用于鉴定活性代谢物的同位素标记的捕获剂和方法

摘要

本发明涉及用于检测活性代谢物的同位素标记的捕获剂、方法和鉴定候选药物的方法。更具体地说，所述检测活性代谢物的同位素标记的捕获剂和方法可以用于检测“硬”和“软”活性代谢物，由此排除假阳性。

说明书

对相关申请的交叉参考

本申请要求于2006年9月29日提交的第60/827,526号美国临时申请的优先权，因此将其内容在其整体上引用作为参考。

发明领域

本发明涉及用于检测活性代谢物(reactive metabolite)的同位素标记的捕获剂、方法和鉴定候选药物的方法。更具体地说，所述检测活性代谢物的同位素标记的捕获剂和方法可以用于检测“硬”和“软”活性代谢物，由此排除假阳性。

发明背景

患者发病和死亡的一个原因，特异药物毒性在临床药物开发中和投放市场后仍然是一个严重的问题。这些特异药物反应能够导致应用的限制并且甚至从市场召回，其结果导致医药工业更高的开发成本。例如，曲格列酮、苯噁洛芬和左镁酸由于不能接受的毒性反应而在其投放不久后就被从市场上召回。

特异药物反应是通常显示高度的个体感受性的稀有事件。另外，这些反应通常不是剂量依赖的。目前，没有可以用来评价这样的仅在人中发生的反应的动物模型。因此，特异药物毒性不能够被有效的评价，并且在临床试验中通常是被忽视的。

目前，特异药物反应的机理尚不明确。有大量证据表明化学活性代谢物与特异毒性有关，特别对肝脏毒性。与特异毒性有关的所有药物通过主要由细胞色素P450酶(CYP)以及其它氧化酶例如过氧化物酶、环加氧酶和髓过氧化物酶介导的不同代谢途径来形成反应活性代谢物。假设与所述毒性有关的药物首先进行代谢活化以产生与细胞蛋白质共价结合的有毒活性代谢物。这些共价修饰的蛋白质是免疫原性的，于是引发免疫反应，从而导致特异药物反应。另一假设是说由活性代谢物产生的细胞蛋白的共价修饰损害信号转导级联系统(signaltransduction cascades)和细胞的生命机能，从而导致在临床中观察到的严重后果。因此需要鉴定活性代谢物的方法。

可以将化学活性代谢物基于其化学特性归为两类-“软”和“硬”活性代谢物。“软”活性代谢物包括大部分亲电代谢物，其包括醌类、醌亚胺类、亚氨基醌甲基化物、环氧衍生物、芳烃氧化物和氮烯鎓(nitrenium)离子，并且易于与“软”亲电体例如半胱氨酸中的巯基反应。相反，“硬”活性代谢物，其通常被看作是醛类，优先与“硬”亲电体例如赖氨酸、精氨酸和核酸的胺反应。由于其不稳定，活性代谢物的直接检测和鉴定已经证明是极其困难的。一种通常利用的方法是捕获分子来捕获活性代谢物，从而形成随后能够通过已知检测方法(例如通过串联质谱法)进行表征的稳定的加合物。

最近，Avery，Michael，J.在欧洲专利公开EP 1,150,120公开了一种用于鉴定产生活性代谢物的试验化合物的高通量筛选方法(high-throughput screening method)。该方法包括在谷胱甘肽存在下将试验化合物用代谢酶系统的微粒体药物培养，并使用串联质谱法检测由此形成的谷胱甘肽加合物。

然而，这种方法将鉴定活性代谢物以及在质谱检测中作为普通反应的结果而形成的非活性成分(包括反应混合物的非活性代谢物和成分)非活性组分，从而产生假阳性。

Yan等人在美国专利公开2005 0287623 A1中公开了使用稳定同位素捕获和质谱法检测活性代谢物的方法。然而，Yan等人公开的方法仅检测“软”代谢物，不能同时检测“硬”和“软”活性代谢物。

发明概述

本发明涉及用于鉴定活性代谢物的同位素标记的捕获剂，式(I)化合物

也称作6-氨基-2-[2-(4-氨基-4-羧基-丁酰基氨基)-3-巯基-丙酰基氨基]-己酸，其中标星号的基团上的一个或多个碳、氮、氧、硫和/或非可交换氢原子是同位素标记的。

本发明还涉及鉴定活性代谢物的方法，该方法包括

(a)将式(I)化合物

和/或同位素标记的式(I)化合物

其中标星号的基团上的一个或多个碳、氮、氧、硫和/或非可交换氢原子是同位素标记的；

与试验化合物和药物代谢酶培养；

产生包含一种或多种加合物的产物混合物；和

(b)按照已知方法和/或按照本文描述的方法，例如通过中性损失质谱法，检测所述一种或多种加合物。

本发明还涉及检测试验化合物的活性代谢物的方法，所述方法包括

(a)将试验化合物与包含式(I)化合物

同位素标记的式(I)化合物和药物代谢酶的混合物培养

其中标星号的基团上的一个或多个碳、氮、氧、硫或非可交换氢原子是同位素标记的；

产生包含一种或多种加合物的产物混合物；

(b)检测在步骤(a)中产生的一种或多种加合物的中性损失质谱中的一个或多个同位素双峰，其中双峰的质量差异是式(I)化合物与同位素标记的式(I)化合物之间的质量差异。

本发明还涉及使用式(I)化合物和同位素标记的式(I)化合物的混合物来鉴定活性代谢物(包括“软”和/或“硬”活性代谢物)的方法，其中标星号的基团上的一个或多个碳、氮、氧、硫或非可交换氢原子是同位素标记的。

本发明还涉及检测试验化合物的活性代谢物的方法，该方法包括

(a)将试验化合物与包含非同位素标记的式(I)化合物

同位素标记的式(I)化合物

其中标星号的基团上的一个或多个碳、氮、氧、硫和/或非可交换氢原子是同位素标记的，

和药物代谢酶的混合物培养，以产生包含一种或多种加合物的产物混合物；

(b)测定步骤(a)中产生的一种或多种加合物的中性损失质谱；和

(c)检测步骤(b)的中性损失质谱中的一种或多种同位素双峰，其中同位素双峰的质量差异是非同位素标记的式(I)化合物与同位素标记的式(I)化合物之间的质量差异。

本发明还涉及包含(a)活性代谢物和非同位素标记的式(I)化合物的共价键合的络合物和(b)活性代谢物和同位素标记的式(I)化合物的共价键合的络合物的混合物。

本发明还涉及鉴定候选药物的方法，该方法包括

(a)将试验化合物与非同位素标记的式(I)化合物

同位素标记的式(I)化合物

其中标星号的基团上的一个或多个碳、氮、氧、硫和/或非可交换氢原子是同位素标记的，

和药物代谢酶培养，产生产物混合物；

(b)测定步骤(a)中产生的产物混合物的中性损失质谱；和

(c)检测步骤(b)的中性损失质谱中的同位素双峰的缺失(其中同位素双峰的质量差异是非同位素标记的式(I)化合物与同位素标记的式(I)化合物之间的质量差异)。

附图的简要描述

图1A说明双氯酚酸的129Da中性损失扫描的总离子色谱图。

图1B说明得自双氯酚酸的加合物I的中性损失串联质谱。

图1C说明得自双氯酚酸的加合物II的中性损失串联质谱。

图2A说明氯氮平的129Da中性损失扫描的总离子色谱图。

图2B说明得自氯氮平的加合物I的中性损失串联质谱。

图3A说明对甲酚的129Da中性损失扫描的总离子色谱图。

图3B说明得自对甲酚的加合物I的中性损失串联质谱。

图3C说明得自对甲酚的加合物II的中性损失串联质谱。

图4A说明奥美拉唑的129Da中性损失扫描的总离子色谱图。

图4B说明得自奥美拉唑的加合物I的中性损失串联质谱。

图5A说明呋喃的129Da中性损失扫描的总离子色谱图。

图5B说明得自呋喃的加合物I的中性损失串联质谱。

图6A说明2-甲基呋喃的129Da中性损失扫描的总离子色谱图。

图6B：得自2-甲基呋喃的异构体加合物的NL串联质谱。

图7A说明薄荷呋喃的129Da中性损失扫描的总离子色谱图。

图7B说明得自薄荷呋喃的加合物I的中性损失串联质谱。

图8A说明2-[2-噻吩基]-呋喃的129Da中性损失扫描的总离子色谱图。

图8B说明得自2-[2-噻吩基]-呋喃的加合物I的中性损失串联质谱。

图8C说明得自2-[2-噻吩基]-呋喃的加合物II的中性损失串联质谱。

图8D说明得自2-[2-噻吩基]-呋喃的加合物III的中性损失串联质谱。

发明详述

本发明涉及同位素标记的捕获剂，其中所述捕获剂能够与活性代谢物结合，式(I)化合物

也称作6-氨基-2-[2-(4-氨基-4-羧基-丁酰基氨基)-3-巯基-丙酰基氨基]-己酸，其中星号标记的基团的一个或多个碳、氮、氧、硫和/或不可交换氢原子是同位素标记的，优选用一个或多个¹³C、¹⁵N、¹⁸O、²H和/或³⁴S同位素标记。

如本文所用，除非另外说明，术语“不可交换氢”是指在水溶液中不发生交换的任何氢原子。对于式(I)化合物，可以被同位素标记的不可交换氢原子是用如下所示的结构式中的箭头标示的

式(I)化合物具有两个“捕获区”，其分别捕获“硬”和“软”活性代谢物。更具体地说，式(I)化合物上的巯基(-SH)基团与所谓的“软”活性代谢物反应并将其捕获，而式(I)化合物上的-(CH₂)₄-NH₂基团与所谓的“硬”活性代谢物反应并将其捕获。因此，式(I)化合物同位素标记的式(I)化合物能够同时捕获“硬”和“软”活性代谢物。也可以将其用图示法表示如下。

如本文所用，除非另外说明，术语“活性代谢物”包括“软”和“硬”活性代谢物。

如本文所用，除非另外说明，术语“软代谢物”是指任何亲电子代谢物，其包含至少一个易于与“软”亲电体例如半胱氨酸中的巯基和式(I)化合物上的-SH反应的取代基。所述取代基的适宜实例包括但不限于醌类、醌亚胺、亚氨基醌、methids、环氧化合物、芳香烃氧化物、氮烯鎓(nitrenium)离子等。

如本文所用，除非另外说明，术语“硬代谢物”是指亲电子代谢物，其包含指示一个易于与“硬”亲电体例如赖氨酸、精氨酸的胺或式(I)化合物的-(CH₂)₄-NH₂反应的取代基。所述取代基的适宜实例包括但不限于醛类等。

因为活性代谢物是与实验化合物有关的很多不良事件、特别是严重的和/或有毒的不良事件的肇因，所以迫切希望能够检测出由试验化合物产生的所有活性代谢物。还迫切希望在试验化合物给药于人之前能够确定试验化合物是否产生活性代谢物。

本领域的技术人员能理解不是所有的试验化合物都产生活性代谢物，并且不是所有的试验化合物都产生“软”和“硬”活性代谢物。有些试验化合物将不产生活性代谢物，有些试验化合物将仅产生硬活性代谢物，有些试验化合物仅产生软活性代谢物，有些试验化合物产生硬和软活性代谢物。因此本发明的捕获剂和方法检测由试验化合物产生的任何类型的活性代谢物。

本领域的技术人员还能理解本发明方法，尽管涉及鉴定活性代谢物，也包括确定试验化合物是否产生活性代谢物的方法。在一个实施方案中，本发明涉及鉴定候选药物(例如不产生活性代谢物的试验化合物)的方法。因此，本发明方法包括其中培养(如本文更详细地描述)产生非活性代谢物，以及因此没有加合物，并且质谱显示没有双峰，由此表明试验化合物不产生任何可检测的活性代谢物的方法。

对于“软”代谢物，谷胱甘肽、以下化学结构式的化合物

是在微粒体培养中使用的检测“软”活性代谢物的最普通的捕获剂。然而，对于“硬”活性代谢物，谷胱甘肽由于其低捕获效能而不是适宜的捕获剂。相反，对于检测“硬”活性代谢物，使用另外的捕获剂例如氨基脲、甲氧基胺和α-acetyllisine。这需要用不同的捕获剂进行两个单独的试验以检测“硬”和“软”活性代谢物。与此相反，可以将式(I)化合物、同位素标记的式(I)化合物和/或非同位素标记的式(I)化合物与同位素标记的式(I)化合物的混合物可以在单个试验中用来检测“软”和“硬”活性代谢物。

如本文所用，除非另外说明，术语“同位素标记的式(I)化合物”是指用至少一种同位素例如¹³C、¹⁵N、¹⁸O、²H、³H、³⁴S等标记的式(I)化合物。优选地，同位素是¹³C、¹⁵N、¹⁸O或²H。同位素标记的式(I)化合物的适宜实例包括但不限于在其半胱氨酸上用¹³C和/或¹⁵N标记的式(I)化合物；在其半胱氨酸和赖氨酸基团上用同位素标记的式(I)化合物；式(I)化合物，在1-28位、优选1-10位、更优选3-8位、最优选8位的一个或多个位置上同位素标记的式(I)化合物；等。优选地，同位素标记的式(I)化合物是用至少一种选自¹³C、¹⁵N、¹⁸O和²H的同位素标记的。更优选地，同位素标记的式(I)化合物是用两个¹⁵N和六个¹³C同位素标记的。

在一个实施方案中，同位素标记的式(I)化合物是如下面化学结构式(I-IS)中所示同位素标记的

如本文所用，除非另外说明，“药物代谢酶”是指优选来源于人组织、更优选来源于人肝脏组织的能够使试验化合物代谢的任何酶或其混合物(参见例如Drug Metabolizing Enzyme，Edited by Jae S.Lee，R.ScottObach and Michael B.Fisher，Marcel Dekker，Inc.(2003))。适宜的实例包括但不限于肝微粒体、细胞色素P450酶或细胞色素P450酶的不同亚型的混合物。优选地，药物代谢物酶是人肝微粒体，更优选细胞色素P450酶。本领域的技术人员能理解，在将试验化合物用细胞色素P450酶或细胞色素P450酶的不同亚型的混合物培养时，细胞色素P450酶或细胞色素P450酶的不同亚型的混合物是与NADPH辅因子

或NADPH再生系统混合在一起培养的。

如本文所用，除非另外说明，术语“试验化合物”是指用来进行形成活性代谢物试验的任何化学物质。优选地，试验化合物是药剂或者其盐、酯或前药。

如本文所用，除非另外说明，术语“候选药物”是指不产生活性代谢物的任何化学物质或试验化合物。优选地，候选药物是药剂或者其盐、酯或前药。

如本文所用，除非另外指出，术语“加合物”是指活性代谢物与同位素标记的式(I)化合物或与非同位素标记的式(I)化合物的任何共价结合的络合物。

说明书尤其是反应方案和实施例中使用的缩写词如下：

APCI-MS/MS ＝大气压力化学离子化串联质谱法

CYPs       ＝细胞色素P450酶

Da         ＝道尔顿

ESI-MS/MS  ＝电喷雾离子化串联质谱法

HPLC       ＝高压液相色谱法

MS         ＝质谱法

NADPH      ＝β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(还原的)

SPE          固相萃取

在一个实施方案中，本发明涉及同位素标记的式(I)化合物，其中星号标记的基团的一个或多个碳、氮、氧、硫和/或不可交换的氢原子是同位素标记的，优选用一个或多个¹³C、¹⁵N、¹⁸O、²H、³H和/或³⁴S同位素标记。可以通过已知的方法，例如通过同位素交换后者通过使用同位素标记的试剂/起始材料进行肽偶联合成，来制备同位素标记的式(I)化合物。(参见例如Ott，Donald G.，Syntheses with Stable Isotopes ofCarbon，Nitrogen，and Oxygen，(1981)，Wiley，New York，N.Y；Keliher，Edmund J.；Burrell，Richard C.；Chobanian，Harry R.；Conkrite，Karina L.；Shukla，Rajesh；Baldwin，John E.，Efficient syntheses of fourstable-isotope labeled (1R)-menthyl(1S，2S)-(+)-2-phenylcyclopropanecarboxylates，Organic & Biomolecular Chemistry，(2006)，4(14)，pp 2777-2784；Schippers，Nicole；Schwack，Wolfgang，Synthesis of the 15N-labelled insecticide imidacloprid，Journal of LabelledCompounds and Radiopharmaceuticals，(2006)，49(3)，pp305-310；和Bretz，Michael；Beyer，Marita；Cramer，Benedikt；Humpf，Hans-Ulrich，Synthesis of stable isotope labeled 3-acetyldeoxynivalenol，MolecularNutrition & Food Research，(2005)，49(12)，pp1151-1153.)

在一个实施方案中，本发明涉及同位素标记的式(I-IS)化合物。式(I-IS)化合物可以如下面反应方案1中所述来制备。

反应方案1

因此，按照已知的化学反应(例如经由酸-胺缩合失去水，参见例如，L.G.，Organic Chemistry，Fourth Editions，Prentice Hall，1999，pp.136-137)，将2-氨基-4-(1-羧基-2-巯基-乙基氨基甲酰基)-丁酸与同位素标记的赖氨酸反应，获得式(I-IS)化合物。

本发明涉及式(I)化合物

或同位素标记的式(I)化合物

其中标星号的基团上的一个或多个碳、氮、氧、硫或非可交换氢原子是同位素标记的；

或者式(I)化合物与同位素标记的式(I)化合物的混合物；

在检测活性代谢物中的应用。

本发明还涉及使用同位素捕获和质谱法来检测活性代谢物的方法，其中该方法排除假阳性。本发明还提供在低水平检测活性代谢物的高灵敏度方法。此外，本发明可应用于以手动或全自动方式使用MS模式识别来检测活性代谢物。

本发明还涉及检测活性代谢物的方法，该方法包括

(a)将式(I)化合物或同位素标记的式(I)化合物，其中标星号的基团上的一个或多个碳、氮、氧、硫和/或非可交换氢原子是同位素标记的，与试验化合物和药物代谢酶培养以产生包含一种或多种加合物的产物混合物；和

(b)检测所述加合物(按照已知方法)。

例如，不使用稳定同位素捕获(例如不使用同位素标记的捕获剂例如同位素标记的式(I)化合物)检测活性代谢物的方法使用三级四极质谱仪，其通过使用作为测量扫描的中性损失能够触发MS/MS全扫描。使用这种系统，可以在一次试验中获得加合物的串联MS质谱，并且可以通过检查特征产物离子来实现结构鉴定。然而，由于相对于中性损失MS扫描，用MS全扫描通常获得较小信噪比，所以使用MS全扫描系统可能难于检测次要活性代谢物。而且，MS全扫描相对费时且费力。

本发明涉及检测试验化合物的活性代谢物的方法，该方法包括

(a)将试验化合物与包含非同位素标记的式(I)化合物、同位素标记的式(I)化合物的混合物，其中标星号的基团上的一个或多个碳、氮、氧、硫和/或非可交换氢原子是同位素标记的，和药物代谢酶培养，获得包含一种或多种加合物的产物混合物；

(b)检测步骤(a)的加合物的中性损失质谱中的一个或多个同位素双峰，其中双峰的质量差异是非同位素标记的式(I)化合物与同位素标记的式(I)化合物之间的质量差异。

在一个实施方案中，本发明涉及检测试验化合物的活性代谢物的方法，该方法包括

(a)将试验化合物与包含式(I)化合物，

同位素标记的试(I-IS)化合物

的混合物和药物代谢酶培养；

以获得包含一种或多种加合物的产物混合物；

(b)测定步骤(a)中的一种或多种加合物的中性损失质谱；和

(c)检测步骤(b)的中性损失质谱中的一个或多个同位素双峰，其中同位素双峰的质量差异为8Da。

在一个实施方案中，本发明涉及检测试验化合物的活性代谢物的方法，该方法包括

(a)将试验化合物与包含非同位素标记的式(I)化合物、同位素标记的式(I)化合物的混合物(其中标星号的基团上的一个或多个碳、氮、氧、硫和/或非可交换氢原子是同位素标记的)和药物代谢酶培养，获得包含一种或多种加合物的产物混合物；

(b)分离步骤(a)的一种或多种加合物；(按照已知方法，优选通过离心)；

(c)测定所述分离的加合物的中性损失质谱；

(d)检测所述分离的加合物的中性损失质谱中的一个或多个同位素双峰，其中双峰的质量差异是非同位素标记的式(I)化合物与同位素标记的式(I)化合物之间的质量差异。

在一个实施方案中，本发明涉及检测试验化合物的活性代谢物的方法，该方法包括

步骤A：培养混合物，该混合物包含

(a)试验混合物；

(b)式(I)化合物

(c)同位素标记的(I-IS)化合物

其中式(I)化合物与同位素标记的式(I-IS)化合物的摩尔比例为约1∶1；和

(c)选自以下的药物代谢酶：人肝微粒体、与NADPH辅因子组合的细胞色素P450酶和与NADPH再生系统组合的细胞色素P450酶；

以产生包含一种或多种选自以下的培养产物的产物混合物：

(a)非活性代谢物；

(b)在式(I)化合物和活性代谢物之间形成的加合物；和

(c)在同位素标记的式(I-IS)化合物和活性代谢物之间形成的加合物；

步骤B：测定步骤(A)中产生的产物混合物的中性损失质谱；和

步骤C：检测步骤(B)的中性损失质谱中的一个或多个同位素双峰，其中同位素双峰的质量差异为8Da。

在本发明的一个实施方案中，同位素标记的式(I)化合物是用至少一个选自¹³C、¹⁵N、¹⁸O和²H的同位素标记的。在本发明的另一实施方案中，同位素标记的式(I)化合物是用1-28个同位素、优选1-10个同位素标记的。在本发明的另一实施方案中，同位素标记的式(I)化合物是用6个¹³C和2个¹⁵N原子标记的。在本发明的另一实施方案中，同位素标记的式(I)化合物是式(I-IS)化合物

在本发明的一个实施方案中，使用中性损失质谱检测129Da损失(相应于非同位素标记的或同位素标记的式(I)化合物的-C(O)-CH₂-CH₂-CH(NH₂)-CO₂H部分的损失)。

在本发明的一个实施方案中，采用APCI-MS/MS、ESI-MS/MS等，优选ESI-MS/MS来测定同位素双峰。在本发明的另一实施方案中，中性损失质谱中的同位素双峰的质量差异为约1-28个质量单位、优选2-10个质量单位，更优选8个质量单位。

在本发明的一个实施方案中，药物代谢酶选自人肝微粒体、细胞色素P450酶、过氧化物酶、环加氧酶和髓过氧化物酶。优选地，药物代谢酶是细胞色素P450酶。

在一个实施方案中，应用本发明检测通过将试验化合物与含有药物代谢酶例如S9、重组酶或微粒体酶的任何细胞级份培养而形成的活性代谢物。在一个实施方案中，应用本发明方法预测试验化合物是否在人个体中形成活性代谢物(即在将试验化合物给予人之后)。

本领域技术人员将理解，缩写“S9”是指S9级份(线粒体后上清液级份)，其是微粒体和胞浆的混合物。因此，其含有多种包括多种I期和II期酶，包括P450酶、黄素单氧酶、羧基酯酶、环氧化物酶、UDP-葡萄糖醛酸转移酶、磺基转移酶、甲基转移酶、乙酰基转移酶、谷胱甘肽S-转移酶和其他药物代谢酶。

本发明还涉及包含(a)活性代谢物与非同位素标记的式(I)化合物的共价键合的络合物和(b)活性代谢物与同位素标记的式(I)化合物的共价键合的络合物，其中标星号的基团上的一个或多个碳、氮、氧、硫和/或非可交换氢原子是同位素标记的。

在本发明的一个实施方案中，非同位素标记的式(I)化合物与同位素标记的式(I)化合物的摩尔比例在约1∶1至1∶2的范围内，优选在约1∶1至约1∶1.5的范围内，更优选为约1∶1。

在本发明的一个实施方案中，活性代谢物和非同位素标记的式(I)化合物的共价键合的络合物与活性代谢物和同位素标记的式(I)化合物的共价键合的络合物的摩尔比例在约1∶1至约1∶2的范围内，优选在约1∶1至约1∶1.5的范围内，更优选为约1∶1。

本发明还涉及检测活性代谢物的方法。更具体地说，在本发明方法中，将试验化合物与包含以下成分的混合物按照已知方法培养：

(a)非同位素标记的式(I)化合物；

(b)同位素标记的式(I)化合物，其中同位素标记的式(I)化合物含有6个¹³C和2个¹⁵N原子；

其中非同位素标记的式(I)化合物与同位素标记的式(I)化合物的摩尔比例为约1∶1(以在质谱中产生具有大约相同强度双峰)；和

(c)药物代谢酶例如人肝微粒体、与NADPH辅因子组合的细胞色素P450酶(CYP)(纯化的、重组的、在微粒体中的、在肝细胞中的等)、与NADPH再生系统组合的细胞色素P450酶(CYP)(纯化的、重组的、在微粒体中的、在肝细胞中的等)、过氧化物酶、环加氧酶、髓过氧化物酶等；优选人肝微粒体；

以产生包含一种或多种培养产物的混合物，所述培养物产物选自

(a)非活性代谢物；

(b)在非同位素标记的式(I)化合物与活性代谢物之间形成的加合物；和

(c)在同位素标记的式(I)化合物与活性代谢物之间形成的加合物。

本领域的技术人员能理解，作为上述培养的结果产生的非活性(稳定的)代谢物，将不与非同位素标记的式(I)化合物或同位素标记的式(I)化合物反应，而是在产物混合物中保持不变。

优选地，同位素标记的式(I)化合物是用一种或多种选择的稳定同位素标记的。适宜的同位素包括但不限于¹³C、¹⁵N、²H、³H、¹⁸O、³⁴S等。优选地，同位素选自¹³C、¹⁵N、¹⁸O和²H，更优选¹³C和¹⁵N。优选地，同位素标记的式(I)化合物与非同位素标记的式(I)化合物之间的质量差异为约1-28个质量单位、优选2-10个质量单位、更优先8个质量单位。

优选将含有一种或多种培养产物(非活性代谢物、在活性代谢物与非同位素标记的式(I)化合物之间形成的加合物和/或在活性代谢物与同位素标记的式(I)化合物之间形成的加合物)的产物混合物清洗，并按照已知方法例如通过离心、SPE或液-液萃取来浓缩，以获得产物浓缩物。然后把产物浓缩物溶解在适用于质谱法(即适合于注射到质谱仪)的溶剂中，所述溶剂是例如5％乙腈在水中的溶液、5％甲醇在水中的溶液。

优选地，按照已知方法，例如通过液相色谱法、HPLC、毛细管电泳或其他分离技术，将产物混合物分离为单独的加合物成分。然后测定每一加合物或加合物成分的中性损失质谱。可以按照已知方法，使用任何电离源，例如使用APCI-MS/MS、ESI-MS/MS等，优选通过使用ESI-MS/MS，来测定中性损失质谱。或者，可以在一个步骤中使用环形系统例如LC/MS等来完成分离和质谱测定。

如果活性代谢物是由试验化合物产生并且是存在的(作为与非同位素标记的式(I)化合物和同位素标记的式(I)化合物的加合物)，则相应的质谱将显示一个或多个由于非同位素标记的式(I)化合物与同位素标记的式(I)化合物之间的质量差异而间隔的双峰。本领域的技术人员能理解，双峰可以通过视觉识别或者通过使用评估MS模型的电脑软件程序来鉴定。

作为实例，其中同位素标记的式(I)化合物是用6个¹³C和2个¹⁵N原子标记的，如在式(I-IS)化合物中那样，并且非同位素标记的式(I)化合物和同位素标记的式(I)化合物是以约1∶1的摩尔比例存在的，在碰撞诱导解离中，非同位素标记的和同位素标记的加合物将经历焦谷氨酸的中性损失(129Da)。作为结果，在活性代谢物与非同位素标记的式(I)化合物和同位素标记的式(I)化合物之间形成的加合物的质谱将表现出质量差异为8Da的两个同位素分子离子，并且同位素双峰将显示近似相等的强度。8Da的一致质量差异和所述双峰的近似相等强度由此提供鉴定活性代谢物加合物的独特MS信号标志。

在本发明方法中，假阳性是容易排除的，因为其在被测定的中性损失质谱中不显示特征性双峰。

通过使用计算机辅助的MS模型识别，可以实现本发明方法的自动化。作为实例，制定一种逻辑图来为计算机设计进行自动检测活性代谢物的程序。更具体地说，模型识别过程由以下步骤构成：

1.定义m/z值的误差宽容度(error tolerance)；

2.定义潜在同位素双峰的峰强度比例的误差范围；

3.用选择的信噪比设置确定总离子色谱图中的色谱峰；

4.检测各个色谱峰的主要分子离子的m/z值；

5.使用定义的误差宽容度通过适宜的道尔顿数(基于所选同位素类型和数目)寻找质量有差异的双峰；

6.确定鉴定双峰的强度比例；

7.鉴定加合物。

在使用这种方法时，双峰的强度比例和质量差异是模式识别中的最主要的决定参数。强度比的误差宽容度是通过非同位素标记的式(I)化合物和同位素标记的式(I)化合物的纯度确定的，而m/z值的误差宽容度则取决于质谱仪的性能。

本发明方法用来在单一试验中确定试验化合物是否产生“硬”和/或“软”活性代谢物。本领域的技术人员能理解，虽然本发明方法同时检测“硬”和“软”活性代谢物，如果“硬”或“软”活性代谢物不是由特定的试验化合物形成的，那么该方法将检测形成了哪一种类型的活性代谢物。另外，如果没有形成活性代谢物，该方法将产生没有特征双峰的质谱，由此将试验化合物鉴定为候选药物。

本发明还涉及鉴定候选药物(即不产生活性代谢物的试验化合物)的方法，该方法包括

(a)将试验化合物与包含非同位素标记的式(I)化合物、同位素标记的式(I)化合物的混合物(其中标星号的基团上的一个或多个碳、氮、氧、硫和/或非可交换氢原子是同位素标记的)和药物代谢酶培养，获得产物混合物；

(b)测定步骤(a)中的产物混合物的中性损失质谱；和

(c)检测步骤(b)的中性损失质谱中的同位素双峰的缺失(其中同位素双峰的质量差异是非同位素标记的式(I)化合物与同位素标记的式(I)化合物之间的质量差异)。

在一个实施方案中，本发明涉及鉴定候选药物的方法，该方法包括

(a)将试验化合物与包含非同位素标记的式(I)化合物

同位素标记的式(I-IS)化合物

其中标星号的基团上的一个或多个碳、氮、氧、硫或非可交换氢原子是同位素标记的；

和药物代谢酶的混合物培养；获得产物混合物；

(b)测定步骤(a)中产生的产物混合物的中性损失质谱；和

(c)检测步骤(b)的中性损失质谱中的同位素双峰的缺失(其中同位素双峰的质量差异是8Da的质量差异)。

提供以下实施例以帮助理解本发明，而不是意图且不应当理解为以任何方式限制随后提供的权利要求。

实施例1-标准程序

A.培养和稳定同位素捕获：

本文描述的所有微粒体培养均是在水浴中于37℃进行的。将试验化合物与人肝微粒体制备物(细胞色素P450酶制备物)在补充了以1∶1的等摩尔比预先混合的非同位素标记的式(I)化合物和同位素标记的式(I-S)化合物的50mM磷酸钾缓冲液(pH 7.4)中混合。将所得混合物在37℃预热5分钟。把辅因子-NADPH再生系统加到反应混合物中-(以启动反应)，获得1000μl的最终体积。

所得反应混合物含有10μM试验化合物、1mg/ml微粒体蛋白质、1mM非同位素标记的式(I)化合物和同位素标记的式(I-IS)化合物的混合物、1.3mM NADP⁺、3.3mM葡萄糖-6-磷酸、0.4U/ml葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、3.3mM氯化镁。

在培养60分钟之后，通过加入150μl三氯乙酸(10％)将反应中止。将所得混合物于4℃以10,000g离心15分钟以使沉淀的蛋白形成小团，并把上清液进行固相萃取。或者，将反应混合物进行液-液萃取以从上清液中回收代谢物。

B.质谱法：

MS分析是在Micromass(Manchester，UK)Quattro Micro三级四极质谱仪上进行的。ESI离子源是以正离子模式进行的，并且试验参数设置如下：毛细管电压3.2kV，源温120℃，去溶剂化温度300℃，样本锥体电压26V。以中性损失扫描模式收集的质谱是通过在范围m/z400-800以2.0s扫描获得的。

C.LC-MS/MS分析：

对于活性代谢物的完整分析，首先用具有自动采样器的Agilent1100HPLC系统(Agilent Technologies，Palo Alto，CA)将样本进行色谱分离，并把洗脱剂输入以中性损失扫描模式运转的Quattro Micro三重四极质谱仪中。将Agilent Zorbax SB C18柱(2.1×50mm)用于色谱分离。初始流动相由95％水(0.5％乙酸)组成，并且使用95％水至95％乙腈的单一梯度用7分钟以0.3ml/min的流速洗脱代谢物。在7分钟，将柱用95％乙腈洗涤2分钟，然后以初始条件进行再平衡。对10-μl等份试样的清洁样本进行LC-MS/MS分析。将数据用得自Micromass的Masslynx版本4.0软件进行处理。在检测到正峰值之后，随后获得MS/MS光谱以进一步确定加合物的结构。为了获得CID(碰撞诱导解离)光谱，将质谱仪用多重反应监测(MRM)模式操作。

实施例2-9：检测软和/或硬活性代谢物

按照上面实施例1中所述程序，将本发明方法应用于检测已知试验化合物的活性代谢物，更具体地说应用于已知产生“软”和/或“硬”代谢物的试验化合物，其中是以129Da的损失扫描中性损失质谱，并且使用同位素标记的式(I-IS)化合物，其与相应的非同位素标记的式(I)化合物相差8Da单位。

实施例2：双氯酚酸

选择双氯酚酸作为试验化合物来证明本发明方法对检测软活性代谢物的适用性。

双氯酚酸的两种活性代谢物以及相应加合物的形成描述于下面的反应方案E1。在下述反应中，双氯酚酸的活性代谢物与非同位素标记的式(I)化合物和同位素标记的式(I-IS)化合物通过-SH部分形成加合物。为清晰起见，下面只显示与非同位素标记的式(I)化合物的加合物。本领域的技术人员能理解，与同位素标记的式(I-IS)化合物形成的加合物具有相同的结构，只是在同位素标记方面不同而已。

反应方案E1

图1A显示了从反应混合物获得的129Da中性损失扫描的总离子色谱图(MS)。几种成分对中性扫描表现出正反应，并且有两种成分表现出预期的同位素双峰(质量差异为8Da)。加合物I在5.9的保留时间被洗脱下来，并且如图1B所示，表现出在m/z 688和696的特征同位素双峰，而加合物II的保留时间为5.8分钟，并且如图1C所示，表现出在m/z 654和662Da的特征同位素双峰。

实施例3：氯氮平

选择氯氮平作为实验化合物来证明本发明方法对检测软活性代谢物的适用性。

氯氮平的单一活性代谢物和相应的加合物的形成描述于下面的反应方案E2。在下述反应中，氯氮平的活性代谢物通过-SH部分与非同位素标记的式(I)化合物和同位素标记的式(I-IS)化合物形成加合物。为了清晰起见，下面只显示了与非同位素标记的式(I)化合物形成的加合物。本领域的技术人员能理解，与同位素标记的式(I-IS)化合物形成的加合物具有相同的结构，只是在同位素标记方面不同而已。

反应方案E2

图2A显示了从反应混合物获得的129Da中性损失扫描的总离子色谱图(MS)。几种成分对中性扫描表现出正反应，但是如图2B所示，只有保留时间为5.4分钟的一种成分表现出在m/z 703和711Da的特征同位素双峰。

实施例4：对甲酚

选择对甲酚作为实验化合物来证明本发明方法对检测软活性代谢物的适用性。

两种活性代谢物的对甲酚以及相应加合物的形成描述于下面的反应方案E3中。在下述反应中，对甲酚的活性代谢物通过-SH部分与非同位素标记的式(I)化合物和同位素标记的式(I-IS)形成加合物。为清晰起见，下面只显示与非同位素标记的式(I)化合物的加合物。本领域的技术人员能理解，与同位素标记的式(I-IS)化合物形成的加合物具有相同的结构，只是在同位素标记方面不同而已。

反应方案E3

图3A显示了从反应混合物获得的129Da中性损失扫描的总离子色谱图(MS)。两种成分表现出特征同位素双峰。如图3B所示，保留时间为0.64分钟的加合物I表现出在m/z 485和493Da的同位素双峰。如图3C所示，保留时间为0.71分钟的加合物II表现出在m/z 501和509Da的同位素双峰。

实施例5：奥美拉唑

选择奥美拉唑作为实验化合物来证明本发明方法对检测软活性代谢物的适用性。

奥美拉唑的单一活性代谢物和相应加合物的形成描述于下面的反应方案E4中。在下述反应中，奥美拉唑的活性代谢物通过-SH部分与非同位素标记的式(I)化合物和同位素标记的式(I-IS)化合物形成加合物。为清晰起见，下面只显示与非同位素标记的式(I)化合物的加合物。本领域的技术人员能理解，与同位素标记的式(I-IS)化合物形成的加合物具有相同的结构，只是在同位素标记方面不同而已。

反应方案E4

图4A显示了从反应混合物获得的129Da中性损失扫描的总离子色谱图(MS)。如图4B所示，只有保留时间为5.3分钟的一种成分表现出在m/z 723和731Da的特征同位素双峰。

实施例6：呋喃

选择呋喃作为实验化合物来证明本发明方法对检测硬活性代谢物的适用性。

呋喃的单一活性代谢物以及相应的加合物的形成描述于下面的反应方案E5中。在下述反应中，呋喃的活性代谢物通过-SH部分和末端-NH₂部分与非同位素标记的式(I)化合物和同位素标记的式(I-IS)化合物形成加合物。为清晰起见，下面只显示与非同位素标记的式(I)化合物的加合物。本领域的技术人员能理解，与同位素标记的式(I-IS)化合物形成的加合物具有相同的结构，只是在同位素标记方面不同而已。

反应方案E5

图5A显示了从反应混合物获得的129Da中性损失扫描的总离子色谱图(MS)。如图5B所示，在8.9分钟的保留时间洗脱下来的成分表现出在m/z 427和435Da的特征同位素双峰。

实施例7：2-甲基呋喃

选择2-甲基呋喃作为实验化合物来证明本发明方法对检测硬活性代谢物的适用性。

2-甲基呋喃的单一活性代谢物及其相应的两个结构异构体加合物描述于下面的反应方案E6中。在下述反应中，2-甲基呋喃的活性代谢物通过-SH部分和末端-NH₂部分与非同位素标记的式(I)化合物和同位素标记的式(I-IS)化合物形成两种加合物的结构异构体。为清晰起见，下面只显示与非同位素标记的式(I)化合物的加合物。本领域的技术人员能理解，与同位素标记的式(I-IS)化合物形成的加合物具有相同的结构，只是在同位素标记方面不同而已。本领域的技术人员还能明白，在本试验中形成的两种加合物的结构异构体将产生近似相同的质谱。

两种加合物的结构异构体的混合物

反应方案E6

图6A显示了从反应混合物获得的129Da中性损失扫描的总离子色谱图(MS)。如图6B所示，保留时间为5.6分钟和5.9分钟的两种加合物异构体(结构异构体)分别表现出在m/z 441和449Da的特征同位素双峰；

实施例8：2-薄荷呋喃

选择薄荷呋喃作为实验化合物来证明本发明方法对检测硬活性代谢物的适用性。

薄荷呋喃的单一活性代谢物以及相应的加合物的形成描述于下面的反应方案E7。在下属反应中，薄荷呋喃的活性代谢物通过末端-NH₂部分与非同位素标记的式(I)化合物和同位素标记的式(I-IS)化合物形成加合物。为清晰起见，下面只显示与非同位素标记的式(I)化合物的加合物。本领域的技术人员能理解，与同位素标记的式(I-IS)化合物具有相同的结构，只是在同位素标记方面不同而已。

反应方案E7

图7A显示了从反应混合物获得的129Da中性损失扫描的总离子色谱图(MS)。如图5B所示，保留时间为5.9分钟的一种成分表现出在m/z 527和535Da的特征同位素双峰。

实施例9：2-(2-噻吩基)-呋喃

选择2-(2-噻吩基)-呋喃作为实验化合物来证明本发明方法对检测硬和软活性代谢物的适用性。

2-(2-噻吩基)-呋喃的活性代谢物以及随后与式(I)化合物和同位素标记的式(I-IS)化合物的混合物(后文称作“捕获剂GSK”)的加合物的形成描述于下面反应方案E8和E9。更具体地说，反应方案8显示产生硬活性代谢物(H1)的呋喃环的打开、产生软活性代谢物(S1)的噻吩环的环氧化和相应加合物的形成。另外，反应方案9显示活性代谢物(S1)的异构化形成第二硬活性代谢物(H2)，以及其相应加合物的形成。(H1)活性代谢物与非同位素标记的式(I)化合物和同位素标记的式(I-IS)通过-SH部分和末端-NH₂部分形成加合物；(S1)活性代谢物与非同位素标记的式(I)化合物和同位素标记的式(I-IS)化合物通过两个-SH部分形成加合物；(H3)活性代谢物与非同位素标记的式(I)化合物和同位素标记的式(I-IS)化合物通过末端-NH₂部分形成加合物。为清晰起见，下面只显示与非同位素标记的式(I)化合物的加合物。本领域的技术人员能理解，与同位素标记的式(I-IS)化合物具有相同的结构，只是在同位素标记方面不同而已。

反应方案E8

反应方案E9

图8A显示了从反应混合物获得的129Da中性损失扫描的总离子色谱图(MS)。如图8B所示，具有6.5分钟的保留时间的加合物I在m/z 509和517Da表现出特征同位素双峰；如图8C所示，加合物II表现出在m/z 527和535Da的特征同位素双峰；并且如图8D所示，加合物III在m/z 495和503Da表现出特征同位素双峰。

尽管前述说明书讲授了本发明的原理，并为了例证说明的目的而提供了实施例，但是可以理解本发明的实施包括所有通常的变化、修正和改良，这些变化、修正和改良属于下面权利要求及其同等物的范围之内。