粒，得到富集的Tfu_0883-CBD/pET20b(+)质粒。

实施例4：本实施例说明大肠杆菌宿主转化和筛选重组菌的程序。

将质粒Tfu_0883-CBD/pET20b(+)转化E.coli BL21(DE3)宿主菌，再在含氨苄青霉素(100mg/L)的LB平板上经37℃培养过夜，挑选转化子(重组菌Tfu_0883-CBD/pET20b(+)/E.coli BL21(DE3))在LB培养基中37℃液体培养过夜，后接入TB(甘油5g/L，蛋白胨12g/L，酵母膏24g/L，K₂HPO₄ 12.54g/L，KH₂PO₄ 2.31g/L)发酵液体培养基25℃培养48h时产酶达40U/mL。

实施例5：本实施例说明角质酶-CBD的纯化和特性。

将上述耐热角质酶-CBD发酵液于4℃、10000rpm离心30min除菌体；上清液中加入70％固体硫酸铵盐析过夜，4℃、10000rpm离心30min，沉淀用缓冲液A(含20mM磷酸钠、0.5M氯化钠、20mM咪唑，pH 7.4)溶解，并在缓冲液A中透析过夜后，通过0.22μm膜过滤后制成上样样品；Ni亲和柱用缓冲液A平衡后，将上样样品吸入Ni柱，使之完全吸附后，用缓冲液(含20mM磷酸钠、0.5M氯化钠、0-500mM咪唑，pH 7.4)线性梯度洗脱，流速1mL/min，检测波长为280nm，分部收集含角质酶酶活的洗脱液；活力组分用30000道尔顿膜离心浓缩，得纯化耐热角质酶-CBD酶制品；纯化后耐热角质酶-CBD达到电泳纯，表观分子量45000道尔顿。纯化过程电泳图见图1。

将耐热角质酶-CBD进行底物水解试验，发现它可水解角质、甘油三酯和可溶性酯(对硝基苯丁酸酯pNPB)，结果表明耐热角质酶-CBD基因实现高效表达。

以可溶性酯对硝基苯丁酸酯(pNPB)为底物时，耐热角质酶-CBD的最适温度为50℃(图2)，最适pH 8(图3)，在50℃下保温50h，酶活仍可达50％以上(图4)。

实施例6：本实施例说明耐热角质酶-CBD对棉纤维的吸附效果测定。

在10mL反应体系中，分别加入1mL角质酶-CBD(或天然角质酶)的酶液(酶活力100U/mL)，1mL果胶酶液(酶活力100U/mL)，8mL 25mM磷酸钾(pH8.0)，0.5g原棉纤维和50μL渗透剂TX-10。对照与上述条件一致但处理液中不加棉纤维。在室温下反应，定时取样。取出的样品经离心3min后按照测定酶活的方法测上清液中酶活。被吸附的酶量为对照溶液中的酶活减去上清液中的酶活。结果表明，在与果胶酶互作下，天然角质酶对棉纤维的吸附率为10％，而耐热角质酶-CBD对棉纤维的吸附率为50％。

实施例7：本实施例说明耐热角质酶-CBD对棉纤维的精练效果测定。

10mL反应体系包括0.5g原棉纤维、8mL 25mM磷酸钾缓冲液(pH 8.0)、1mL角质酶-CBD(或天然角质酶)酶液(酶活力100U/mL)，1mL果胶酶液(酶活力100U/mL)和50μL渗透剂TX-10，在50℃保温。不同时间取样，用0.02mol/LNaOH溶液滴定生成的脂肪酸。结果显示，天然角质酶15h达到反应平衡，生产脂肪酸为160μmol；耐热角质酶-CBD 6h达到反应平衡时，生成脂肪酸为180μmol。此融合酶非常适合在棉纤维精练中的应用。

序列表

<210>SEQ ID NO：1

<211>1161

<212>DNA

<213>耐热角质酶-纤维素结合域融合酶

<400>1

gccaacccct acgagcgcgg ccccaacccg accgacgccc tgttcgaagc cagcagcggc    60

cccttctccg tcagcgagga gaacgtctcc cggttgagcg ccagcggctt cggcggcggc    120

accatctact acccgcggga gaacaacacc tacggtgcgg tggcgatctc ccccggctac    180

accggcactg aggcttccat cgcctggctg ggcgagcgca tcgcctccca cggcttcgtc    240

gtcatcacca tcgacaccat caccaccctc gaccagccgg acagccgggc agagcagctc    300

aacgccgcgc tgaaccacat gatcaaccgg gcgtcctcca cggtgcgcag ccggatcgac    360

agcagccgac tggcggtcat gggccactca atgggcggcg gcggcaccct gcgtctggcc    420

tcccagcgtc ccgacctgaa ggccgccatc ccgctcaccc cgtggcacct caacaagaac    480

tggagcagcg tcaccgtgcc gacgctgatc atcggggccg acctcgacac gatcgcgccg    540

gtcgccacgc acgcgaaacc gttctacaac agcctgccga gctccatcag caaggcctac    600

ctggagctgg acggcgcaac ccacttcgcc ccgaacatcc ccaacaagat catcggcaag    660

tacagtgtcg cctggctcaa gcggttcgtc gacaacgaca cccgctacac ccagttcctc    720

tgccccggac cgcgcgacgg actcttcggc gaggtcgaag agtaccgctc cacctgcccg    780

ttcatggcga tcgccgcggg cggcaccaac cccaacccga accccaaccc gacgcccacc    840

cccactccga cccccacgcc gcctcccggc tcctcggggg cgtgcacggc gacgtacacg    900

atcgccaacg agtggaacga cggcttccag gcgaccgtga cggtcaccgc gaaccagaac    960

atcaccggct ggaccgtgac gtggaccttc accgacggcc agaccatcac caacgcctgg    1020

aacgccgacg tgtccaccag cggctcctcg gtgaccgcgc ggaacgtcgg ccacaacgga    1080

acgctctccc agggagcctc cacagagttc ggcttcgtcg gctctaaggg caactccaac    1140

tctgttccga cccttacctg c                                              1161

<210>SEQ ID NO：2

<211>387

<212>PRT

<213>耐热角质酶-纤维素结合域融合酶

<400>2

Ala Asn Pro Tyr Glu Arg Gly Pro Asn Pro Thr Asp Ala Leu Phe

                 5                  10                  15

Glu Ala Ser Ser Gly Pro Phe Ser Val Ser Glu Glu Asn Val Ser

                20                  25                  30

Arg Leu Ser Ala Ser Gly Phe Gly Gly Gly Thr Ile Tyr Tyr Pro

                35                  40                  45

Arg Glu Asn Asn Thr Tyr Gly Ala Val Ala Ile Ser Pro Gly Tyr

                50                  55                  60

Thr Gly Thr Glu Ala Ser Ile Ala Trp Leu Gly Glu Arg Ile Ala

                 65                  70                  75

Ser His Gly Phe Val Val Ile Thr Ile Asp Thr Ile Thr Thr Leu

                 80                  85                  90

Asp Gln Pro Asp Ser Arg Ala Glu Gln Leu Asn Ala Ala Leu Asn

                 95                 100                 105

His MET Ile Asn Arg Ala Ser Ser Thr Val Arg Ser Arg Ile Asp

                110                 115                 120

Ser Ser Arg Leu Ala Val MET Gly His Ser MET Gly Gly Gly Gly

                125                 130                 135

Thr Leu Arg Leu Ala Ser Gln Arg Pro Asp Leu Lys Ala Ala Ile

                140                 145                 150

Pro Leu Thr Pro Trp His Leu Asn Lys Asn Trp Ser Ser Val Thr

                155                 160                 165

Val Pro Thr Leu Ile Ile Gly Ala Asp Leu Asp Thr Ile Ala Pro

                170                 175                 180

Val Ala Thr His Ala Lys Pro Phe Tyr Asn Ser Leu Pro Ser Ser

                185                 190                 195

Ile Ser Lys Ala Tyr Leu Glu Leu Asp Gly Ala Thr His Phe Ala

                200                 205                 210

Pro Asn Ile Pro Asn Lys Ile Ile Gly Lys Tyr Ser Val Ala Trp

                215                 220                 225

Leu Lys Arg Phe Val Asp Asn Asp Thr Arg Tyr Thr Gln Phe Leu

                230                 235                 240

Cys Pro Gly Pro Arg Asp Gly Leu Phe Gly Glu Val Glu Glu Tyr

                245                 250                 255

Arg Ser Thr Cys Pro Phe MET Ala Ile Ala Ala Gly Gly Thr Asn

                260                 265                 270

Pro Asn Pro Asn Pro Asn Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro

                275                 280                 285

Thr Pro Pro Pro Gly Ser Ser Gly Ala Cys Thr Ala Thr Tyr Thr

                290                 295                 300

Ile Ala Asn Glu Trp Asn Asp Gly Phe Gln Ala Thr Val Thr Val

                305                 310                 315

Thr Ala Asn Gln Asn Ile Thr Gly Trp Thr Val Thr Trp Thr Phe

                320                 325                 330

Thr Asp Gly Gln Thr Ile Thr Asn Ala Trp Asn Ala Asp Val Ser

                335                 340                 345

Thr Ser Gly Ser Ser Val Thr Ala Arg Asn Val Gly His Asn Gly

                350                 355                 360

Thr Leu Ser Gln Gly Ala Ser Thr Glu Phe Gly Phe Val Gly Ser

                365                 370                 375

Lys Gly Asn Ser Asn Ser Val Pro Thr Leu Thr Cys

                380                 385     387

<400>3

P1：5’-GGAATACCATATGTCCATGGCCAACCCCTACGAGCGCGG-3’

P2：5’-CGCGGCGATCGCCATGAACGGGCAGGTGGA-3’

P3：5’-TCCACCTGCCCGTTCATGGCGATCGCCGCG-3’

P4：5’-CATCTCGAGAGAATTCGGGCAGGTAAGGGTCGGAACAG-3’