一种抗白色念珠菌抗菌肽的生化制取方法

摘要

一种抗白色念珠菌抗菌肽的生化制取方法，本发明利用生化的方法提供了一种绵羊抗菌肽的分离、提纯方法，该抗菌肽是一种单链的多肽，其分子量是4820.47Da。等电点为6.96，呈酸性。本发明制取的抗菌肽具有热稳定性高，耐受蛋白酶水解的能力，可有效抑制革兰氏阳性、阴性和真菌的生长，且具有分离提纯工艺快速、高效，回收率高等特点，可广泛用于兽药、防腐剂、医药产品等领域。

说明书

技术领域：

本发明涉及一种抗白色念珠菌抗菌肽的制取方法，尤其是一种抗白色念珠菌抗菌肽的生化制取方法。

背景技术：

抗菌肽(antibacterial peptides，ABP)是由生物体基因编码、相对分子质量小，具有抗菌活性的肽类物质的总称。它是宿主产生的一类抵抗外界病原体感染的小分子多肽，广泛存在于昆虫、植物、动物和人体内，除有抗细菌、真菌和病毒等病原体作用外，还具有抗肿瘤细胞作用。因此，抗菌肽又称为肽抗生素(peptide antibiotics)。它是机体非特异性免疫的重要组成部分，是生物体抗感染免疫的古老机制，所以又叫做″第二防御体系″。研究表明，抗菌肽具有抗菌活性强、广谱抗菌、热稳定性及不易产生耐药性等优点。同时还有高效的抗真菌和(或)抗病毒和(或)原虫和(或)抗肿瘤活性。在临床感染菌对传统抗生素耐药性日益严重的今天，人们希望抗菌肽成为继传统抗生素之后的又一类新型抗感染药物。随着分子生物学技术的发展，抗菌肽已成为近年来分子免疫学和分子生物学的研究热点。研究的内容包括：抗菌肽的分离与纯化，氨基酸序列的分析；蛋白质构型与功能的关系，抗菌肽的作用机理；应用基因工程技术克隆和表达抗菌肽基因；改造合成抗菌肽基因以及动植物的转抗菌肽基因工程等。

近年来，随着抗生素的应用和滥用，耐药菌株不断增加，向抗感染治疗提出了严峻的挑战。根据美国《新闻周刊》报道，早在1992年全美国就有13300名患者死于抗生素耐药性细菌感染。现在已有抗所有抗生素的耐药菌株出现。为了解决这一问题，人们一方面对传统抗生素进行结构改造以对付细菌的耐药性，另一方面，人们研究和开发新型的药物。抗菌肽与传统抗生素相比，其不同点在于抗菌肽的作用靶位点是病原体细胞膜，因此不易产生耐药性，尤其是抗菌肽能特异性的抑制肿瘤细胞，而对正常细胞没有毒害作用，这给抗癌药物的开发带来了新的希望。美国、英国皇家医学会将抗菌肽列为21世纪抗癌首选药物。另外，抗真菌肽的发现，对人们棘手的真菌病治疗提供了新的思路。

目前，许多抗菌肽都被开发成药物，但天然抗菌肽的产量非常有限，合成肽价格非常昂贵，这将成为开发新药的一个瓶颈。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种具有抗白色念珠菌抗菌肽的生化制取方法。

本发明的特征在于由以下方法来实现；

一、样品处理：

将100-200g绵羊生殖道剪碎成0.5-1.2cm²的小块，9000-12000r/min离心5-20min，零下10-20℃冻融3-4次，用超声波细胞破碎仪破碎细胞，按1∶1.5-3体比加入浓度为5-30％乙酸，在3-5℃搅拌浸提20-26h，然后在3-5℃时，将浸提混合物在高速冷冻离心机上用10000-15000r/min离心20-30min，收集上清透析，测定蛋白浓度，冷冻干燥，零下10-20℃低温保存，取0.1-1mg重新溶解在浓度为0.01-0.05％乙酸中用于检测活性；(本文中涉及的百分比浓度，除另加说明外均指体积百分比)

二、抗菌肽初级分离；

用凝胶过滤色谱方法进行初级分离：在室温下将48-53.0g交联葡聚糖凝胶G-50(Sephadex G-50)，溶解于480.0-530.0mL去离子水中澎胀20-26h，采用真空泵脱除凝胶中气体后，进行装柱使其成φ1cm×15-100cm柱，先用0.15-0.25N氢氧化钠清洗液冲洗2-4h，再用浓度为0.1-0.05mol/L，pH值为5-7乙酸铵洗脱液平衡柱子，将样品重悬在上述洗脱液中，以9000-12000r/min离心10-20min，取上清上样，洗脱流速18-20mL/h，收集目的峰，整个洗脱过程在0-10℃环境中进行，用吸光值200-300nm检测洗脱峰，收集后冷冻干燥，重新溶解在浓度为0.01-0.05％乙酸中，测定蛋白浓度、检测抗菌活性；

三、抗菌肽的精分离：

用反相高效液相色谱方法进行精分离：将凝胶过滤色谱有抗菌部分进行第二步分离纯化，将样品重悬在浓度为0.01-0.05％乙酸洗脱液中，在0-10℃时以9000-12000r/min离心10-20min，取上清上样于反相高效液相色谱柱(Hypersil BDS C18 RP-HPLC column)，柱长为0.2-0.5cm×20-100cm，用含浓度为0.08-0.11％三氟乙酸的水和含浓度为0.08-0.11％三氟乙酸的乙腈按990-999∶1-10的体积比构成的洗脱液进行梯度洗脱，吸光值200-300nm检测洗脱峰，收集冷冻干燥，测定蛋白浓度、检测抗菌活性；

四、绵羊抗菌肽的抗菌活性检测：

采用肉汤稀释法：将标准菌株在灭菌MH肉汤琼脂平板上过夜培养，挑取菌落接种于MH肉汤培养基中，用摇床过夜培养，转速为180-200r/min、温度为35-38℃，将培养后的菌液稀释至2×10⁵CFU/ml，在无菌酶标板上第1孔中加80-90ul，MH肉汤培养基，第2-11孔中各加入50ul MH肉汤培养基，第一孔再加入10-20ul，经孔经为0.01-0.22μm滤膜过滤后的溶解于浓度为0.05-0.01％乙酸的绵羊抗菌肽样品，充分混匀后取50ul再加入第2孔，依次倍比稀释，从第10孔中吸出50ul弃去，第11孔加50ul培养后的菌液作为扫描对照，再向第12孔中加50ul MH肉汤培养基，混匀后在35-38℃时在摇床上以150-200r/min培养18-24h，用酶标仪在600nm波长处对平板进行扫描，抗菌肽的MIC的确定按照比对照孔11孔的浑浊程度低50％以上的最小质量浓度计算，结果如下表显示：

绵羊生殖道提取物最小抑菌浓度；

菌株                          MIC50(ug/ml)

大肠杆菌ATCC25922             12

金黄色葡萄球菌ATCC2592        10

链球菌ATCC55121               24

白色念珠菌ATCC2002            4

或采用薄层琼脂糖孔穴扩散法：每毫升含10^5-6细菌或孢子的菌液均匀涂布于固体LB培养基表面，将经过灭菌的0.5cm直径的滤纸片置于培养基表面，滴加6-10ul的待测样品溶液，于35-38℃下培养18-20小时，观察抑菌圈形成与否，有抑菌圈形成的表明有抗菌活性；

五、绵羊抗菌肽的溶血活性检测：

采兔血，将兔血与阿氏液，按1∶1体积比混合置于离心管中，离心转速1500-2000r/min，离心5-10min，用生理盐水洗涤至上清液不再呈红色为止，将上述洗涤好的红细胞加生理盐水稀释成10⁷-10⁸浓度的悬浮液，上述稀释好的悬浮液与溶解于生理盐水中的不同浓度的抗菌肽样品，在35-38℃时，保温20-30min，再离心1500-2000r/min，5-10min，上清液于540nm波长处测吸收值，阴性对照使用生理盐水，阳性对照使用Triton X-100，结果显示绵羊生殖道抗菌肽具有7.6％的溶血活性；

六、绵羊抗菌肽纯度鉴定：

分离纯化得到纯品采用HPLC和MALDI-TOF-MS鉴定，首先用HPLC对分离纯化得到的绵羊抗菌肽进行纯度鉴定，将绵羊抗菌肽溶解在浓度为0.08-0.11％三氟乙酸水溶液中，在0-4℃时以9000-12000r/min，离心10-20min，取上清上样10-15ul上C18柱，用含有浓度为0.08-0.11％的三氟乙酸的水和含有浓度为0.08-0.11％的乙腈按999∶1体积比构成的洗脱液，反复冲洗柱子，保证柱子中的杂质及吸附的蛋白质被彻底的清洗，并以18-20mL/h进行洗脱分离，得到的抗菌肽纯品，如图3，再利用MALDI-TOF-MS做进一步鉴定，将纯品稀释成10^4-6mol/l的水溶液，吸取10-15ul置于小塑料管中，加入10-15ul芥子酸混匀，取1-2ul此溶液滴在进样伸头上，调整真空度为1.3×10-4Pa时，抽空除去溶剂，使样品与基质混合液在探头上形成均匀的结晶，在电压为15-30kv，激光波长为377nm时，在仪器上直接测定样品的纯度和分子量。如图4，最终结果显示，该抗菌肽是一种单链的多肽，其分子量是4820.47Da，等电点为6.96，呈酸性；

七、保存；在零下20-80℃的低温下保存。

上述的吸光值最好为215-285nm。

上述的反相高效液相色谱柱，柱长最好为0.4-0.5cm×20-50cm。

本发明制取的抗菌肽具有热稳定性高，耐受蛋白酶水解的能力，可有效抑制革兰氏阳性、阴性和真菌的生长，且具有分离提纯工艺快速、高效，回收率高等特点，可广泛用于兽药、防腐剂、医药产品等领域。

附图说明

图1为凝胶过滤层析分离纯化绵羊生殖道抗菌肽结果。

图2为有活性的目的峰进一步利用反相C18高效液相色谱柱分离结果。

图3为绵羊生殖道抗菌肽质谱鉴定。

图4为绵羊生殖道抗菌肽纯度鉴定。

具体实施方式：

实施例1：

一、样品处理；

将100g绵羊生殖道剪碎成0.5-1.2cm²的小块，9000r/min离心10min，零下10℃冻融3次，用超声波细胞破碎仪破碎细胞，按1∶2体积比加入浓度为5％乙酸在4℃搅拌浸提24h，然后将浸提混合物在高速冷冻离心机上10000r/min，在4℃时，离心25min，收集上清透析，测定蛋白浓度，冷冻干燥，零下10℃低温保存，取少量重新溶解在浓度为0.01％乙酸中用于检测活性。

二、抗菌肽初级分离；

用凝胶过滤色谱方法进行初级分离：在室温下将48g交联葡聚糖凝胶G-50溶解于480mL去离子水中澎胀20h，采用真空泵脱除凝胶中气体后，进行装柱使其成φ1cm×15cm柱，先用0.15N氢氧化钠清洗液冲洗2h，再用浓度为0.1mol/L，pH值为5乙酸铵洗脱液平衡柱子，将样品重悬在上述洗脱液中，以9000r/min离心10min，取上清上样，洗脱流速18mL/h，收集目的峰，整个洗脱过程在4℃环境中进行，用吸光值200nm检测洗脱峰，收集后冷冻干燥，重新溶解在浓度为0.01％乙酸中，测定蛋白浓度、检测抗菌活性。

三、抗菌肽的精分离；

用反相高效液相色谱方法进行精分离：将凝胶过滤色谱有抗菌部分进行第二步分离纯化，将样品重悬在浓度为0.01％乙酸洗脱液中，在4℃以9000r/min离心10min，取上清上样于反相C18高效液相色谱柱，柱长为0.2cm×20cm，用含浓度为0.0.8％三氟乙酸的水和含浓度为0.08％三氟乙酸的乙腈按999∶1的体积比构成的洗脱液进行梯度洗脱，吸光值200nm检测洗脱峰，收集冷冻干燥，测定蛋白浓度、检测抗菌活性。

四、绵羊抗菌肽的抗菌活性检测；

采用微量肉汤稀释法：将标准菌株在灭菌MH肉汤琼脂平板上过夜培养，挑取菌落接种于肉汤培养基中，用摇床过夜培养，转速为180r/min、温度为35℃，将培养后的菌液稀释至2×10⁵CFU/ml，在96孔无菌酶标板上第一孔中加90ul MH液体培养基，第2-11孔中加入50ul MH液体培养基，第一孔再加入10ul经孔径为0.22μm滤膜过滤后的溶解于浓度为0.01％乙酸的绵羊抗菌肽样品，充分混匀后取50ul加入第2孔，依次倍比稀释，自第10孔吸出50ul弃去，第11孔加50ul菌液(不加抗菌肽)作为扫描对照，再向第12孔中加50ul MH肉汤，混匀后放置35℃时，在摇床上以150r/min培养18h，于600nm波长处测定吸光值，用酶标仪在600nm下对平板进行扫描，肽的MIC的确定按照比对照孔(11孔)的浑浊程度低50％以上的最小质量浓度计算。

或采用薄层琼脂糖孔穴扩散法：每毫升含10⁵细菌或孢子的菌液均匀涂布于固体LB培养基表面，将经过灭菌的0.5cm直径的滤纸片置于培养基表面，滴加10ul的待测样品溶液，于35℃培养18小时，观察抑菌圈形成与否，有抑菌圈形成的表明有抗菌活性。

五、绵羊抗菌肽的溶血活性检测

采兔血，将兔血与阿氏液，按1∶1体积比混合置于离心管中，用转速为2000r/min离心，5min，用生理盐水洗涤至上清液不再呈红色为止，将上述洗涤好的红细胞加生理盐水稀释成10⁸浓度的悬浮液，上述稀释好的悬浮液与溶解于生理盐水的不同浓度的样品在38℃时，保温30min，再离心2000r/min，10min，上清液于540nm波长处测吸收值。阴性对照使用生理盐水，阳性对照使用Triton X-100，结果显示绵羊生殖道抗菌肽具有7.6％的溶血活性。

六、绵羊抗菌肽纯度鉴定；

分离纯化得到纯品采用HPLC和MALDI-TOF-MS鉴定，首先用HPLC对分离纯化得到的绵羊抗菌肽进行纯度鉴定，将绵羊抗菌肽溶解在浓度为0.08-％三氟乙酸水溶液中，在4℃时以9000r/min，离心10min，取上清上样10ul上C18柱，用含有浓度为0.08％的三氟乙酸和含有浓度为0.08％的乙腈按999∶1的体积比构成的洗脱液进行洗脱，反复冲洗柱子，保证柱子中的杂质及吸附的蛋白质被彻底的清洗，并以18mL/h进行洗脱分离，得到的抗菌肽纯品，再利用MALDI-TOF-MS做进一步鉴定，将纯品稀释成10⁶mol/l的水溶液，吸取10ul置于小塑料管中，加入15ul芥子酸混匀，取1ul此溶液滴在进样伸头上，调整真空度为1.3×4Pa时，抽空除去溶剂，使样品与基质混合液在探头上形成均匀的结晶，在电压为15kv，激光波长为377nm时，在仪器上直接测定样品的纯度和分子量。最终结果显示，该抗菌肽是一种单链的多肽，其分子量是4820.47Da，等电点为6.96，呈酸性；

七、保存；在零下20℃的低温下保存。

实施例2：

一、样品处理；

将200g绵羊生殖道剪碎成0.5-1.2cm²的小块，12000r/min离心5min，零下10℃冻融3次，用超声波细胞破碎仪破碎细胞，按1∶3体积比加入浓度为5％乙酸在3℃搅拌浸提26h，然后将浸提混合物在高速冷冻离心机上15000r/min，在3℃时，离心30min，收集上清透析，测定蛋白浓度，冷冻干燥，零下20℃低温保存，取1mg重新溶解在浓度为0.01％乙酸中用于检测活性。

二、抗菌肽初级分离；

用凝胶过滤色谱方法进行初级分离：在室温下将53g交联葡聚糖凝胶G-50溶解于530mL去离子水中澎胀26h，采用真空泵脱除凝胶中气体后，进行装柱使其成φ1cm×100cm柱，先用0.25N氢氧化钠清洗液冲洗4h，再用浓度为0.05mol/L，pH值为7乙酸铵洗脱液平衡柱子，将样品重悬在上述洗脱液中，以12000r/min离心20min，取上清上样，洗脱流速20mL/h，收集目的峰，整个洗脱过程在10℃环境中进行，用吸光值285nm检测洗脱峰，收集后冷冻干燥，重新溶解在浓度为0.05％乙酸中，测定蛋白浓度、检测抗菌活性。

三、抗菌肽的精分离；

用反相高效液相色谱方法进行精分离：将凝胶过滤色谱有抗菌部分进行第二步分离纯化，将样品重悬在浓度为0.05％乙酸洗脱液中，在10℃以12000r/min离心20min，取上清上样于反相C18高效液相色谱柱，柱长为0.5cm×100cm，0.1％，用含浓度为0.11％三氟乙酸的水和含浓度为0.11％三氟乙酸的乙腈按990∶10体积比构成的洗脱液进行梯度洗脱，吸光值285nm检测洗脱峰，收集冷冻干燥，测定蛋白浓度、检测抗菌活性。

四、绵羊抗菌肽的抗菌活性检测；

采用微量肉汤稀释法：将标准菌株在灭菌MH肉汤琼脂平板上过夜培养，挑取菌落接种于灭菌试管的MH肉汤中，用摇床过夜培养，转速为200r/min、温度为38℃，将培养后的菌液稀释至2×10⁵CFU/ml，在96孔无菌酶标板上第一孔中加80ul MH液体培养基，第2-11孔中加入50ulMH液体培养基，第一孔再加入20ul经孔径为0.01μm滤膜过滤后的溶解于浓度为0.05％乙酸的绵羊抗菌肽样品，充分混匀后取50ul加入第2孔，依次倍比稀释，自第10孔吸出50ul弃去，第11孔加50ul菌液(不加抗菌肽)作为扫描对照，再向第12孔中加50ul MH肉汤，混匀后放置38℃时，在摇床上以200r/min培养24h，于600nm波长处测定吸光值，用酶标仪在600nm下对平板进行扫描，肽的MIC的确定按照比对照孔(11孔)的浑浊程度低50％以上的最小质量浓度计算。

或采用薄层琼脂糖孔穴扩散法：每毫升含10⁶细菌或孢子的菌液均匀涂布于固体LB培养基表面，将经过灭菌的0.5cm直径的滤纸片置于培养基表面，滴加6ul的待测样品溶液，于38℃培养20小时，观察抑菌圈形成与否，有抑菌圈形成的表明有抗菌活性，进一步利用微量肉汤稀释法进行最小抑菌浓度的测定。

五、绵羊抗菌肽的溶血活性检测

采兔血，将兔血与阿氏液，按1∶1体积比混合置于离心管中，用转速为1500r/min离心，10min，生理盐水洗涤至上清液不再呈红色为止，将上述洗涤好的红细胞加生理盐水稀释成10⁷浓度的悬浮液，上述稀释好的悬浮液与溶解于生理盐水的不同浓度的样品在35℃时，保温20min，再离心1500r/min，5min，上清液于540nm波长处测吸收值。阴性对照使用生理盐水，阳性对照使用Triton X-100，结果显示绵羊生殖道抗菌肽具有7.6％的溶血活性。

六、绵羊抗菌肽纯度鉴定；

分离纯化得到纯品采用HPLC和MALDI-TOF-MS鉴定，首先用HPLC对分离纯化得到的绵羊抗菌肽进行纯度鉴定，将绵羊抗菌肽溶解在浓度为0.11％三氟乙酸水溶液中，在0℃时以12000r/min，离心20min，取上清上样15ul上C18柱，用含有浓度为0.11％的三氟乙酸和含有浓度为0.011％的乙腈按990∶10的体积比构成的洗脱液进行洗脱，反复冲洗柱子，保证柱子中的杂质及吸附的蛋白质被彻底的清洗，并以20mL/h进行洗脱分离，得到的抗菌肽纯品，再利用MALDI-TOF-MS做进一步鉴定，将纯品稀释成10⁴mol/l的水溶液，吸取15ul置于小塑料管中，加入10ul芥子酸混匀，取1ul此溶液滴在进样伸头上，调整真空度为1.3×10Pa时，抽空除去溶剂，使样品与基质混合液在探头上形成均匀的结晶，在电压为30kv，激光波长为377nm时，在仪器上直接测定样品的纯度和分子量。最终结果显示，该抗菌肽是一种单链的多肽，其分子量是4820.47Da，等电点为6.96，呈酸性；

七、保存；在零下80℃的低温下保存。