诱导免疫细胞产生干扰素和活化TOLL样受体的中草药萃取物及其制备方法

摘要

本发明涉及诱导免疫细胞产生干扰素和活化Toll样受体的中草药萃取物及其制备方法。本发明提供一种诱导免疫细胞产生干扰素及活化Toll样受体的中草药萃取物及其制备方法，所述中草药萃取物包含有效量的甘草、柴胡、黄芩、五味子以及芍药。

说明书

【技术领域】

本发明有关于一种中草药萃取物，特别是有关于一种诱导免疫细胞产 生干扰素及活化Toll样受体的中草药萃取物及其制备方法。

【先前技术】

干扰素(IFN)是第一个被发现的细胞间素，因其具有“干扰”病毒复制 的能力而命名。干扰素是1957年由英国Alick Isaacs和Jean Lindenmann两 位研究人员所发现，当细胞受到病毒感染时，会立即制造出干扰素以抵抗病 毒，并同时警告邻近正常的细胞，提高警觉，以防病毒入侵。干扰素主要分 成二大类：I型及II型。I型的干扰素包括干扰素-α、干扰素-β、干扰素-ω、 干扰素-τ，大部分的细胞都可以表达干扰素-α及干扰素-β；II型的干扰素包 括干扰素-γ，只表达在部分的免疫细胞，例如天然杀伤(NK)细胞、CD4⁺辅助 性T淋巴细胞1(T_H1)和CD8⁺细胞毒性T淋巴细胞。

在病毒感染期间，I型的干扰素可以快速的被诱导产生，接着会与靶细 胞上的I型干扰素受体结合，启动Jak-STAT信号途径，开启干扰素刺激基 因(IFN-stimulated gene，ISG)表达。干扰素刺激基因蛋白质产物是干扰素对抗 病毒最主要策略，目前有超过五百多种的干扰素刺激基因蛋白质被定义出 来，这些分子参与的范围非常广泛，从抗病毒(anti-virus)、细胞凋亡 (apoptosis)、蛋白质降解(protein degradation)、炎性细胞应答(inflammatory cell response)至脂质代谢(lipid metabolism)，涵盖多种功能。最广为人知的干扰素 刺激基因蛋白质包括蛋白激酶R(PKR)、作用于RNA的腺苷脱氨酶 (adenosine deaminase acting on RNA，ADAR)、2’，5’-寡聚腺苷酸合成酶(oligo adenylate synthetase，OAS)、RNA酶L及Mx蛋白。PKR会借着抑制真核起 始因子(eukaryotic initiation factor 2，eIF2)而阻断病毒蛋白的合成，ADAR会 抑制病毒RNA编辑(RNA editing)，OAS、RNA酶L会降解病毒RNA，Mx 蛋白则能抑制病毒复制。

除了能直接对抗病毒外，I型的干扰素还参与了免疫调控 (immunomodulatory)，在先天性及后天性免疫反应中扮演着重要角色。除了 能够产生IL-15驱动天然杀伤细胞的存活与增殖，同时也能刺激MHC、 CD80、CD86及CD40分子的表达，进而促进树突细胞成熟，此外，I型的 干扰素也能诱导类浆树突细胞(plasmacytoid dendritic cell，pDC)分化为成熟 的抗原呈递细胞。在后天免疫方面，I型的干扰素在CD8⁺细胞毒性T淋巴细 胞的活化、CD4⁺辅助性T淋巴细胞1(T_H1)和CD8⁺细胞毒性T淋巴细胞的存 活、B淋巴细胞分化与增殖上扮演着重要角色。

由于I型的干扰素具有抗病毒、细胞生长调控及免疫调节的能力，目前 已成功的运用于临床治疗上，经美、英、日、德等先进国家批准的适应症包 括：(1)病毒所引起的疾病，例如，慢性B型肝炎、慢性C型肝炎、菜花(尖 头湿疣)、艾滋病患常见的卡波西氏肉瘤(Kaposi′s sarcoma)等；(2)血液疾病， 例如，毛状细胞白血病、慢性骨髓性白血病、多发性骨髓瘤、低级非何杰金 氏淋巴瘤等；(3)其它肿瘤，例如，黑素瘤、肾细胞癌、基底细胞癌等。

目前研究发现，干扰素的产生是由于免疫系统的传令兵Toll样受体 (Toll-like receptor，TLR)活化而诱导其产生。Toll是1988年左右在果蝇体内 先发现的，随后在哺乳动物中也发现与Toll相似度极高的受体，称为Toll 样受体。当外来物入侵时，Toll样受体藉由识别来自病原体的病原体相关分 子图案(pathogen-associated molecular pattern，PAMP)，经信号传导路径，开启 下游基因表达，包括：细胞间素(I型干扰素、IL-1、IL-12、干扰素-α)、化学 趋化物质、MHC及共刺激分子(co-stimulatory molecule)，此外，也可诱导诱 导型氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)及抗微生物肽表达，直 接破坏外来病原体。除了启动先天性免疫第一道防线，Toll样受体还可借着 诱导抗原呈递细胞(例如：树突细胞)成熟，活化后天性免疫反应。当微生物 侵入体内时，树突细胞本身的Toll样受体会识别病原体，再借着MHC分子 将抗原呈递在其表面，进而活化天然的T淋巴细胞，由Toll样受体诱导产生 的IL-12，会进一步使活化的T淋巴细胞分化为Th₁淋巴细胞，启动后天性 免疫反应，协助抵抗慢性病毒感染，达到清除病毒的最终目的，在防御机制 上，提供更强大、更专一的保护。

目前所知的Toll样受体共有10种，分别从Toll样受体1到Toll样受 体10，可以识别各种不同的外来物，包括：细菌、病毒、霉菌及原生动物。 Toll样受体在结构上包含两部分：(1)胞外富含亮氨酸的重复序列(extracellular leucine-rich repeat，LRR)，其负责外来物的识别；(2)胞内Toll-白介素1受体 (intracellular Toll-interleukin-1receptor，TIR)结构域，其与下游的衔接蛋白 (adaptor protein)作用，例如，骨髓分化因子88(myeloid differentiation factor-88， MyD88)、TIR相关蛋白(TIRAP/MAL)、诱导IFN-β的含Toll/IL-1受体结构 域的衔接物(adaptor)(TRIF/TICAM-1)及Toll受体相关分子 (TRAM/TIRP/TICAM-2)，进而活化胞外信号调控的激酶(ERK)、p38、c-Jun N- 末端激酶及NF-kB，诱导促炎细胞因子：IL-1、IL-6、干扰素-α及I型干扰 素产生。

在哺乳动物中，第一个被发现的是Toll样受体4，表达在很多的免疫 细胞上：B淋巴细胞、树突细胞、单核细胞、巨噬细胞、粒细胞及T淋巴细 胞，可以识别许多的外来病毒：呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus， RSV)、C型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)及小鼠乳腺肿瘤病毒(mouse mammary tumor virus，MMTV)，并且借着MyD88与TIRAP的作用，诱导大 量的干扰素产生。

在所有的Toll样受体中，Toll样受体2认识最多种的PAMP，大部分 来自细菌，包括：脂阿拉伯甘露聚糖(lipoarabinomannan，LAM)、脂多糖 (lipopolysaccharide，LPS)、脂磷壁酸(lipoteichoic acid，LTA)、肽聚糖 (peptidoglycan，PGN)及其它的脂蛋白(lipoprotein)、糖脂(glycolipid)、糖蛋白 (glycoprotein)。Toll样受体2也能识别病毒的入侵：麻疹病毒(measles virus， MV)、人类巨细胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)、C型肝炎病毒，在 防御机制上扮演了很重要的角色。

Toll样受体7在免疫细胞：单核细胞、B淋巴细胞及树突细胞中高度表 达，一旦识别出外来物质的入侵后，可以产生非常大量的I型干扰素，特别 是干扰素-α，其在先天性免疫上扮演着重要的关键角色。Toll样受体7主要 是侦测来自病毒的富含G/U的ssRNA，包括：人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)及VSV，在病毒的清除上，有着不可忽视的影 响力。

在药物发展方面，目前已进入临床试验阶段的Toll样受体9拮抗剂， 可以刺激树突细胞产生IL-12及非常高量的干扰素-α，并且诱导B淋巴细胞 增殖及抗体分泌，在干扰素-α治疗失败的HCV病人上有很好的疗效。Toll 样受体7拮抗剂则可产生非常广泛的抗病毒应答(antiviral response)，释放出 多种细胞间素，尤其是干扰素-α，在不同HCV基因型的病人身上有明显的 病毒清除率。

近年来已有多种抗病毒药物被研发出来，并广泛使用于临床的治疗上。 例如：利巴韦林(ribavirin)，其为一种核苷类似物，在实验上可抑制多种病毒 的生长，如呼吸道合胞病毒、流感病毒(influenza virus)、腺病毒(adenovirus)、 HIV及HCV等；金刚烷胺(amantadine)，其作用为抑制流感A病毒的M2膜 蛋白，因而使流感A病毒无法顺利脱去外壳，进而不能进行后续的复制工作； 齐多夫定(zidovudine，AZT)、地达诺新(didanosine，ddI)、扎西他滨(zalcitabine， ddc)、司他夫定(stavudine，d4T)及拉米夫定(lamivudine，3TC)等则可抑制HIV 的逆转录酶，使得病毒的RNA无法反转录成DNA，因而中断DNA的继续 合成。

虽然许多的抗病毒药物陆续被有效使用于临床，但近年来抗药性病毒 也日见浮现。抗药性产生的原因主要是病毒的基因产生突变而使得抗病毒药 物丧失其作用的靶物所致。兹举数例说明如下：HSV的胸苷激酶基因发生突 变，无法将阿昔洛韦(acyclovir)及更昔洛韦(ganciclovir)等在细胞内转化成有 效的成份，因此对该些药物产生抗药性；流感A病毒的M2蛋白基因突变， 则会对金刚烷胺或金刚乙胺(rimantadine)产生抗药性；HIV逆转录酶或蛋白 酶基因的变异亦是导致抗药性产生的主因；HCV的非结构性5A及包膜基因 2-糖蛋白的基因变异会使HCV对干扰素产生抗药性。

现今有越来越多的药物发展，朝着免疫调控的方向迈进，借着刺激宿 主先天性及后天性反应达到清除外来微生物的目的。免疫调节是中草药治疗 的优势，其双向调节(又或是免疫调节)作用主要表现在：对正常机体无明显 影响，而对免疫失调机体却有显著作用者，来纠正机体过低或过亢的免疫状 态，使之重新恢复和维持免疫稳定，既可增强正常机体的免疫能力，又可祛 除致病因素。

中草药保持其天然结构和活性，是经过几千年筛选后，留下来确实有 疗效的药物。

病毒性疾病的种类繁多，例如B型肝炎、C型肝炎、流行性感冒、流 行性腮腺炎、流行性脑膜炎、病毒性肺炎、肠病毒、AIDS病毒等，其致病 性、潜伏期及感染途径多所不同。从临床实验中发现，很多中草药用于治疗 病毒性疾病疗效显著。

例如在美国专利USP 6,787,165中，金银花、连翘的超临界萃取及水萃 与黄芩水萃的萃取物具有抗流感病毒作用；在USP 6,696,094中，由白花蛇 舌草(Hedyotis diffuse)等十四种药材所制备的注射剂和胶囊剂，在五人次临 床试验中显示有抗AIDS病毒的作用；在USP 6,214,350中指出，中药复方 HHT888-4包括金银花、甘草、龙葵等组成，在体外实验中，可抑制人体淋 巴细胞内百分之九十八以上的艾滋病毒活性作用；而在USP 6,426,098中， 姜黄、黄耆、桑寄生、虎杖的中草药萃取物，临床试验显示对于C型肝炎治 疗有显著效果。

此外，中草药亦应用于搭配西药疗程的辅助疗法。例如USP 2003/0211180A1专利中，由大枣等所组成的PHY906，则用于搭配化疗药物 及病毒性疾病治疗上的使用，可以提高治疗效果、增进生活品质及降低毒性 和副作用，已于美国进入第二期临床试验；中国台湾专利I 258,373中指出， 一种C型肝炎辅助治疗药物，由冬虫夏草及黄耆组成，用以搭配C型肝炎 复合疗法(干扰素和利巴韦林)以治疗C型肝炎，其临床试验显示持续病毒清 除率达70％以上，除可以提高治疗效果并降低治疗后的复发率。

更进一步从免疫系统的角度探讨，诱发干扰素的产生，对于治疗病毒 性肝炎有极高度的指标性意义。在世界专利WO 02102395A1中，以夹竹桃 及甘草萃取物以感染小鼠脑脊髓炎病毒(encephalo-myocarditis virus；EMCV) 的人类鳞状癌细胞(HEp-2)进行抗病毒测试，可以有效降低病毒，在体外实 验中也得到诱导干扰素-γ产生的结果。

在人体免疫系统中已知10种Toll样受体，当人体受到体内外病原(病毒、 细菌或霉菌)的威胁时，这些个别TLR将会辨别并启动对应的免疫反应。不同 来源的病原分子会与特定的TLR结合，诱发一连串反应藉以保护细胞免受病 原的侵害。TLR治疗法便是应用TLR对应免疫反应具高度特异性的原理，对 于特定治疗的病症施予刺激物(激动剂)或阻断物(拮抗剂)，经由自身免疫调 控达到治疗病症的效果。而有别于其它应用免疫系统的治疗方法，TLR治疗 法因对于治疗疾病具有高度专一性，除了可以有效并持续抑制病原，还减少 因非专一性活化先天免疫系统所产生的副作用或其它病症。

如日前Coley Pharmaceutical Group公司发展一种TLR治疗药物Actilon， 即以合成的短链寡核苷酸(ODN)调控TLR-9。ODN是类似DNA序列的短链化 合物，其仿照在病原侵入时TLR-9所接受到病原中的CpG结构。TLR-9在被 表达后经免疫系统内一连串的信号传递，可诱发干扰素的产生，以用于治疗 如C型肝炎等的病毒性疾病，目前正在进行Ib期临床试验阶段。另外，Anadys Pharmaceutical公司所发展的ANA245及ANA975(口服剂)，则用以表达 TLR-7，目前已分别进行到Ib期及Ia期临床试验阶段。

此外，在TLR治疗法的研究中，亦有使用天然萃取物进行试验。WO 04093518 A2专利中指出，以紫锥花等草药的Melanin萃取物，进行体外/单 核细胞测试系统(NF-κB/萤光素酶)的试验，可以诱发TLR2及TLR4的表达。

为了克服病毒抗药性的问题，本发明结合多种中草药，发展出复方， 其原理为同时使用作用于相同病毒靶物的多种不同药物或作用在病毒不同 部位的多种药物一起治疗，除有相加或加成效果外，亦可当病毒对其中一种 药物产生抗药性时，仍有另外一种有效的药物存在，可增加治疗的成功率。 加上中草药保持其天然结构和活性，是经过几千年筛选后，留下来确实有疗 效的药物，遂根据其多效性、双向调节、温和无毒性及显著的免疫增强作用 等优势，开发出对病毒疾病有疗效的中草药萃取物。

【发明内容】

本发明的一个实施例，提供一种诱导免疫细胞产生干扰素及活化Toll 样受体的中草药萃取物，由下列原料萃取而成，其原料包括有效量的甘草 (GLYCYRRHIZAE RADIX)、柴胡(BUPLEURI RADIX)以及黄芩 (SCUTELLARIAE RADIX)，其中甘草、柴胡与黄芩的重量比大体介于1～5∶ 1～5∶1～5或1～2∶1～2∶1～2。

甘草包括生甘草或炙甘草。柴胡包括北柴胡或高氏柴胡。黄芩包括枯 黄芩或条黄芩。

本发明中草药萃取物原料还包括五味子(SCHISANDRAE FRUCTUS)及 芍药(PAEONIAE RUBRA RADIX)。甘草、柴胡、黄芩、五味子与芍药的重量 比大体介于1～5∶1～5∶1～5∶1～3∶1～3或1～2∶1～2∶1～2∶1～2∶1～2。五味 子包括北五味子或南五味子。芍药包括赤芍、白芍或牡丹。

本发明中草药萃取物活化多种Toll样受体，包括Toll样受体2、Toll 样受体4或Toll样受体7。

本发明中草药萃取物可强化免疫调控，用于治疗病毒感染性疾病。

本发明的另一个实施例，提供一种诱导免疫细胞产生干扰素及活化Toll 样受体的中草药萃取物的制备方法，包括：提供包含有效量甘草、柴胡及黄 芩的中草药组合物，其中甘草、柴胡与黄芩的重量比大体介于1～5∶1～5∶ 1～5或1～2∶1～2∶1～2；以溶剂萃取该中草药组合物，以获得萃取液；浓缩 该萃取液，以获得浓缩产物；对该浓缩产物进行干燥；加入赋形剂进行调方； 以及制作成特定剂型。

该有效量甘草、柴胡及黄芩的中草药组合物还包括五味子及芍药。甘 草、柴胡、黄芩、五味子与芍药的重量比大体介于1～5∶1～5∶1～5∶1～3∶ 1～3或1～2∶1～2∶1～2∶1～2∶1～2。五味子包括北五味子或南五味子。芍药 包括赤芍、白芍或牡丹。

该溶剂包括水或浓度0.1-95％的乙醇，且该溶剂与该中草药组合物的重 量比大体介于6∶1～10∶1。该浓缩产物的固体含量大体介于10-30％。本发 明干燥方法包括真空干燥、冷冻干燥、喷雾干燥或流动床干燥。该赋形剂包 括淀粉、麦芽糖、乳糖、蔗糖、木糖醇、硬酯酸镁、二氧化硅、微晶纤维素、 羧甲基纤维素或滑石粉。制作成的该特定剂型包括胶囊剂、锭剂、散剂或液 剂。

为让本发明的上述目的、特征及优点能更明显易懂，下文特举其实施 例，并配合所附图式，作详细说明如下：

【图式简单说明】

第1A图为本发明中草药萃取物对嗜中性白细胞的细胞毒性。

第1B图为本发明中草药萃取物对T淋巴细胞的细胞毒性。

第2A图显示本发明中草药萃取物可促进天然杀伤细胞及T淋巴细胞表 达IFN-γ。

第2B图显示本发明中草药萃取物可促进天然杀伤细胞表达IFN-α。

第2C图显示本发明中草药萃取物可促进及T淋巴细胞表达IFN-α。

第3图显示本发明中草药萃取物可促进活体动物表达IFN-γ。

第4A～4I图显示本发明中草药萃取物对PBMC/T细胞的Toll样受体 (TLR)表达的影响。

第5A～5I图显示本发明中草药萃取物对PBMC/T细胞的Toll样受体 (TLR)表达的影响。

第6A～6I图显示本发明中草药萃取物对PBMC/T细胞的Toll样受体 (TLR)表达的影响。

第7A～7I图显示本发明中草药萃取物对PBMC/T细胞的Toll样受体 (TLR)表达的影响。

第8A～8I图显示本发明中草药萃取物对PBMC/T细胞的Toll样受体 (TLR)表达的影响。

第9A～9I图显示本发明中草药萃取物对PBMC/T细胞的Toll样受体 (TLR)表达的影响。

第10A～10I图显示本发明中草药萃取物对PBMC/T细胞的Toll样受体 (TLR)表达的影响。

第11A～11I图显示本发明中草药萃取物对PBMC/T细胞的Toll样受体 (TLR)表达的影响。

【实施方式】

本发明的一个实施例，提供一种诱导免疫细胞产生干扰素及活化Toll 样受体的中草药萃取物，由下列原料萃取而成，其原料包括有效量的甘草、 柴胡以及黄芩。

中草药萃取物原料中，甘草、柴胡与黄芩的重量比大体介于1～5∶1～5∶ 1～5或1～2∶1～2∶1～2。

上述中草药萃取物原料还包括五味子及芍药。甘草、柴胡、黄芩、五 味子与芍药的重量比大体介于1～5∶1～5∶1～5∶1～3∶1～3或1～2∶1～2∶1～2∶ 1～2∶1～2。

甘草可包含生甘草或炙甘草。柴胡可包含北柴胡或高氏柴胡。黄芩可 包含枯黄芩或条黄芩。五味子可包含北五味子或南五味子。芍药可包含赤芍、 白芍或牡丹。

上述中草药萃取物可活化多种Toll样受体，例如Toll样受体2、Toll 样受体4及Toll样受体7。

本发明的另一个实施例，提供一种诱导免疫细胞产生干扰素及活化Toll 样受体的中草药萃取物的制备方法，包括下列步骤。首先，提供包含有效量 甘草、柴胡及黄芩的中草药组合物。甘草、柴胡与黄芩的重量比大体介于1～5∶ 1～5∶1～5或1～2∶1～2∶1～2。之后，以溶剂萃取中草药组合物，以获得萃取 液。使用的溶剂可包括水或浓度0.1-95％的乙醇，其与中草药组合物的重量 比大体介于6∶1～10∶1。接着，浓缩萃取液，以获得浓缩产物。浓缩产物的 固体含量大体介于10-30％。之后，对浓缩产物进行干燥。对浓缩产物进行 干燥的方法可包括真空干燥、冷冻干燥、喷雾干燥或流动床干燥。接着，加 入赋形剂进行调方。添加的赋形剂可包括淀粉、麦芽糖、乳糖、蔗糖、木糖 醇、硬酯酸镁、二氧化硅、微晶纤维素、羧甲基纤维素或滑石粉。最后，制 作成例如胶囊剂、锭剂、散剂或液剂的特定剂型。

取上述若干重量百分比的柴胡、甘草、黄芩、北五味子及赤芍等五方 药材为原料，并以重量比6至10倍的0.1-95％乙醇进行一次或多次萃取。接 着，进行浓缩，浓缩终点的固体含量控制在10-30％之间。接着，添加萃取 物含量0-100％的赋形剂，并进行浓缩混合液的冷冻干燥，所得干品的含水 量控制在2-10％之间，并研磨得粉末的粒径大小控制低于35网目以下。最 后，将中草药萃取物的干品粉末充填于硬胶囊中，每颗胶囊剂的充填量相当 约1.35±0.09克药材，其药材浓缩比为2-3倍。

本发明以嗜中性细胞(neutrophil)、T淋巴细胞及天然杀伤细胞为测试主 体，观察干扰素产出及Toll样受体2、Toll样受体4、Toll样受体7表达， 作为药物筛选的依据。

【实施例】

本发明中草药萃取物的制备

【实施例1】

分别取黄芩4千克、北柴胡4千克、甘草4千克、芍药4千克、北五味 子4千克(药材重量比1∶1∶1∶1∶1)，及30％乙醇溶液200千克，以回流 装置加热萃取1小时，共进行二萃。所得的萃取液以100目筛网进行过滤， 再经减压浓缩，浓缩终点的固体含率控制约为15％。接着添加2千克麦芽糖 糊精并进行冷冻干燥。所得干品粉末的粒径大小控制低于35网目以下，并 混入120克二氧化硅及60克硬脂酸镁。最后，将干品混合粉末充填于第0 号硬胶囊中，所得每颗胶囊剂的充填量为565±40毫克，相当约1.35±0.09克 药材。

【实施例2】

分别取黄芩2.5克、北柴胡2.5克、甘草2.5克、芍药7.5克、北五味 子7.5克(药材重量比1∶1∶1∶3∶3)，及30％乙醇溶液250克，以回流装置 加热萃取1小时，共进行二萃。所得的萃取液以100目筛网进行过滤，再经 减压浓缩后进行冷冻干燥，得干燥粉末。

【实施例3】

分别取黄芩12.5克、北柴胡6.25克、甘草6.25克(药材重量比2∶1∶ 1)，及30％乙醇溶液250克，以回流装置加热萃取1小时，共进行二萃。所 得的萃取液以100目筛网进行过滤，再经减压浓缩后进行冷冻干燥，得干燥 粉末。

【实施例4】

分别取黄芩6.25克、北柴胡12.5克、甘草6.25克(药材重量比1∶2∶ 1)，及30％乙醇溶液250克，以回流装置加热萃取1小时，共进行二萃。所 得的萃取液以100目筛网进行过滤，再经减压浓缩后进行冷冻干燥，得干燥 粉末。

【实施例5】

分别取黄芩6.25克、北柴胡6.25克、甘草12.5克(药材重量比1∶1∶ 2)，及30％乙醇溶液250克，以回流装置加热萃取1小时，共进行二萃。所 得的萃取液以100目筛网进行过滤，再经减压浓缩后进行冷冻干燥，得干燥 粉末。

【实施例6】

分别取黄芩5克、北柴胡5克、甘草5克、芍药5克、北五味子5克(药 材重量比1∶1∶1∶1∶1)，及纯水250克，以回流装置加热萃取1小时，共 进行二萃。所得的萃取液以100目筛网进行过滤，再经减压浓缩后进行冷冻 干燥，得干燥粉末。

【实施例7】

分别取黄芩5克、北柴胡5克、甘草5克、芍药5克、北五味子5克(药 材重量比1∶1∶1∶1∶1)，及50％乙醇溶液250克，以回流装置加热萃取1 小时，共进行二萃。所得的萃取液以100目筛网进行过滤，再经减压浓缩后 进行冷冻干燥，得干燥粉末。

【实施例8】

分别取黄芩5克、北柴胡5克、甘草5克、芍药5克、北五味子5克(药 材重量比1∶1∶1∶1∶1)，及95％乙醇溶液250克，以回流装置加热萃取1 小时，共进行二萃。所得的萃取液以100目筛网进行过滤，再经减压浓缩后 进行冷冻干燥，得干燥粉末。

本发明中草药萃取物对嗜中性细胞及T淋巴细胞的细胞毒性

【实施例9】

首先，将细胞接种于96孔的平板中。然后，加入本中草药萃取物(由实 施例1所制备)，再加入10μl的Alamar blue染料，置于37℃培养箱达16小 时，测量其在570nm及600nm的吸光值。其结果如第1A及1B所示，中草 药萃取物对嗜中性细胞及T淋巴细胞并无明显的细胞毒性。

本发明中草药萃取物诱导免疫细胞表面产生干扰素的试验

【实施例10】

首先，取外周血分离的T淋巴细胞及天然杀伤细胞细胞株(NK92)。加 入本中草药萃取物(由实施例1所制备)24小时后，收取上层液，并以ELISA 测定干扰素含量。结果显示随着中草药萃取物浓度的增加，其干扰素-γ表达 量也会随之增加而呈现剂量效应，如第2A图所示。而这样的现象，无论在 T淋巴细胞及天然杀伤细胞株(NK92)皆有相类似的趋势。此外以PC-IL-12 为正对照组并以相同方式测定干扰素-α含量，结果显示中草药萃取物在 100μg/ml就可以诱导天然杀伤细胞株(NK92)产生较高的干扰素-α，而以外周 血分离的T淋巴细胞为系统进行诱导试验发现在250-1000μg/ml可显著诱导 出干扰素-α，如第2B及2C图所示。

【实施例11】

取本发明中草药萃取物(由实施例3所制备)进行干扰素-γ诱导活性测 试。结果显示，样品浓度在500ug/ml可诱导免疫细胞产生干扰素-γ达 94.3±15.7pg/ml(以IL-12做为正对照组，在40ng/ml的浓度下可诱导免疫细 胞产生干扰素-γ达50±2.04pg/ml)。

【实施例12】

取本发明中草药萃取物(由实施例5所制备)进行干扰素-γ诱导活性测 试。结果显示，样品浓度在500ug/ml可诱导免疫细胞产生干扰素-γ达 129.1±8.5pg/ml(以IL-12做为正对照组，在40ng/ml的浓度下可诱导免疫细 胞产生干扰素-γ达50±2.04pg/ml)。

【实施例13】

取本发明中草药萃取物(由实施例6所制备)进行干扰素-γ诱导活性测 试。结果显示，样品浓度在1,000ug/ml可诱导免疫细胞产生干扰素-γ达 95.2±15.7pg/ml(以IL-12做为正对照组，在40ng/ml的浓度下可诱导免疫细 胞产生干扰素-γ达50±2.04pg/ml)。

【实施例14】

取本发明中草药萃取物(由实施例7所制备)进行干扰素-γ诱导活性测 试。结果显示，样品浓度在1,000ug/ml可诱导免疫细胞产生干扰素-γ达 1563.6±44.9pg/ml(以IL-12做为正对照组，在40ng/ml的浓度下可诱导免疫 细胞产生干扰素-γ达50±2.04pg/ml)。

【实施例15】

取若干干品(由实施例8所制备)进行干扰素-γ诱导活性测试。结果显示， 样品浓度在500ug/ml可诱导免疫细胞产生干扰素-γ达80.2±24.6pg/ml(以 IL-12做为正对照组，在40ng/ml的浓度下可诱导免疫细胞产生干扰素-γ达 50±2.04pg/ml)。

本发明中草药萃取物诱导大鼠产生干扰素的试验

【实施例16】

取本发明中草药萃取物(由实施例1所制备)进行活体内干扰素-γ诱导活 性试验。将连续喂食28天的Wistar大鼠：对照组(水)、媒介组(喂食中草药 萃取物5g/kg)及高剂量组(喂食中草药萃取物10g/kg)，于第29天抽血测定血 中IFNγ产生情形。结果显示，本中草药萃取物可以明显诱导动物体内的IFNγ 的产生，且在雌性大鼠中有更优异的表达。如第3图所示。

本发明中草药萃取物对PBMC/T细胞的Toll样受体(TLR)表达的影响

【实施例17】

取若干本发明中草药萃取物(由实施例1所制备)进行TLR2、TLR4及 TLR7的活性表达测试。利用TLR2、TLR4及TLR7抗体进行细胞表面标记 染色后，直接以荧光流体技术仪(FACS)分析之。结果显示，在低剂量250ug/ml 时不论TLR2、TLR4或TLR7皆可诱导75％以上的表达。请参阅第4A～4I 图。

【实施例18】

取本发明中草药萃取物(由实施例2所制备)进行TLR2、TLR4及TLR7 的活性表达测试。结果请参阅第5A～5I图所示，当测试浓度在500ug/ml时， 可诱导65％以上的TLR表达。

【实施例19】

取本发明中草药萃取物(由实施例3所制备)进行TLR2、TLR4及TLR7 的活性表达测试。结果请参阅第6A～6I图所示，当测试浓度在低剂量 250ug/ml即可诱导60％以上的TLR表达。

【实施例20】

取本发明中草药萃取物(由实施例4所制备)进行TLR2、TLR4及TLR7 的活性表达测试。结果请参阅第7A～7I图。当测试浓度在低剂量250ug/ml 时，即可诱导85％以上的TLR表达。

【实施例21】

取本发明中草药萃取物(由实施例5所制备)进行TLR2、TLR4及TLR7 的活性表达测试，结果请参阅第8A～8I图。当测试浓度在低剂量250ug/ml 时，即可诱导80％以上的TLR表达。

【实施例22】

取本发明中草药萃取物(由实施例6所制备)进行TLR2、TLR4及TLR7 的活性表达测试，结果请参阅第9A～9I图所示，当测试浓度在低剂量 250ug/ml时，即可诱导85％以上的TLR表达。

【实施例23】

取本发明中草药萃取物(由实施例7所制备)进行TLR2、TLR4及TLR7 的活性表达测试，结果请参阅第10A～10I图，当测试浓度在低剂量250ug/ml 时，即可诱导94％以上的TLR表达。

【实施例24】

取本发明中草药萃取物(由实施例8所制备)进行TLR2、TLR4及TLR7 的活性表达测试，结果请参阅第11A～11I图，当测试浓度在低剂量250ug/ml 时，即可诱导75％以上的TLR高度表达。

虽然本发明已以其实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何 熟习此项技术者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作更动与润饰，因 此本发明的保护范围当视所附的权利要求所界定者为准。