瑞香狼毒中2－甲基－5－异丙基苯酚在农药中的应用

摘要

本发明属于农药技术领域，特别涉及瑞香狼毒中2－甲基－5－异丙基苯酚在农药中的应用。本发明所要解决的技术问题是提供2－甲基－5－异丙基苯酚在农药中的应用，本发明通过生物活性测定表明2－甲基－5－异丙基苯酚对蚕豆蚜和粘虫24小时的LC

说明书

技术领域

本发明属于农药技术领域，特别涉及瑞香狼毒中2-甲基-5-异丙基苯酚在农药中的应用。

背景技术

蚕豆蚜(Aphis craccivaro)是蚜虫(Aphid)中的一种，属于半翅目；粘虫(Leucania separata)属于鳞翅目，夜蛾科，分布于全国各地，寄主为麦、稻、粟、玉米等禾谷类粮食作物及棉花、豆类、蔬菜等16科104种植物上。其危害特点是：幼虫食叶，可将作物叶片全部食光，造成严重损失。因其具有群聚性、迁飞性、杂食性、暴食性，已成为全国性重要农业害虫。

瑞香狼毒(Stellera chamaejasme L.)为瑞香科狼毒属植物，又名狼毒、断肠草，广泛分布于我国西北、西南等高原草地，是一种重要的多年生有毒草本植物，对畜牧业的发展和草原保护有着严重的危害，是需要防除的对象。另一方面，瑞香狼毒根对某些疾病如结肠癌和胃癌有一定的治疗效果。最新研究还发现它具有抗病毒特别是HIV病毒的作用，对某些害虫也有一定的毒杀活性。因此，国内外研究人员对瑞香狼毒的化学成分和生物活性进行了广泛而深入的研究并从中分离和鉴定了多种成分。到目前为止，分离得到的物质主要包括下列四类：(1)黄酮类；(2)香豆素类；(3)二萜类；(4)木脂素类，但未见有分离出2-甲基-5-异丙基苯酚(香芹酚)的报道。

近年来，对瑞香狼毒的杀虫活性进行了广泛的研究并申请了不少的专利。张杰克等(专利申请号02133769.1)发明的狼毒素水乳剂对蚜虫和粘虫等有较好的毒杀效果，但该制剂的杀虫活性成分为新狼毒素A。刘世贵等(专利申请号02133971.6)发明的狼毒酮杀虫剂对多种害虫有较好的毒杀效果，但其有效成分为狼毒素B。侯太平等(专利申请号200510021333.3)公开了1，5-二苯基-3-羟基-1-戊酮和4-羟基倍半萜烯丙酯的杀虫活性，但其作用靶标为菜青虫。韩明理(专利申请号02100771.3)发明的狼毒素杀虫剂虽对禾谷缢管蚜、小菜蛾、菜青虫、桃蚜等害虫均有较好的毒杀活性，但其活性成分不清楚，因而不利于活性成分的人工合成和杀虫机理的研究，也不利于制剂的质量控制。

香芹酚广泛存在于天然植物的精油中，可以用分离提取的方法得到，也可以化学合成获得。它不仅可以用于食品中作香料，还具有防霉、抗菌、杀菌、抗氧化等作用，例如，R·罗萨(专利号ZL00807423.2)发明了含有香芹酚和麝香草酚的杀菌组合物，但到目前为止仍未见有香芹酚对蚕豆蚜和粘虫具有毒杀活性的报道。

发明内容

本发明所要解决的第一个技术问题是提供瑞香狼毒中2-甲基-5-异丙基苯酚在农药中的应用。

本发明通过生物活性测定结果表明2-甲基-5-异丙基苯酚对蚕豆蚜和粘虫24小时的LC₅₀分别为16.8mg·L^-1和12.7mg·L^-1，均具有较好的毒杀活性。

进一步的，本发明还提供了瑞香狼毒中2甲基5异丙基苯酚在制备杀灭蚕豆蚜的药剂中的用途，药剂中2-甲基-5-异丙基苯酚的浓度范围为50～200mg·L^-1(害虫的死亡率在80％以上)。以及瑞香狼毒中2-甲基-5-异丙基苯酚在制备杀灭粘虫的药剂中的用途，药剂中2-甲基-5-异丙基苯酚的浓度范围为50～100mg·L^-1(害虫的死亡率在80％以上)。

本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种杀虫剂，它是以2-甲基-5-异丙基苯酚为活性成分制备而成的，杀虫剂中2-甲基-5-异丙基苯酚的浓度范围为50~200mg·L^-1(害虫的死亡率在80％以上)。

本发明的2-甲基-5-异丙基苯酚结构简单，化学合成容易，可以通过市场购买获得，是一种新型、高效、低毒、对非靶标生物安全的杀虫剂活性成分。

附图说明

图1瑞香狼毒根中杀虫活性成分的分离纯化流程图

图2 2-甲基-5-异丙基苯酚的HPLC图谱

具体实施方式

本发明以蚕豆蚜为靶标，采用生物活性跟踪法分离得到了一个对蚕豆蚜和粘虫均有较好毒杀活性的天然产物-香芹酚，这是一种从天然植物中发现具有杀虫活性物质的行之有效的方法(如图1所示)。具体为将狼毒根粉置于索氏提取器中，加8倍样品量的石油醚(60～90℃)，在70℃下提取8小时，减压过滤并浓缩滤液得粗提物，然后对粗提物进行大柱初分，得到7个活性馏分，再对杀毒活性最高的馏分(F₃)进行中柱细分又得到4个活性馏分，然后对毒杀活性最高的馏分(F₃₂)进行反相硅胶柱分离得到了一个纯化合物，再对其进行结构鉴定和杀虫谱测定。在整个分离纯化过程中，以蚕豆蚜为靶标对粗提物和柱层析得到的各馏分进行毒力测定。

以下结合实施例对本发明作进一步的阐述。实施例仅用于说明本发明，而不是以任何方式来限制本发明。

实施例12-甲基-5-异丙基苯酚的提取

(1)将瑞香狼毒根洗净，切成碎片，放入鼓风式烘箱内于60℃下烘2天，用粉碎机粉碎成粉末，保存于冰箱内备用。

(2)将步骤(1)制得的的瑞香狼毒根粉置于索氏提取器中，加入8倍重量的石油醚(60～90℃)，于70℃提取8小时，减压过滤并浓缩滤液至半固体状，得粗提物。

(3)大柱粗分

柱径：6cm；柱高：40cm；固定相为硅胶H(200～300目)；流动相为石油醚-乙酸乙酯(体积比为5∶1和1∶1)；用石油醚常规湿法装柱。以粗提物为分离样品，每次上样量10g，流速10ml·min^-1，梯度洗脱(体积比为5∶1的石油醚-乙酸乙酯流动相用量约为2000ml，体积比为1∶1的石油醚-乙酸乙酯流动相用量约为1500ml)，每段收集100ml，经薄层检测后合并相同的馏分，以蚕豆蚜为靶标进行生物活性测定得到7个具有杀虫活性馏分F₁～F₇。杀虫活性最强的馏分F₃作进一步的分离提纯。

(4)中柱细分

柱径：3cm；柱高：40cm；固定相为硅胶H；流动相为乙酸乙酯-甲醇(体积比为8∶1和1∶1)；用乙酸乙酯常规湿法装柱。以步骤(3)收得的F₃馏分为分离样品，上样量6g，流速10ml·min^-1，梯度洗脱(体积比为8∶1的乙酸乙酯-甲醇流动相用量为1500～2000ml，体积比为1∶1的乙酸乙酯-甲醇流动相用量为1500～2000ml)，每段收集100ml，经薄层检测后合并相同的馏分，以蚕豆蚜为靶标进行生物活性测定得到4个具有杀虫活性的馏分。杀虫活性最强的馏分F₃₂作进一步的分离提纯。

(5)反相硅胶柱分离

柱径：2cm；柱高：30cm；固定相为反相硅胶Lichroprep？RP-18；流动相为甲醇-水(体积比为4∶1)；用水常规湿法装柱。以步骤(4)收得的F₃₂馏分为分离样品，上样量2g，流速5ml·min^-1，每段收集100ml，经薄层检测后合并相同的馏分，以蚕豆蚜为靶标进行生物活性测定，杀虫活性最强的馏分浓缩后得到的产品为淡黄色液体，溶于二甲亚砜、甲醇、乙醇等溶剂。产品检测数据如下：

HPLC图谱结果如图2所示，测定方法采用Shimadzu LC-20A高效液相色谱仪；色谱柱：Diamonsil C₁₈(4.6X250mm，5mm)；流动相：甲醇-水(体积比)：4∶1；检测波长：276nm；柱温：25℃；流速：0.8ml·min^-1；进样量：10^ml。

EI-MS(70eV)m/z：150(M⁺)，135，117，107，91，77，65，51；

HRMS：Calcd.for C₁₀H₁₄O 150.1045，Found 150.1039；

UV(CH₃OH)l_max：276nm；

IR(液膜)n_max(cm^-1)：3388，3022，2960，2870，1622，1589，1523，1459，1383，1363，1253，1175，866，813；

¹H NMR(DMSO，600MHz)^d(ppm)：1.14(6H，d，J＝6.90Hz，H-8，H-9)，2.07(3H，s，H-10)，2.72(1H，m，H-7)，6.54(1H，dd，J＝7.68Hz，1.62Hz，H-4)，6.65(1H，d，J＝1.62Hz，H-6)，6.91(1H，d，J＝7.68Hz，H-3)，9.00(1H，s，OH)；

¹³C NMR(DMSO，600MHz)d(ppm)：16.0(1C，C-10)，24.4(2C，C-8，C-9)，33.5(1C，C-7)，113.0(1C，C-6)，117.1(1C，C-4)，121.4(1C，C-2)，130.7(1C，C-3)，147.4(1C，C-5)，155.7(1C，C-1)。

分析上述实验数据可知，EI-MS给出了分子离子峰M⁺为150，经高分辨质谱推断其化学式为C₁₀H₁₄O。

紫外吸收光谱λ_max：276nm，表明可能有苯环或共轭体系存在。

红外光谱中，3388cm^-1出现强而宽的吸收峰表明有羟基存在；2960和2870cm^-1表示有甲基或亚甲基存在；3022、1622、1589、1523及1459cm^-1的同时出现表示有苯环存在；1383cm^-1表示有甲基存在；1363、1253和1175cm^-1表示有醇或酚存在；866和813cm^-1表示为1，2，4-三取代苯环。

¹H NMR谱中，d 6.91为3位上的H，它和4位上的H相互偶合裂分为二重峰，偶合常数为7.68Hz；d 6.54为4位上的H，它和3、6位上的H相互偶合裂分为两个二重峰，偶合常数分别为7.68Hz和1.62Hz；d 6.65为6位上的H，它和4位上的H相互偶合裂分为二重峰，偶合常数为1.62Hz；d 2.72为7位上的H，它和8、9位上的6个H相互偶合裂分为多重峰；d 1.14为8、9位上的6个H，它们和7位上的H相互偶合裂分为二重峰，偶合常数为6.90Hz；d 2.07为10位上的3个H；d 9.00为羟基上的H。

¹³C NMR谱中有9个不同的吸收蜂，表明有9种不同化学环境的碳存在，与高分辨质谱测得的化学式相比较说明其中有两个碳是相同的。

上述实验数据与2-甲基-5-异丙基苯酚的文献值进行了对比，结果基本一致，因此本实施例分离得到的杀虫活性最强的馏分为2-甲基-5-异丙基苯酚，结构如图2所示：

本实施例步骤(3)、(4)分离纯化过程中各馏分对蚕豆蚜的毒力测定

分别将各馏分浓缩后溶解于二甲亚砜，然后每个馏分用重量百分比浓度为0.1％的吐温80水溶液稀释成5种不同浓度的待测溶液。并以空白溶剂为阴性对照。

采集虫口密度大的蚕豆叶，仔细挑选使健康的无翅成蚜(30～50头)留在叶面上，分别将带虫的蚕豆叶浸入待测溶液5s后拿开，沥干，将叶上的蚕豆蚜转入装有新鲜蚕豆叶的培养皿中，放置在温度为22～24℃，相对湿度为60％，光照时间为14∶10h的实验室中继续饲养，24h后记录死亡情况，每一浓度的待测溶液重复实验3次并按Abbott公式对死亡率进行校正。测定结果如表1所示：

表1瑞香狼毒石油醚粗提物及其柱层析各馏分对蚕豆蚜的毒杀活性

表1内数据为3次重复并按Abbott公式校正后的平均值。

实施例22-甲基-5-异丙基苯酚对蚕豆蚜的毒力测定

以超高效杀虫剂吡虫啉为对照，按实施例1所述的毒力测定方法分别对2-甲基-5-异丙基苯酚和吡虫啉进行蚕豆蚜室内毒力测定，再根据几率值分析法，采用SPSS软件计算LC₅₀值及其置信区间，并求出相关系数和毒力回归方程，结果见表2(本实施例所用的2-甲基-5-异丙基苯酚可以是市场购买所得，也可以通过实施例1记载的方法制得)。

表22-甲基-5-异丙基苯酚对蚕豆蚜的毒杀活性

表2中死亡率的数值为3次重复测定并按Abbott公式校正后的平均值。

表2中的数据显示，2-甲基-5-异丙基苯酚对蚕豆蚜有较好的毒杀活性，其LC₅₀值为16.8mg·L^-1，而且浓度与药效间存在着显著的相关关系，其相关系数为0.9847。卡方(^c2＝3.225，df＝3，P＞0.05)检验表明测定结果是可靠的。

另外，实验中观察到蚕豆叶浸入药液后并未显示出任何异常，这表明2-甲基-5-异丙基苯酚对其没有药害。

实施例32-甲基-5-异丙基苯酚对粘虫的毒力测定

以高效氯氰菊酯为对照，分别将2-甲基-5-异丙基苯酚、高效氯氰菊酯溶解于二甲亚砜并用重量百分比为0.1％吐温-80的水溶液稀释成5种不同浓度的待测溶液。将玉米叶片剪成2X5cm的小段，在待测溶液中浸5s后拿开，沥干后放入底部铺有滤纸的培养皿(6cm)中，接入10头3龄幼虫，再将培养皿放置在温度为22～24℃，相对湿度为60％，光照时间为14∶10h的实验室中继续饲养，24h后记录死亡情况，每个浓度的待测溶液重复实验3次(本实施例所用的2-甲基-5-异丙基苯酚可以是市场购买所得，也可以通过实施例1记载的方法制得)。

按Abbott公式对死亡率进行校正，再根据几率值分析法，采用SPSS软件计算LC₅₀值及其置信区间，并求出相关系数和毒力回归方程，结果如表3所示。

表32-甲基-5-异丙基苯酚对粘虫的毒杀活性

表中死亡率的数值为3次重复并按Abbott公式校正后的平均值。

表3结果显示，2-甲基-5-异丙基苯酚对粘虫有较好的毒杀活性，其LC₅₀值为12.7mg·L^-1，而且浓度与药效间存在着显著的相关关系，其相关系数为0.9930。卡方(^c2＝1.761，df＝3，P＞0.05)检验表明测定结果是可靠的。

另外，实验中观察到玉米叶浸入药液后并未显示出任何异常，这表明2-甲基-5-异丙基苯酚对其没有药害。