小鼠FcγRⅢ线性配体结合表位

摘要

本发明涉及小鼠mFcγRIII线性配体结合表位，该表位的氨基酸序列为Cys Ser Phe PheHis Asn Glu Lys Ser Val Arg Tyr His。本发明以化学合成多肽分析鉴定小鼠FcγRIII的线性配体结合表位，进行了多肽对小鼠IgG－可溶性受体结合的抑制，表明线性表位多肽对小鼠FcγRIII亲和小鼠IgG显现出良好的抑制功效；通过多肽对小鼠IgG－细胞表面受体结合的抑制，用玫瑰花环抑制试验检测本发明多肽对小鼠IgG－细胞表面受体结合的抑制效果，其IgG－RBC玫瑰花环形成率可达95％。本发明首次开展的小鼠FcR线性配体结合表位的探索研究，用合成肽方法精确定位了小鼠FcγRIII配体结合表位，构建了小鼠FcγRIII、γ－chain共转染稳定表达细胞系，对深入了解FcγR－IgG相互作用的分子基础有重要意义，为小鼠FcR靶标药物的分子设计提供新的思路。

说明书

一.技术领域：

本发明涉及分子生物学、免疫学和生物信息学领域，特别是涉及小鼠FcγR III(Fc GammaReceptor III)线性配体结合表位。

二.背景技术：

Fc受体(FcR)为特异亲和免疫球蛋白(Ig)Fc片段的细胞表面分子，小鼠FcγR有四种类型，分别为FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、FcγRIII(CD16)和FcγRIV，其胞外区结构相似，均含有两个(FcγRII和FcγRIII)或三个(FcγRI)Ig样结构域，属Ig超基因家族，而跨膜区和胞内区则存在明显差异。FcγRIII是高度糖基化膜蛋白，为中低亲和力IgG受体，在生理条件下只能结合IgG复合物或多聚体。moFcγRIII胞内区与FcRγ链二聚体、T细胞受体(T cell receptor，TCR)ζ链二聚体或FcRγ链-TCRζ链异源二聚体相连，通过这些亚基的ITAM基序进行信号转导，FcRγ链或TCRζ链为FcγRIII在细胞表面表达所必需，只有通过共转染FcRγ链或TCRζ链，才能在细胞表面表达FcγRIII。γ-chain具有信号传导功能，通过二硫键与FcγRIII结合，介导FcγRIII的表达。

Fc受体广泛表达于免疫辅助细胞和效应细胞，具有许多重要的生理功能，是体液免疫与细胞免疫的联系纽带，在机体免疫调节中起关键作用。抗体介导的炎性反应可通过激活型和抑制型FcR进行调节，因此FcR是治疗过敏和自身免疫性疾病理想的药物靶标。根据FcγR功能的不同，提高或降低FcγR-IgG结合的亲和力可以达到相应的FcγR免疫治疗目的。激活型受体的胞内区(FcγRIIA)或者FcRγ链(FcγRI、FcγRIII、boFcγ2R、moFcγRIV、FcαRI和FcεRI)含有基于酪氨酸的受体活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM)，能激活免疫效应细胞，诱导吞噬作用(phagocytosis)、抗体依赖细胞毒作用(antibody-dependentcellular cytotoxicity，ADCC)、补体依赖细胞毒作用(complement-dependent cellularcytotoxicity，CDCC)、细胞裂解(cytolysis)、分泌细胞因子和其它炎性因子以及调节淋巴细胞增殖和分化等多种免疫学效应。可溶性FcγR重组蛋白在体外可阻断免疫复合物与B细胞的结合，因此在体内可与免疫细胞表面FcγR竞争结合IgG，抑制免疫复合物对细胞的激活；同理，高剂量的非特异IgG也可与体内免疫复合物竞争结合表达FcγR的免疫细胞，静脉内免疫球蛋白治疗方法(intravenous immunoglobulin therapy，IVIG)已应用于血小板减少(immunethrombocytopenic purpuria，ITP)、全身性红斑狼疮(systemic lupus erythematodes，SLE)和多组织硬化(multiple sclerosis，MS)等疾病的免疫治疗。IgG Fc-FcγRIII晶体结构的解析以及对信号转导机制的了解为发现新的特异、高效药靶提供了更多的信息和途径，人们利用肽库筛选、组合化学(combinatorial chemistry)、生物信息学以及合成多肽等筛选和鉴定了多种IgGFc片段的抑制性多肽，其中抑制Fc-FcγR结合的TG19320三肽四聚体在小鼠体内显现对肾小球肾炎良好的抑制功效。Medgyesi等在人IgG1 Fc片段中鉴定了诱导细胞信号传导的功能性多肽，来源于CH2区Pro234-Ser298的多肽与细胞表面FcγRIIB特异结合，可诱导细胞分泌细胞因子和ERK的磷酸化，并能抑制BCR介导的Ca²⁺反应。然而，小分子多肽对受体的亲和力远远低于完整的抗体分子，多肽亲和力的提高等问题尚有待解决。

三.发明内容：

本发明要解决的主要技术问题是：提供一种小鼠FcγRIII线性配体结合表位，为鉴定本发明的多肽在体外的抑制活性，分别进行了多肽对小鼠IgG-可溶性受体结合的抑制和小鼠IgG-细胞表面受体结合的抑制，表明线性表位多肽对小鼠FcγRIII亲和小鼠IgG显现出良好的抑制功效。

本发明的技术方案是：

利用DNASIS软件将mFcγRIII与boFcγRIII和huFcγRIII的氨基酸序列进行比对分析，并参照huFcγRIII的晶体结构，在EC2结构域设计合成小鼠FcγRIII多肽6条，Dot-blot分析表明，小鼠FcγRIII的119-130位多肽为CSFFHNEKSVRYH，该多肽是特异结合小鼠IgG的有效多肽，为小鼠FcγRIII的线性配体结合表位，位于受体EC2结构域CC′环。

本发明的小鼠FcγRIII受体线性配体结合表位的氨基酸序列为：

H-Cys-Ser-Phe-Phe-His-Asn-Glu-Lys-Ser-Val-Arg-Tyr-His-OH。

所述的线性配体结合表位为合成多肽。

所述的线性配体结合表位多肽链N端氨基化或乙酰化，或C端羧基化或酰胺化。

编码所述的小鼠FcγRIII受体线性配体结合表位的核苷酸序列。

为鉴定本发明的多肽在体外的抑制活性，分别进行了多肽对小鼠IgG-可溶性受体结合的抑制和小鼠IgG-细胞表面受体结合的抑制。在进行本发明多肽对小鼠IgG-可溶性受体结合的抑制中，将小鼠FcγRIII胞外区cDNA亚克隆到原核表达载体pET-28a，在大肠杆菌中高效表达了小鼠mFcγRIII胞外区，以快速稀释复性方法从包涵体变性蛋白中回收了具有良好结合活性的小鼠FcγRIII胞外区重组蛋白，用ELISA方法测定了本发明多肽对小鼠IgG-可溶性受体结合的抑制效率。

为进行多肽对小鼠IgG-细胞表面受体结合的抑制，将小鼠FcγRIII受体分子表达在细胞表面，将小鼠FcγRIII编码区cDNA及小鼠γ-chain编码区cDNA亚克隆到表达载体pcDNA3，共转染COS-7细胞，通过G418抗性筛选和连续克隆化，获得了在COS-7细胞表面稳定表达受体分子的小鼠FcγRIII转染细胞株，其IgG-RBC玫瑰花环形成率可达95％，用玫瑰花环抑制试验检测本发明多肽对小鼠IgG-细胞表面受体结合的抑制效果。

本发明的积极有益效果：

1.本项发明利用生物信息学、多肽合成、细胞免疫学和分子生物学等技术，以化学合成多肽分析鉴定小鼠FcγRIII的线性配体结合表位，进行了多肽对小鼠IgG-可溶性受体结合的抑制，表明线性表位多肽对小鼠FcγRIII亲和小鼠IgG显现出良好的抑制功效，参见图6；还进行了多肽对小鼠IgG-细胞表面受体结合的抑制，用玫瑰花环抑制试验检测本发明多肽对小鼠IgG-细胞表面受体结合的抑制效果，其IgG-RBC玫瑰花环形成率可达95％，参见图10、图11。

2.本发明是首次开展对小鼠FcR线性配体结合表位的探索研究，用合成肽的方法精确定位了小鼠FcγRIH配体结合表位，构建了小鼠FcγRIH、γ-chain共转染稳定表达细胞系，对深入了解FcγR-IgG相互作用的分子基础有重要意义，为小鼠FcR靶标药物的分子设计提供新的思路。

3.小鼠FcγRIII线性配体结合表位多肽的发明，为寻找疗效高而副作用小、治疗自身免疫病的药物提供了新思路，对解决目前困扰人类身体健康的自身免疫性疾病具有重要意义。

四.附图说明：

图1.是显示FcγRIII EC2结构域氨基酸序列比对结果

图2.是显示重组质粒pETmRIII PCR、酶切鉴定结果

图中，1：PCR产物；2：酶切产物；M1：DL2000DNAmarker；

M2：λ-EcoT14I DNA marker。

图3.是显示mFcγRIII诱导表达及Western blot鉴定结果

图中，M：蛋白marker；1：pET-28a，诱导后；2：pETmRIII，诱导前；3：pETmRIII，诱导后；4：pETmRIII，诱导后；5：pETm RIII，诱导前。

图4.是显示mFcγRIII蛋白可溶性分析及纯化结果

图中，M：蛋白marker；1：裂解液上清；2：包涵体；3：纯化后蛋白

图5.是显示ELISA检测复性蛋白mRIII的活性曲线

图6.是显示mRIII3多肽对小鼠IgG与可溶性mFcγRIII结合的抑制曲线

图中，1：BSA曲线，2：control peptide曲线，3：mRIII3曲线

图7.是显示真核表达质粒pc3mγ、pc3mRIII的PCR和酶切鉴定结果

图中，M1：DL2000Marker(2000，1000，750，500，250)；

1：mR-γPCR扩增产物；2：pc3mγ被Hind III和Xho I酶切的产物；

3.mRIII PCR扩增产物；4.pc3mRIII被Hind III和EcoR I酶切的产物；

M2：λ-EcoT14I DNA marker 100bp。

图8.是显示mFcγRIII、mγ-chain共转染细胞的免疫荧光检测结果

图中，A：转染pc3huRII的COS-7细胞(200×)；B：未转染的COS-7细胞(200×).

图9.是显示mFcγRIII、mγ-chain共转染细胞的PCR检测结果

图中，M1：DL2000Marker(2000，1000，750，500，250)；1：mR-γPCR扩增产物；

2：mRIII PCR扩增产物.

图10.是显示稳定表达mFcγRIII细胞株玫瑰花环检测结果

A：转染pc3mRIII的COS-7细胞(200×)；B：未转染的COS-7细胞(200×)。

图11.是显示mRIII3多肽抑制小鼠IgG与稳定表达在COS-7细胞上mFcγRIII的结合

五.具体实施方式：

实施例一：mFcγRIII多肽设计

利用DNASIS(Ver.2.5，Hitachi)软件将boFcγRIIIA(X99695)与huFcγRIIIA(NP_000560)、huFcγRIIIB(NP_000561)和moFcγRIII(NP_034318)的氨基酸序列进行比对(参见图1)，参照huFcγRIIIB(Sondermann et al.，2000；Radaev et al.，2001)的晶体结构，设计合成mFcγRIII多肽6条，分别覆盖其EC2结构域的A-B、B-C、C-C，、D-E、E-F和F-G环，除moRIII2和moRIII6多肽N端含有Cys外，其余4条多肽N端均加入Cys，用于载体蛋白偶联。

实施例二：mFcγRIII多肽的合成程序及筛选程序

利用Symphony 12通道多肽合成仪(Protein Technologies Inc.)在Fmoc-氨基酸-王树脂(Fmoc-Amino Acids attached to Wang Resin，上海吉尔)上以固相多肽合成方法(solid-phasepeptide synthesis)合成多肽，多肽合成按标准操作规程进行。具体流程如下：

设计合成多肽序列→peptide程序分析→设计合成程序→按树脂的取代值计算并称取Fmoc-AA-Wang-resin或Rink resin→DMF溶涨树脂→*加20％piperidine脱Fmoc保护，搅动6min→*加下一位氨基酸和HBTU进行酰化反应，N₂搅动反应30min→*用Kaiser法或TNBS法测试反应的完成情况→*DMF洗5次，每次1min→重复带有*的步骤，在树脂上连接下一位氨基酸，直到该多肽序列合成完成→用TFA法裂解肽链与树脂的连接→冷乙醚沉淀TFA多肽→Sephadex G-25脱盐纯化→HPLC和LC-MS分析鉴定和纯化多肽→多肽与载体的偶联→Dot-ELISA测试小鼠IgG与多肽的结合→测试多肽对小鼠IgG-可溶性受体结合的抑制→测试多肽对IgG-细胞表面受体结合的抑制。

小鼠FcγRIII多肽按5-20μmol/条合成，在其N端均含有Cys残基，可与SMCC双功能试剂形成二硫键，偶联于载体蛋白。合成多肽经HPLC和LC-MS鉴定，其结构正确，纯度均可达到80％以上。

实施例三：小鼠FcγRIII多肽的偶联

应用异型双功能试剂Sulfo-SMCC(MW：436.37，Spacer Arm Length：11.6Pierce)通过将载体蛋白BSA上的-NH₂和多肽N端Cys的-SH相连，形成人工结合抗原多肽BSA-Pep。偶联步骤为：(1)称取4mg无IgG的牛血清白蛋白(IgG-free BSA，Sigma-Aldrich)溶于0.5ml偶联缓冲液(0.1M PB pH 7.2，0.15M NaCl，1μM EDTA)；(2)在50μl DMSO中溶解1mgSulfo-SMCC(MW：436.37，Spacer arm length：11.6Pierce)，加入BSA溶液，充分混匀，室温反应1h或37℃30min，并不时混匀；(3)4℃对偶联缓冲液过夜透析，换液3次，去除多余偶联剂。该溶液即为SMCC活化BSA载体蛋白(SMCC-BSA)，用偶联缓冲液调整蛋白浓度为5mg/ml；(4)称取2mg多肽/条，以50μl二甲基甲酰胺(DMF)充分溶解，加入150μl含5mMEDTA的0.01M PB(pH 7.2)，制备多肽储存液，浓度为10mg/ml；(5)偶联时，取10μl多肽储存液(100μg)，加入等体积含5mM EDTA的0.01M PB(pH 7.2)；与20μl SMCC-BSA溶液(100μg)充分混合，室温反应4h，4℃过夜孵育；(6)以0.01M PB(pH 7.2)调整偶联多肽浓度至1mg/ml，用于小鼠IgG结合试验。

实施例四：小鼠FcγRIII受体线性配体结合表位的初步鉴定

Dot-blot：在硝酸纤维素膜(Millipore)上点印BSA偶联多肽(1μg/dot)，以小鼠FcγRIII重组蛋白(moRIII)和载体蛋白BSA作阳性和阴性对照；自然干燥后，将印迹膜放入含0.2％明胶中37℃封闭1h；加入10μg/ml HRP标记小鼠IgG(HRP-IgG)溶液37℃孵育1h，以PBST充分洗涤；用AEC(3-Amino-9-ethylcarbazole)显色试剂盒(中杉金桥公司)，参照操作说明进行显色。结果判定时，以包被小鼠FcγRIII重组蛋白点呈现棕红色颜色反应，BSA对照点不出现颜色反应进行判定(见表1)。

表1小鼠FcγRIII多肽的特性及与小鼠IgG的反应性

表中：a：为了后续的连接多肽序列的N端括号内是另外加上的半胱氨酸残基；

b：Dot-blot检测各条肽与小鼠IgG的结合.“+”表明小鼠IgG与该肽特异结合，“-”表明小鼠IgG与该肽不结合；

c：根据huFcγRIII的晶体结构预测的部位。

实施例五：线性配体结合表位多肽对小鼠IgG-可溶性受体结合的抑制

1.mFcγRIII与mFcγ-chain基因的克隆

取小鼠外周血白细胞，用UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒提取总RNA，将分离的总RNA按照TAKARA 3’FULL RACE试剂盒说明合成cDNA。

反转录体系为30μl：Total RNA(约1.5μg)4μL，Oligo d(T)18(50pmol/μL)3μL，5×M-MLV Buffer 6μL，dNTP Mixture(10mM each)3μL，RNase Inhibitor(40u/μL)0.75μL，ReverseTranscriptaseM-MLV(RNaseH)(200u/μL)0.75μL，RNase free Water 12.5μL。将上述反应液混合后在PCR仪中按下面程序进行反转录反应：42℃60min，72℃15min。以mFcRIII-F 5′CAGGAATTCGCAGCTCT TCCGAAGGCT 3′，mFcRIII-R 5′GGCCTCGAGTTAGATGGAGGATGTAG TTG 3′为引物，扩增全长mFcγRIII基因序列，PCR反应体系为25uL：cDNA 4μL，TAKARA LA Taq 0.25μL，10×LA buffer 2.5μL，dNTP(2.5mM each)2μL，moFcRIII-F(上游引物)(20pmol/μL)1μL，moFcRIII-R(下游引物)(20pmol/μL)1μL，Water 14.25μL。PCR条件为94℃3min 1个循环；94℃30sec，55℃30sec，72℃2min，共35个循环；72℃10min。将PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，并回收目的片段。将目的片段与pMD19-T载体连接，转化大肠杆菌，构建克隆载体mRIII-T。以mγF：5′-CCAGCGCACCCAGGATGAT-3′，mγR：5′-AGCACA GAGGTGACCAAGAGG-3′为引物，扩增小鼠γ链(mγ-chain)并构建克隆载体mγ-T。

2.mFcγRIII在大肠杆菌中的表达

2.1mFcγRIII胞外区原核表达载体pETmRIII的构建

以mRIII-T质粒为模板，以引物mRIII28a-F：5′-CAGGAATTCGCAGCTCTTCCGAAGGCT-3′，mRIII28a-R：5′-GGCCTCGAGTTAGATGGAGGATG TAGTTG-3′扩增mFcγRIII胞外区基因，在PCR产物两端分别引入EcoR I和Xho I酶切位点。PCR反应体系为50uL：Premix Taq 25μL，模板DNA 2μL，mRIII28a-F(上游引物)2μL，mRIII28a-R(下游引物)2μL，Water 19μL。PCR条件为94℃3min 1个循环；94℃30sec，55℃30sec，72℃1min，共35个循环；72℃10min。将PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，并回收目的片段经EcoR I和Xho I双酶切，获得的目的片断插入表达载体pET28a相应酶切位点，重组pET28a转化表达菌BL21(DE3)，挑取单克隆提取质粒进行酶切鉴定，并命名为pETmRIII。

2.2mRIII蛋白的表达

将阳性重组质粒转化到BL21(DE3)表达宿主菌中，挑取单菌落，接种到5ml LB(含100μg/mL卡那霉素)培养基中37℃振荡培养过夜，次日以10％的接种量转入5ml的LB培养基(含100μg/mL卡那霉素)中，培养至OD600nm约0.6时，加IPTG(终浓度为1mmol/L)进行诱导，再于37℃培养3-7h，离心(4000r/min×20min)收集菌体，用含400μg/ml溶菌酶的PBS重悬菌体，30℃水浴30min裂解细菌，超声波处理裂解菌体溶液(工作3s间歇8s，重复99次)，4℃12000r/min离心20min，分离细胞裂解液上清和沉淀，以SDS-PAGE鉴定表达结果。

2.3Western blot检测

IPTG诱导的pETmRIII全菌和未诱导全菌进行12％SDS-PAGE后，将电泳分离的蛋白带电转到PVDF膜，0.2％明胶封闭过夜，将膜放入PBST中洗6次，每次3min，加1∶600倍稀释的辣根过氧化物酶标记的小鼠IgG 37℃孵育1h，PBST洗膜6次，每次3min，AEC(3-Amino-9-ethylcarbazole)显色检测目的蛋白。

2.4包涵体纯化

诱导表达250ml细菌培养物，离心收集表达菌体。在20ml裂解缓冲液(10mM Tris PH8.0，150mM NaCl，10mM EDTA，10％甘油，2mM DTT，0.5mM PMSF，400μg/ml溶菌酶)中超声破碎后，离心收集包涵体沉淀。用洗涤缓冲液(1％Triton-100，50mM Tris PH 8.0，100mM NaCl，10mM EDTA，2mM DTT)洗涤包涵体5次，每次25ml；然后用重悬缓冲液(50mMTris PH 8.0，100mM NaCl，10mM EDTA，2mM DTT)洗涤1次，最后离心沉淀即为纯化后的包涵体。

2.5mRIII蛋白的复性

稀释复性法：将洗涤纯化后的包涵体用2ml变性液(6mol/L盐酸胍，50mmol/LTris-C1 pH 8.0，10mmol/L EDTA，10mmol/L DTT，100mM NaCl，10％甘油)于4℃搅拌约10h溶解变性，离心去除不溶物，再用变性液将其稀释至5ml，室温放置0.5-1h；将变性液分四批逐滴加入250ml复性缓冲液(100mM Tris pH 8.0，400mM L-精氨酸盐酸盐，2mMEDTA，5mM还原型谷光苷肽，0.5mM氧化型谷光苷肽，0.1mM PMSF，0.1mM叠氮化钠)中，终浓度为0.1mg/mL，每次间隔12h，使复性时间达到60h。将250ml复性液8000r/min4℃离心25min，取上清，用5kDa浓缩管把上清复性液浓缩至所需浓度。

2.6ELISA鉴定复性蛋白活性

分别以10μg/mL mRIII复性前和复性后蛋白包被酶标板，0.2％明胶封闭。分别将不同浓度的辣根过氧化物酶标记的小鼠IgG(HRP-mIgG)(0.01-25μg/ml)溶液加入包被板中，检测HRP-mIgG与酶标板上mRIII复性前和复性后蛋白的结合，比较复性前后蛋白的活性。以不结合小鼠IgG的BSA为阴性对照蛋白。

2.7多肽抑制小鼠IgG与可溶性重组蛋白的结合

以10μg/ml mFcγRIII重组蛋白包被酶标板，0.2％明胶封闭。分别将不同浓度的多肽(0.1-70μM)与等体积10μg/ml HRP-IgG溶液混合，置4℃反应2h；将多肽-IgG混合物加入mRIII重组蛋白包被板中，检测小鼠IgG与酶标板上mRIII重组蛋白的结合，测定多肽对mRIII蛋白结合小鼠IgG的抑制效率。不结合小鼠IgG的多肽和无关蛋白BSA为阴性对照。

3.结果

3.1pETmRIII表达载体的构建

以重组质粒mRIII-T为模板，以引物mRIII28a-F和mRIII28a-R扩增mFcγRIII胞外区基因，通过EcoRI和XhoI双酶切将mFcγRIII胞外区基因定向插入表达载体pET-28a中。经过PCR鉴定和酶切鉴定，结果表明mFcγRIII胞外区基因已定向插入到表达载体中，获得重组表达质粒pETmRIII(参见图2)。

3.2mFcγRIII蛋白的诱导表达、可溶性分析及Western blot鉴定

分别取IPTG诱导1h、2h、3h、4h后的表达产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，在25.7kD左右处均出现一条明显的特征蛋白质表达带，并且IPTG诱导3h后蛋白质表达量趋于稳定。将菌体经超声破碎，离心后得上清液和沉淀，上清未见到表达产物，表明体外重组表达蛋白主要以包涵体形式存在(参见图2)。表达蛋白在PVDF膜上显示一大小为25.7kD的蛋白印迹，而重组质粒诱导前细菌裂解液则没有，表明表达蛋白能与小鼠IgG特异结合(参见图3)。

3.3mFcγRIII蛋白的纯化

根据文献报道，pH值偏碱的变性液有利于复性，我们采用了pH 8.0缓冲液对mFcγRIII包涵体进行六次超声洗涤纯化，SDS-PAGE分析显示，洗涤后包涵体纯度90％以上(参见图4)，表明洗涤效果较好，为以后的复性奠定了基础。

3.4ELISA检测复性蛋白的活性

纯化后的蛋白进一步经稀释复性以获得适当空间结构。为了检测复性蛋白mFcγRIII与配体的结合活性，我们将复性后和复性前蛋白(包涵体)均以10μg/ml包被酶标板，用不同浓度的HRP-mIgG(0.01-25μg/ml)进行检测，如图5所示，随着配体浓度的升高二者ELISA的OD值区别显著变大，表明经稀释复性后已获得具有活性的蛋白(图5结果为三次重复实验的平均值)。

3.5多肽抑制小鼠IgG与可溶性受体的结合

用mRIII3多肽与HRP-mIgG相作用，测定其对可溶性mFcγRIII结合小鼠IgG的抑制作用。在竞争ELISA中，mRIII3多肽能够抑制小鼠IgG与可溶性mFcγRIII的结合，抑制能力随着mRIII3多肽浓度的增加而增强，但并不能完全抑制，而不结合小鼠IgG的对照多肽及BSA对HRP-IgG与可溶性受体的结合未产生明显影响(参见图6，图6为三次重复实验结果的平均值)。

实施例六：多肽抑制IgG与细胞表面受体的结合

1.真核重组表达载体的构建和鉴定

以RIII-T质粒为模板，以引物moRIII-pc+：5′-CGA AAGCTTAGAATGGCTTTGGACACCCA-3′，moRIII-pc-：5′-TATCTCGAGGATGGGGTGTCACTT G-3′扩增mFcγRIII编码区(ORF)全长cDNA(含信号肽序列)，PCR反应体系为50uL：Premix Taq 25μL，模板DNA 2μL，moRIII-pc+2μL，moRIII-pc-2μL，Water 19μL。PCR条件为94℃3min1个循环；94℃30sec，55℃30sec，72℃1min，共35个循环；72℃10min。将PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，并回收目的片段经Hind III和Xho I双酶切，获得的目的片断插入表达载体pcDNA3相应酶切位点，重组pcDNA3转化感受态大肠杆菌(JM109)，并以含50μg/mL氨苄青霉素的营养琼脂平板培养。挑取单克隆提取质粒进行酶切鉴定，并命名为pc3mRIII。以RIII-T质粒为模板，以引物mγ-pc+：5′-CCAAAGCTT CCAGGA TGATC TCAGC-3′，mγ-pc-：5′-TGAGAATTCTGCAGCCAAGCACGTC-3′构建并鉴定mγ-chain真核表达载体pc3mγ。

2.细胞转染

2.1质粒制备

用Qiagen质粒提取试剂盒提取纯化真核表达质粒pc3mRIII。以PVU I单酶切质粒pc3mRIII、pc3mγ，经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，并回收目的片段用无菌水溶解，以核酸蛋白分析仪(Beckman公司)测定DNA含量。线性化表达质粒pc3mRIII、pc3mγ用于pc3mRIII的稳定表达。

2.2细胞共转染与筛选

利用脂质体Lipofectamine^TM 2000转染试剂以线性化pc3mRIII、pc3mγ质粒共转染COS-7细胞。转染48h后消化转染细胞，以20mL含400μg/mL G418的DMEM/10完全培养基重悬细胞，然后转至96孔培养板，每孔200μL，置37℃50mL/L CO2培养箱中培养，每3～4d换液1次。转染后7～10d，待细胞克隆长至1/4～1/2孔时，消化细胞克隆，将细胞转至另一96孔培养板扩大培养，待长成细胞单层后，以免疫荧光检测mFcγRIII的表达，保留原96孔板细胞继续培养。

2.3转染细胞的克隆

以有限稀释法对阳性转染细胞克隆进行连续3次克隆化，建立稳定表达mFcγRIII的细胞株。将免疫荧光检测阳性细胞克隆转入24孔培养板中扩大培养，用含200μg/mL G418的DMEM/10选择培养基稀释细胞至5～10cells/mL，接种96孔细胞培养板，每孔200μL，37℃50mL/L CO2培养箱中培养10～15d，以免疫荧光检测mFcγRIII的表达。对mFcγRIII阳性细胞克隆进行2次和3次克隆化，使其克隆孔玫瑰花环形成率达95％以上，并在液氮中冻存克隆细胞。

3.免疫荧光检测

将共转染pc3mRIH、pc3mγ的COS-7细胞以1×10⁵密度种植在96孔板中，同时以未转染pc3mRIII、pc3mγ的COS-7细胞作为对照，24h细胞贴壁后用PBS缓冲液冲洗3次，封闭液(0.002g/mL明胶)封闭30min，以FITC标记的小鼠IgG闭光孵育1h，PBS缓冲液冲洗后用激光扫描共聚焦显微镜观察mFcγRIII在细胞上的表达情况。

4.共转然细胞株PCR鉴定

将共转染pc3mRIII、pc3mγ的COS-7细胞种植于细胞培养瓶中，待长至单层消化，提取细胞RNA，反转录成cDNA，用moRIII-pc+和moRIII-pc-，mγ-pc+和mγ-pc-为引物，分别扩增mFcγRIII与mγ-chain。

5.玫瑰花环试验

参照张改平研究员论文中的玫瑰花环形成方法(该论文出处为：Zhang G.1994.Bovine IgG Fc Receptors(PhD Thesis)，University of Hertfordshire，Hatfield.，p54-58)，以玫瑰花环试验检测mFcγRIII在COS-7转染细胞表面与其配体小鼠IgG的结合。

采集健康鸡抗凝外周血，1000r/min离心5min，分离鸡RBC，用PBS洗涤3次，制备0.5％的RBC悬液；在96孔血凝板中，用PBS倍比稀释小鼠IgG，50μL/孔；加入0.5％的RBC悬液，振荡混匀；室温静置1h，观察血凝结果，测定小鼠IgG的效价。在新鲜鸡RBC悬液中加入半数凝集量的小鼠IgG溶液，混匀后，4℃孵育2h；1000r/min离心5min，弃上清，用PBS洗涤3次，去除未结合IgG；以无血清的DMEM/0培养基重悬小鼠IgG致敏的RBC，制备0.5％IgG-RBC悬液。

在96孔板中培养pc3mRIII、pc3mγ共转染细胞，待细胞长成单层，以预温的无血清培养基DMEM/0培养基(37℃)漂洗细胞，加入DMEM/0培养基，每孔200μL，37℃孵育2h，以洗脱结合在细胞表面的牛IgG；将10mL/L小鼠IgG-RBC悬液缓慢加到细胞单层，每孔50μL；37℃孵育10min，室温静置35min；用PBS轻柔漂洗6次；用甲醇(含3mL/L H₂O₂)室温固定细胞10min，PBS漂洗3次；每孔加PBS 100μL，在显微镜下观察细胞表面形成的玫瑰花环。在细胞单层加入10μg/mL HRP标记的羊抗小鼠IgG抗体，每孔50μL，37C孵育30min；用PBST充分洗涤，以AEC染色试剂盒染色；用显微镜观察玫瑰花环中RBC的显色。

6.线性配体结合表位多肽对IgG-细胞表面受体结合的抑制

在半数凝集量的基础上用DMEM/0培养基倍比稀释小鼠IgG，分别致敏鸡RBC；将不同致敏量的IgG-RBC加到稳定表达mFcγRIII的转染细胞单层，进行玫瑰花环试验，测定形成明显玫瑰花环的IgG临界致敏量。

以临界致敏量小鼠IgG致敏鸡RBC，制备1％IgG-RBC悬液。用DMEM/0培养基倍比稀释mFcγRIII多肽，分别与等体积1％IgG-RBC悬液混合，置4℃反应2h，以不同浓度的多肽(10-1280μM)结合小鼠IgG：将多肽-IgG-RBC混合物加到稳定表达mFcγRIII的转染细胞单层，进行玫瑰花环试验，分别计数3个视野(100×)内形成的玫瑰花环数。设定不含多肽的DMEM/0培养基对照形成的IgG-RBC玫瑰花环数为100％，计算mFcγRIII多肽对IgG-RBC玫瑰花环形成的抑制效率。不结合小鼠IgG的mR3’多肽为阴性对照多肽。

7.结果

7.1真核表达质粒pc3mRIII与pc3mγ的构建

以克隆到T载体上的阳性质粒为模板，用引物moRIII-pc+和moRIII-pc-，扩增到mFcγRIII编码区(ORF)全长830bp cDNA(含信号肽)序列。将mFcγRIII全长cDNA亚克隆到pcDNA3的巨细胞病毒启动子(Pcmv)下游，经PCR鉴定及EcoR I和Xho I双酶切鉴定，成功构建了真核表达质粒pc3mRIII，以同样方法构建真核表达质粒pc3mγ，鉴定结果参见图7。

7.2mFcγRIII在COS-7细胞表面的表达及其与配体的结合

共转然细胞表达mFcγRIII受体分子的共转染细胞，以小鼠IgG-FITC进行免疫荧光检测，在转染细胞周围明显看到的绿色荧光，而未转染的COS-7对照细胞不结合IgG-FITC没有看到绿色荧光(参见图8)，表明表达于转染细胞表面的mFcγRIII受体分子能与小鼠IgG特异结合。

7.3PCR鉴定mFcγRIII、mγ-chain共转染细胞株

提取共转染细胞RNA，反转录成cDNA，以moRIII-pc+、moRIII-pc-、mγ-pc+、mγ-pc-为引物，分别扩增得到mFcγRIII与mγ-chain。表明基因mFcγRIII与mγ-chain已成功整合到COS-7细胞中(参见图9)。

7.4稳定表达mFcγRIII转染细胞株的建立

以线性化表达质粒pc3mRIII、pc3mγ共转染COS-7细胞，经G418选择性培养、玫瑰花环检测和连续克隆化，建立了稳定表达mFcγRIII的转染细胞株，95％以上的转染细胞看到玫瑰花环，参见图10A；而未转染的COS-7对照细胞未看到荧光，参见图10B，表明mFcγRIII受体分子有效表达于转染细胞表面。

7.5线性配体结合表位多肽对IgG-细胞表面受体结合的抑制

以临界致敏量小鼠IgG致敏鸡RBC，制备1％IgG-RBC悬液。用DMEM/0培养基倍比稀释mRIII3多肽，分别与等体积1％IgG-RBC悬液混合，置4℃反应2h，以不同浓度的多肽(10-1280μM)结合小鼠IgG；将多肽-IgG-RBC混合物加到稳定表达mFcγRIII的转染细胞单层，进行玫瑰花环试验，分别计数3个视野内形成的玫瑰花环数。设定不含多肽的DMEM/0培养基对照形成的IgG-RBC玫瑰花环数为100％，计算mRIII3多肽对IgG-RBC玫瑰花环形成的抑制效率。不结合小鼠IgG的多肽为阴性对照多肽(参见图11)。

序列表

<110>河南省农业科学院

<120>小鼠FcγRIII线性配体结合表位

<130>分子生物学、免疫学和生物信息学技术

<160>1

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>13

<212>PRT

<213>人工序列

<400>1

Cys Ser Phe Phe His Asn Glu Lys Ser Val Arg Tyr His

1                5                  10