一种原位复合单质纳米银的细菌纤维素膜的制备方法

摘要

本发明提供了一种原位复合单质纳米银的细菌纤维素膜的制备方法，涉及生物医用材料领域，其主要特征在于，细菌纤维素膜具有独特的三维纳米网络结构，通过银氨溶液同含醛基化学试剂的反应在其网络结构中原位生成银单质纳米颗粒。此外，本发明利用独特的干燥方法使得所制备的含银纳米细菌纤维素干膜脆性大的缺点得到改善。本发明提供的含单质纳米银颗粒细菌纤维素膜抗菌性能优异、制备工艺简单，可广泛用于大面积伤口敷料，包扎带等生物医疗领域，还可用于制备纳米银颗粒和银催化剂等工业领域。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医用材料领域，特别涉及一种新型含银抗菌性纳米细菌纤维素膜的制备方法。

背景技术

细菌纤维素膜(BC)是一种天然的生物高聚物，基本化学结构如图1所示，是由β-D-葡萄糖通过β-1，4-糖苷键连接而成的一种无分支的大分子直链聚合物，又称为β-1，4-葡萄糖。细菌纤维素膜具有高结晶度且化学纯度高，不含半纤维素、木质素和其他细胞壁成分，以100％纤维素的形式存在，提纯过程简单；细菌纤维素膜持水性高，其内部有很多“孔道”，有良好的透气、透水性能，能吸收60-700倍于其干重的水分。细菌纤维素膜具有超细纳米纤维网络、高抗张强度和弹性模量，其杨氏模量可达10MPa，经热压处理后，杨氏模量可达30MPa；具有极佳的形状维持能力和抗撕力，细菌纤维素膜的抗撕能力比聚乙烯膜和聚氯乙烯膜要强5倍。同时，细菌纤维素膜具有较高的生物相容性和良好的生物可降解性，最终可降解生成单糖等小分子物质。细菌纤维素膜采用微生物发酵合成，其性能和形状的可调控，生产过程绿色环保，成本低，产率高。

由于细菌纤维素膜的上述优良性能，作为生物医用材料，其具有广泛的应用前景。目前国外已经有研究机构推出了一些细菌纤维素膜的生物医用制品，如组织工程支架、人工血管、组织工程皮肤等。其中，以细菌纤维素膜生产的组织工程皮肤，在潮湿情况下所具有的高机械强度，对气体和液体的高渗透性，这些指标均优于常规皮肤代用品。但是，细菌纤维素膜本身没有抗菌活性，不能防止伤口的感染，赋予细菌纤维素膜的较强抗菌性能对其在生物医用材料领域的应用至关重要。

目前国内外抗菌性细菌纤维素膜主要采用复合氯化银粒子以及添加有机抗菌剂等方法，其工艺复杂，抗菌效果较差、离化能力差等问题难以克服，限制了这类抗菌生物医用材料的开发和应用。无机抗菌剂与有机抗菌剂相比，最大的区别在于使用有机抗菌剂容易使细菌产生耐药性，使用不当反而对人体造成危害，而使用无机抗菌剂，不会使细菌产生耐药性。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型含单质纳米银抗菌性纳米细菌纤维素膜的制备方法，使制备出的细菌纤维素膜具有优良的力学性能和抗菌性能，通过独特的干燥方法克服含银纳米细菌纤维素膜干膜脆性大的缺点。

本发明的技术方案是：制备一种含单质纳米银粒子的细菌纤维素膜，细菌纤维素膜的纳米级别纤维网络结构上附着有单质银纳米颗粒，甚至可包覆细菌纤维素膜纤维。通过化学反应在细菌纤维素膜的网络结构中形成纳米单质银微粒，化学反应的基本原理为托伦试剂与含醛基化合物反应生成单质银附着于细菌纤维素膜纤维网中。

具体步骤如下：

步骤一、细菌纤维素膜预处理及提纯工艺。

取细菌纤维素膜用清水多次冲洗，除去膜表面培养基及杂质。再将膜浸泡于0.01～5mol/L的NaOH溶液，80～100℃下煮沸5～60min，去除液膜中的菌体和残留培养基，此时，膜呈乳白色半透明状。然后用蒸馏水多次冲洗，控制pH值约为7.2，得到提纯细菌纤维素膜。

所述细菌纤维素膜是由醋杆菌属、八叠球菌属、假单胞菌属、根瘤菌属、无色杆菌属、产碱菌属、气杆菌属、固氮菌属、土壤杆菌属等九类菌属中的任何一种经发酵产生，所产细菌纤维素膜具有三维多孔网络结构。

步骤二、制备银氨溶液，指含有二氨合银离子([Ag(NH₃)₂]⁺)的水溶液。

向浓度为0.0001mol/L～1.0mol/L的银盐溶液中加入氢氧化钠稀溶液，产生白色的氢氧化银沉淀随即分解为棕色的氧化银和水；再向溶液中滴加浓氨水，直至棕色沉淀刚好溶解，得到银氨溶液。

所述银盐溶液为硝酸银、氯化银或柠檬酸银等中的一种，银盐也可由一些不溶的银盐代替，但制备时直接加入氨水将不溶物溶解即可。

步骤三、细菌纤维素膜纳米网络结构原位生成纳米银粒子。

方法1：

a、将步骤一中处理好的细菌纤维素膜浸入步骤二所制备的银氨溶液中0.1～10小时；

b、将通过a步骤得到的细菌纤维素膜用蒸馏水水洗3-20min，排除表面残留的化学试剂；

c、将通过b步骤得到的细菌纤维素膜浸入浓度为0.0001mol/L～1.0mol/L含醛基的化学试剂溶液中20～100℃水浴2～60min。

方法2：

a、将步骤一中处理好的细菌纤维素膜浸入浓度为0.0001mol/L～1.0mol/L含醛基的化学试剂溶液中0.5～10小时；

b、将通过a步骤得到的细菌纤维素膜用蒸馏水水洗3～9min，排除表面残留的化学试剂；

c、将通过b步骤得到的细菌纤维素膜浸入步骤二得到的银氨溶液中，在20～100℃下水浴反应2～60min。

反应所得Ag附着于细菌纤维素膜纳米级网络结构中，得到含单质纳米银的细菌纤维素膜。

所述含醛基的化学试剂除甲醛或乙醛等普通的醛类外，还可以是甲酸、甲酸盐、甲酸酯、葡萄糖、葡萄糖酯、麦芽糖、果糖等中任一种含醛基的化合物。

步骤四、将步骤三得到的含单质纳米银的细菌纤维素膜取出，用蒸馏水冲洗5～20min，防止细菌纤维素膜表面残留化学试剂，从而获得含单质纳米银的细菌纤维素湿膜。

步骤五、也可将通过步骤四得到的含单质纳米银的细菌纤维素湿膜继续进行干燥处理，得到含单质纳米银的细菌纤维素干膜。

所述干燥处理为以下任一种方式：

a、通风状态下常温或20℃～80℃下恒温干燥处理；

b、将细菌纤维素膜在-60℃～20℃的冷冻干燥机中干燥处理；

c、将细菌纤维素湿膜置于-20℃～60℃的环境中冷冻处理后，再在真空干燥机、恒温箱或者常温下干燥处理，得到脆性较低的含银细菌纤维素膜。

以上所述蒸馏水为双重蒸馏。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：

1、本发明所获得含银细菌纤维素膜中银为单质，纳米单质银在银系抗菌剂中抗菌性能最佳，与氯离子不反应，并且没有过敏反应(如表1所示)，因此纳米单质银是提高细菌纤维素膜抗菌活性的最佳选择。

2、本发明利用细菌纤维素膜具有的独特的纳米级三维网络结构，有目的地制备含单质纳米银粒子的细菌纤维素膜，使细菌纤维素膜获得了优异的抗菌性能，并且所含纳米单质银的含量可控。

3、本发明制得的含银细菌纤维素膜用途广泛，可用于大面积伤口敷料，包扎带等生物医疗领域。用纤维素酶或者4-甲基吗啉氧化物单水合物(NMMO)将含纳米银细菌纤维素膜中的纤维素溶解去除，可制备纳米银颗粒。此外所述的含单质纳米银粒子的细菌纤维素膜可用于银催化剂体系。

4、本发明的制备过程简单，工艺成熟，成本低，适合于进行抗菌性纳米银细菌纤维素膜的产业化生产。

表1银系抗菌剂抗菌性能比较

  化合物  离子化能力  氯离子反应  过敏反应  抗菌性能  金属银及涂层  低  反应  有  低  单质纳米银  低  不反应  无  很高  胶体银  中等至高  反应  有  中等  磷酸盐  中等  反应  有  中等  硝酸盐  很高  反应  有  很高  氯化物  低  -  有  低  硫酸盐  中等  反应  有  中等  沸石  未见报道  未知  有  中等  磺胺嘧啶盐  高  反应  有  高  氧化银  低  反应  有  中等

附图说明

图1为细菌纤维素膜化学结构示意图。

图2为含银细菌纤维素膜的扫描电镜图，显示了细菌纤维素膜独特的纳米网络结构。

具体实施方式

以下结合具体实施案例，进一步阐述本发明。应理解为，这些实施案例仅仅用于说明本发明而不是用于限制本发明的范围。此外应理解，本领域的技术人员在阅读了本发明讲授的内容之后，对本发明所做各种等价形式之改动，同样落入本申请权利要求书所要求的范围之内。

实施例1

将市售由木醋杆菌制得的细菌纤维素膜剪取成2×2cm的细菌纤维素膜样品。

步骤一、取细菌纤维素膜用清水多次冲洗，除去膜表面培养基及杂质。再将膜浸泡于0.1mol/L的NaOH溶液，I00℃下煮沸20min，去除液膜中的菌体和残留培养基，此时，膜呈乳白色半透明状。然后用蒸馏水多次冲洗，控制pH值约为7.2，得到纯化细菌纤维素膜，所产细菌纤维素膜具有三维多孔网络结构(见附图2)；

步骤二、向浓度为0.0001mol/L的银盐溶液中滴入氢氧化钠稀溶液，产生白色的氢氧化银沉淀随即分解为棕色的氧化银和水；再向溶液中滴加浓氨水，直至棕色沉淀刚好溶解，得到银氨溶液；

步骤三、将步骤一中处理好的细菌纤维素膜浸入步骤二所制备的银氨溶液中15min；

步骤四、将通过步骤三得到的细菌纤维素膜用蒸馏水水洗5min，排除表面残留的化学试剂；

步骤五、将步骤四得到的细菌纤维素膜浸入浓度为0.0001mol/L葡萄糖溶液中40℃水浴5min；

步骤六、将步骤五得到的含单质纳米银的细菌纤维素膜取出，用蒸馏水冲洗15min，去除细菌纤维素膜表面残留化学试剂，从而获得含单质纳米银的细菌纤维素膜湿膜；

步骤七、将通过步骤四得到的含单质纳米银的细菌纤维素膜轧平并在通风状态下常温干燥处理，得到含单质纳米银的细菌纤维素干膜。

经过测试表征，可得单质纳米银粒子粒径为5～160nm，分散在细菌纤维素膜的多孔网络结构中。单质纳米银粒子的含量占总重量的0.7％。

实施例2

将市售由八叠球菌制得的细菌纤维素膜剪取成2×2cm的细菌纤维素膜样品。

步骤一、取细菌纤维素膜用清水多次冲洗，除去膜表面培养基及杂质。再将膜浸泡于0.05mol/L的NaOH溶液，100℃下煮沸30min，去除液膜中的菌体和残留培养基，此时，膜呈乳白色半透明状。然后用蒸馏水多次冲洗，控制pH值约为7.2，得到纯化细菌纤维素膜；

步骤二、向浓度为0.001mol/L的银盐溶液中加入几滴氢氧化钠稀溶液，产生白色的氢氧化银沉淀随即分解为棕色的氧化银和水；再向溶液中滴加浓氨水，直至棕色沉淀刚好溶解，得到银氨溶液；

步骤三、将步骤一中处理好的细菌纤维素膜浸入步骤二所制备的银氨溶液中60min；

步骤四、将通过步骤三得到的细菌纤维素膜用蒸馏水水洗6min，排除表面残留的化学试剂；

步骤五、将步骤四得到的细菌纤维素膜浸入浓度为0.001mol/L葡萄糖溶液中60℃水浴8min；

步骤六、将步骤五得到的含单质纳米银的细菌纤维素膜取出，用蒸馏水冲洗20min，去除细菌纤维素膜表面残留化学试剂，从而获得含单质纳米银的细菌纤维素湿膜；

步骤七、将通过步骤四得到的含单质纳米银的细菌纤维素膜轧平并在-40℃的冷冻干燥机中干燥处理，得到含单质纳米银的细菌纤维素干膜。

经过测试表征，可得如图2所示的单质纳米银粒子粒径为5-260nm，分散在细菌纤维素膜的多孔网络结构中。单质纳米银粒子的含量占总重量的2.3％。

实施例3

将市售由土壤根瘤菌制得的细菌纤维素膜剪取成2×2cm的细菌纤维素膜样品。

步骤一、取细菌纤维素膜用清水多次冲洗，除去膜表面培养基及杂质。再将膜浸泡于0.2mol/L的NaOH溶液，80℃下煮沸15min，去除液膜中的菌体和残留培养基，此时，膜呈乳白色半透明状。然后用蒸馏水多次冲洗，控制pH值约为7.2，得到纯化细菌纤维素膜；

步骤二、向浓度为0.01mol/L的银盐溶液中加入几滴氢氧化钠稀溶液，产生白色的氢氧化银沉淀随即分解为棕色的氧化银和水；再向溶液中滴加浓氨水，直至棕色沉淀刚好溶解，得到银氨溶液；

步骤三、将步骤一所得的细菌纤维素膜浸入浓度为0.01mol/L乙醛溶液中5小时；

步骤四、将通过步骤三得到的细菌纤维素膜用蒸馏水水洗6min，排除表面残留的化学试剂；

步骤五、将通过b步骤得到的细菌纤维素膜浸入步骤二所制备的不同浓度的银氨溶液中在50℃下水浴10min；

步骤六、将步骤五得到的含单质纳米银的细菌纤维素膜取出，用蒸馏水冲洗20min，防止细菌纤维素膜表面残留化学试剂，从而获得含单质纳米银的细菌纤维素膜湿膜；

步骤七、将通过步骤四得到的含单质纳米银的细菌纤维素膜轧平置于-20℃～60℃的环境中冷冻处理后，再在真空干燥机中干燥处理，得到脆性较低的含单质纳米银的细菌纤维素干膜。

经过测试表征，可得单质纳米银粒子粒径为5～240nm，分散在细菌纤维素膜的多孔网络结构中。单质纳米银粒子的含量占总重量的17.2％。

实施例4

将市售由洋葱假单胞菌制得的细菌纤维素膜剪取成2×2cm的细菌纤维素膜样品。

步骤一、取细菌纤维素膜用清水多次冲洗，除去膜表面培养基及杂质。再将膜浸泡于0.4mol/L的NaOH溶液，85℃下煮沸45min，去除液膜中的菌体和残留培养基，此时，膜呈乳白色半透明状。然后用蒸馏水多次冲洗，控制pH值约为7.2，得到纯化细菌纤维素膜；

步骤二、向浓度为0.1mol/L的银盐溶液中加入几滴氢氧化钠稀溶液，产生白色的氢氧化银沉淀随即分解为棕色的氧化银和水；再向溶液中滴加浓氨水，直至棕色沉淀刚好溶解，得到银氨溶液；

步骤三、将步骤一所得的细菌纤维素膜浸入浓度为0.1mol/L乙醛溶液中1小时；

步骤四、将通过步骤三得到的细菌纤维素膜用蒸馏水反复水洗，排除表面残留的化学试剂；

步骤五、将通过b步骤得到的细菌纤维素膜浸入步骤二所制备的银氨溶液中在60℃下水浴5min；

步骤六、将步骤五得到的含单质纳米银的细菌纤维素膜取出，用蒸馏水冲洗20min，洗脱细菌纤维素膜表面残留化学试剂，从而获得含单质纳米银的细菌纤维素湿膜；

步骤七、将通过步骤四得到的含单质纳米银的细菌纤维素膜轧平并在-40℃下急冷然后真空干燥处理，得到含单质纳米银的细菌纤维素干膜。

经过测试表征，可得如图2所示的单质纳米银粒子粒径为5-285nm，分散在细菌纤维素膜的多孔网络结构中。单质纳米银粒子的含量占总重量的36.2％。