一种低温碱性蛋白酶、其在洗涤剂方面的应用及该蛋白酶的产生菌

摘要

本发明的目的是提供一种低温碱性蛋白酶、其在洗涤剂方面的应用及该蛋白酶的产生菌Pseudomonas mosselii XG1。菌株Pseudomonas mosselii XG1采用脱脂牛奶平板，从土壤样本中筛选。将该菌株发酵获得上清液，经硫酸铵沉淀法获得电泳纯、分子量为44－46KDa的低温碱性蛋白酶。该蛋白酶在低温下仍具有较高活性，耐受较宽pH，能与多种商业洗涤剂相容，并且具有优良的去污性能，可作为优良的洗涤剂用酶。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物应用领域，尤其涉及一种低温碱性蛋白酶、其在洗涤剂方面的应用及该蛋白酶的产生菌。

背景技术

酶制剂工业是生物工程的重要组成部分，其应用领域遍及轻工、食品、化工、医药、农业、能源及环境保护等，在国民经济发展中起着重要的作用。目前全球生产酶制剂有60余种产品，达到工业化规模的有20余个系列。而我国只能生产20余种产品，其中能够达到工业化规模的仅有糖化酶、α-淀粉酶和蛋白酶3种。其中，糖化酶和淀粉酶产量占酶制剂总产量的80％以上，而作为三大工业酶之一的蛋白酶的产量不足20％。由此可见，我国酶制剂产业的结构明显不合理，蛋白酶制剂工业尚有待大力发展。

国外从60年代开始推出枯草杆菌蛋白酶，国内1979年推出枯草杆菌蛋白酶，1990年国内枯草杆菌蛋白酶产量约13000吨，当时加酶洗衣粉仅占洗涤剂总量的10％，但目前已有90％的洗涤剂为加酶洗涤剂。此外，世界洗涤剂产量2700万吨中，西欧人均24公斤，日本人均9公斤，美国人均32公斤，世界人均7公斤，而我国人均只有2.05公斤，可以说加酶洗涤剂是洗涤行业的国际发展趋势，统计数据差异下掩饰的巨大商业价值不言而喻。

另一方面，世界各地洗涤习惯的不同决定了对蛋白酶的不同要求，如在欧洲，洗涤温度一般在25℃以上，因此使用的蛋白酶必须有较好的热稳定性；在我国，大部分地区即使在冬天也习惯用冷水洗涤，而市场上很多研究成熟的洗涤用蛋白酶都是中温蛋白酶，最适反应温度在50-60℃，在低温下并不能发挥良好的洗涤性能。因此，开发出一种洗涤剂添加剂用低温碱性蛋白酶具有重要的实用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种低温碱性蛋白酶产生菌及该低温碱性蛋白酶。此低温碱性蛋白酶在低温下仍具有较高活性，耐受较宽pH，能与多种商业洗涤剂相容，并且具有优良的去污性能。本发明还提供该低温碱性蛋白酶在洗涤剂方面的应用。

本发明提供一种假单胞菌属菌株Pseudomonas mosselii XG1，其保藏号登记号为CCTCC No：M 208235。

Pseudomonas mosselii XG1为蛋白酶产生菌，通过以下步骤筛选获得的：

初筛：采集土壤样本，采用梯度稀释涂布法，选用不同稀释度的样品处理液涂布到脱脂牛奶平板上，30℃培养。选取在脱脂牛奶平板上透明圈较大的单个菌落进行分离纯化，并对纯菌株进行斜面保藏。

复筛：将各纯菌株接入发酵培养基中，30℃振荡培养48h，测定蛋白酶活力，最终筛选蛋白酶产生菌XG1。

菌株XG1为革兰氏阴性、短杆状小细菌，30℃培养时，在MLB平板上为浅黄色、湿润、突起的小菌落，边缘整齐，易挑取。20℃培养时，菌落会产生黄绿色色素。

采用16S rDNA序列分析，发现菌株XG1的16s rDNA序列与Pseudomonasmosselii的16S rDNA序列同源性高达99％，表明该菌株为Pseudomonas mosselii，命名为Pseudomonas mosselii XG1。

菌株Pseudomonas mosselii XG1已送中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC No：M 208235，保藏日期为2008年11月21日。

本发明提供一种菌株Pseudomonas mosselii XG1产生的低温碱性蛋白酶，该低温碱性蛋白酶基于十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳的分子量为44-46KDa。其最适反应pH为8.5-9.5，在pH12.0的反应体系中保留最佳活力的80％-90％；最适反应温度为35-40℃，当反应温度为15℃时，该酶活性保留最高活力的32％-36％，当反应温度为4℃时，该酶活性保留最高活力的14％-16％。1，10-邻二氮杂菲和二硫苏糖醇显著抑制该酶活力，苯甲基磺酰氟(PMSF)对该酶活力没有影响。

本发明低温碱性蛋白酶于25℃采用不同pH的缓冲体系处理1h，发现该酶在pH7.0-9.0的缓冲体系中最为稳定，在pH6.0-11.0的缓冲体系中，酶活为最高活力的90％以上；当缓冲液的pH介于5.0-6.0和pH为12.0时，酶活为最高活力的80％左右，显示了很宽的pH耐受性。

本发明低温碱性蛋白酶在低温下仅存在微弱的自我剪切现象，有利于其保藏及正常行使其功能。

多种金属离子对本发明低温碱性蛋白酶无显著影响。Mn²⁺能显著促进该蛋白酶活力，4℃下处理30min后酶活增加至161％，Fe²⁺微弱抑制蛋白酶活力。

表面活性剂Tween和Triton-100对本发明低温碱性蛋白酶活力基本没有影响。在1g/L和5g/L的CTAB处理后，残留酶活分别为57.6％和32.5％。

1，10-邻二氮杂菲是典型的Zn²⁺抑制剂，5mmol/L的1，10-邻二氮杂菲与酶孵育30min后酶活降至62％，表明活性中心附近可能有Zn²⁺离子。丝氨酸抑制剂苯甲基磺酰氟(PMSF)对酶活力没有影响，表明活性中心可能不含丝氨酸。5mmol/L的二硫苏糖醇抑制了50％的酶活，说明二硫键可能是稳定三级结构所必需。此外，5mmol/L的变性剂尿素对酶活力也没有影响。

本发明低温碱性蛋白酶对一些人工底物例如L-赖氨酸硝基苯酯氢溴酸盐(L-Lysine p-nitroanilide dihydrobromide)，未表现出水解作用。

本发明低温碱性蛋白酶对氧化型牛胰岛素B具有较广的酶切位点。酶切3min，此蛋白酶优先切割Ala14-Leu15，Leu15-Tyr16，Tyr 16-Leu17，其中Leu15-Tyr16是绝大部分碱性蛋白酶的酶切位点。酶切60min，可以确定的酶切位点有Asn3-Gln4，Gln4-His5，Cys7-Gly8，Glu13-Ala14，Ala14-Leu15，Leu15-Tyr16，Tyr 16-Leu17，Tyr 26-Thr27，可能存在的酶切位点有Phe25-Tyr26，Leu6-Cys7，Gly8-Ser9，Gly20-Glu21，Val18-Cys19，Cys19-Gly20，Val12-Glu13，此蛋白酶在P1位点并未表现出较强的选择性。

各氨基酸缩写对应的中文名称：

  中文名称  三字母缩写  亮氨酸  Leu  酪氨酸  Tyr  天冬酰胺  Asn  谷氨酰胺  Gln  组氨酸  His  半胱氨酸  Cys  甘氨酸  Gly  谷氨酸  Glu

  苏氨酸  Thr  苯丙氨酸  Phe  缬氨酸  Val  丝氨酸  Ser  丙氨酸  Ala

配制pH9.0，浓度为0.05-0.5％的酪蛋白溶液，测定各个底物浓度(S)对应的反应初速度(S)，以1/[V]为纵坐标，1/[S]为横坐标作图，得到方程：Y＝0.00131+7.95136E-4*X(R＝0.9987)，由斜率及截距算出K_m＝0.607m l，υ_max＝763.359U/ml。

本发明提供的低温碱性蛋白酶可以作为洗涤剂用蛋白酶。

本发明低温碱性蛋白酶对EDTA，表面活性剂十二烷基磺酸钠(SDS)，氧化剂和漂泊剂的耐受性常用于衡量其在洗涤环境下的稳定性。室温下放置30min后，该酶对EDTA，SDS和H₂O₂耐受性良好，剩余酶活分别为79.6％，62.4％和97％显示了良好相容性。

本发明低温碱性蛋白酶与商业洗涤剂相容性良好：国内的奥妙牌衣粉对该酶活力影响最大，处理后残余酶活为84.9％，碧浪、立白和雕牌等品牌洗衣粉对酶活力基本没有影响。

本发明低温碱性蛋白酶加入到市售洗衣粉后，加强了去污有效性能，且效果明显好于对照酶波力低温酶Polarzyme(丹麦诺维信公司)。

本发明提供的低温碱性蛋白酶，来源于自行筛选的菌株Pseudomonas mosseliiXG1，显示了很强的pH耐受性，在pH12.0的反应体系中保留最佳活力的80％-90％；用pH6.0-11.0缓冲液处理1h后，酶活为最高活力的90％以上，pH5.0-6.0缓冲液处理1h后，酶活为最高活力的80％左右。该蛋白酶在低温环境下仍具有活性，而且与商业洗涤剂相容性良好。与市售常规洗涤用酶相比，本发明低温碱性蛋白酶的加入增加了市售洗衣粉的去污有效性能，且效果明显好于对照酶。因此该酶可作为优良的洗涤剂用酶。

附图说明

图1是纯化后的蛋白酶的SDS-PAGE电泳图，其中：泳道1-Marker；泳道2-纯化后的蛋白酶；

图2表示pH值对本发明低温碱性蛋白酶活力的影响；

图3表示本发明低温碱性蛋白酶的pH稳定性；

图4表示金属离子对本发明低温碱性蛋白酶活力的影响；

图5表示抑制剂对本发明低温碱性蛋白酶的影响；

图6表示本发明低温碱性蛋白酶与洗涤剂组分及商业洗涤剂的相容性，其中：1-5mM EDTA；2-2％H₂O₂；3-0.1％SDS；4-对照；5-汰渍洗涤剂；6-碧浪洗涤剂；7-奥妙洗涤剂；8-立白洗涤剂；9-雕牌洗涤剂；

图7表示本发明低温碱性蛋白酶对基础洗涤剂(立白去渍霸)洗涤性能的影响，其中：A-本发明低温碱性蛋白酶；B-波力低温酶Polarzyme。

具体实施方式

实施例1Pseudomonas mosselii XG1的筛选和鉴定

(1)Pseudomonas mosselii XG1的筛选

土壤样本采集自南京紫金山和南京工业大学江浦校区。采用梯度稀释涂布法，选用不同稀释度的样品处理液涂布到脱脂牛奶平板上，30℃培养，观察菌株生长状况和透明圈的形成和大小。挑取在脱脂牛奶平板上透明圈较大的单个菌落分离纯化，并进行斜面保藏。将各纯菌株接入发酵培养基中，200转/分钟，30℃振荡培养48h，测定蛋白酶活力，最终筛选到最适反应温度为40℃以下的蛋白酶产生菌XG1。

脱脂牛奶平板(g/L)：脱脂奶粉12，琼脂18。

蛋白酶活力的测定方法：福林法测定蛋白酶活力，以酪蛋白为底物。取发酵液上清1ml，加入3ml 10％三氯乙酸溶液(10g三氯乙酸溶于100ml水中)终止反应，然后加入2ml底物(0.5％酪蛋白溶液)，置于40℃下反应15min后取出，作为空白对照。同时另取发酵液上清1ml加入到2ml底物中，在40℃下反应15min后取出加入3ml三氯乙酸溶液终止反应，作为样品。取出各管，室温下静置15min后利用离心(10000g，3min)，上清留用。另取试管各加入上清1ml，然后分别加入0.55％碳酸钠溶液5ml，最后加入福林酚试剂1ml，将各管充分混匀后，放于40℃水浴中精确显色15min，取出各管冷却到室温，以空白为对照，测样品的A650，计算出蛋白酶活力。

(2)Pseudomonas mosselii XG1的鉴定

菌株XG1为革兰氏阴性、短杆状小细菌，30℃培养时，在MLB平板上为浅黄色、湿润、突起的小菌落，边缘整齐，易挑取。20℃培养时，菌落会产生黄绿色色素。

采用16S rDNA序列分析，发现菌株XG1的16s rDNA序列与Pseudomonasmosselii的16S rDNA序列同源性高达99％，表明该菌株为Pseudomonas mosselii，命名为Pseudomonas mosselii XG1。

实施例2本发明低温碱性蛋白酶的制备、纯化和性质

(1)Pseudomonas mosselii XG1制备低温碱性蛋白酶的方法

MLB平板培养基(g/L)：酵母粉5，蛋白胨10，氯化钠5，硫酸镁0.5，琼脂粉18。

种子培养基(g/L)：棉酚蛋白10，麦芽糖10，磷酸二氢钾1，硫酸镁0.5。

发酵培养基：同种子培养基。

将菌株Pseudomonas mosselii XG1直接由-80℃冻存管中接种至MLB平板培养基，于20℃-30℃培养12h，刮下菌泥接入种子培养基，发酵温度为20℃-30℃，培养12h后按1％(体积百分比)接种量接至发酵培养基，摇床转速为200转/分钟，装液量为40ml/250mL摇瓶。发酵20-80h，收取发酵液，离心(6000转/分钟)，获得发酵液上清液，即为粗酶液。

(2)本发明低温碱性蛋白酶的纯化

①低温特性测定

将Pseudomonas mosselii XG1的48h粗酶液在4℃放置72h，每隔12h取样测蛋白酶活力并做SDS-PAGE电泳。实验显示该粗酶蛋白条带数量较少，可能本发明低温碱性蛋白酶自分泌即开始剪切发酵液中的杂蛋白所致。粗酶液在4℃放置72h后，45KDa以下的蛋白带明显变淡，而酶的活力基本没有下降，由此推断该酶在4℃下也能降解发酵液中的一部分杂蛋白。

②由于该酶具有上述的低温剪切性质，将发酵48h后的粗酶液在4℃放置72h，然后于低温下加入固体硫酸铵至30％饱和度，4℃静置7-8h，离心(12000g，30min，4℃)除去不溶性杂蛋白。再向上清中加固体硫酸铵至70％饱和度，4℃静置8-10h，离心(12000g，30min，4℃)后收集沉淀。该纯化后的酶已达到电泳纯(如图1)，比活由702.8U/mg提高到2499.5U/mg，提纯了3.56倍，收率为50.7％。该酶基于十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳的分子量为44-46KDa。

(3)酶的性质

①酶的最适反应温度

取1mL纯化后的酶液，加入2mL pH 9.0，0.5％(质量浓度)的酪蛋白，分别测定该蛋白酶在反应温度为0℃、10℃、20℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、60℃和70℃的活力。实验结果表明，该酶的最适反应温度为35℃-40℃，为低温蛋白酶。当反应温度为15℃时，该酶活性保留最高活力的32％-36％，当反应温度为4℃时，该酶活性保留最高活力的14％-16％。

②最适反应pH

以不同pH缓冲液配制的0.5％(质量浓度)酪蛋白为底物，测定40℃下的蛋白酶活力。所使用的缓冲液包括：柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲液，pH4.0-6.0；甘氨酸-NaOH缓冲液pH8.6-10.5；Na₂HPO₄-NaOH缓冲液，pH11-12。结果如图2所示，该蛋白酶最适反应pH为8.5-9.5，在pH12.0的反应体系中保留最佳活力的80％-90％，表明该蛋白酶具有耐受高碱性环境的能力，该菌株所产蛋白酶为碱性蛋白酶并具有广泛的pH适应性。

③热稳定性和pH稳定性

将本发明低温碱性蛋白酶分别置于40℃、45℃、50℃、55℃保温处理60min，每隔15min取样，在Ca²⁺的保护下，以pH9.0，0.5％酪蛋白为底物，40℃反应，检测蛋白酶剩余活力。该蛋白酶在40℃下较稳定，45℃下半衰期为48min，经50℃或55℃处理10min后几乎丧失全部活力，表明该菌株所产蛋白酶不能耐受高温。

将本发明低温碱性蛋白酶与等体积不同pH的缓冲液混合，于25℃保温1h，以pH9.0，0.5％的酪蛋白为底物测定酶活力。所使用的缓冲液包括：柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲液，pH4.0-6.0；甘氨酸-NaOH缓冲液pH8.6-10.5；Na₂HPO₄-NaOH缓冲液，pH11-12。从图3中可以看出该酶在pH7.0-9.0时最为稳定，在pH6.0-11.0酶活为最高活力的90％以上，pH5.0-6.0，pH 12.0酶活为最高活力的80％左右，显示了很宽的pH耐受性。

④蛋白酶的自我剪切作用

将本发明低温碱性蛋白酶在37℃孵育24h，每隔12h取样，SDS-PAGE检测酶自动酶剪切情况。经实验，本发明蛋白酶在37℃放置24h后仅出现微弱的条带，说明此蛋白酶可能存在很微弱的自我剪切，这对于蛋白酶的保藏及正常行使其功能是有利的。

⑤金属离子对蛋白酶活力的影响

向本发明低温碱性蛋白酶中分别添加终浓度为5mmol/L的MgCl₂、ZnSO₄、CuAc₂、CaCl₂、MnCl₂、FeSO₄和LiCl，在25℃下放置30min后以pH9.0，0.5％的酪蛋白为底物测定酶活力，以不添加金属离子的蛋白酶液为对照。

金属离子对蛋白酶活力的影响结果见图4。Mn²⁺能显著促进该蛋白酶活力，4℃下处理30min后酶活增加至161％，Fe²⁺微弱抑制蛋白酶活力，其他金属离子对该酶活力无显著影响。

⑥抑制剂对蛋白酶活力的影响

将本发明低温碱性蛋白酶与不同浓度的各种表面活性剂和抑制剂混合，25℃下放置30min后以pH9.0，0.5％的酪蛋白为底物测定酶活力，对照为加入了等体积缓冲液的酶液。

实验结果见图5。表面活性剂Tween和Triton-100对本发明低温碱性蛋白酶活力基本没有影响。在1g/L和5g/L的CTAB处理后，残留酶活分别为57.6％和32.5％。1，10-邻二氮杂菲是典型的Zn²⁺抑制剂，5mmol/L的1，10-邻二氮杂菲与酶孵育30min后酶活降至62％，表明活性中心附近可能有Zn²⁺离子。丝氨酸抑制剂苯甲基磺酰氟(PMSF)对酶活力没有影响，表明活性中心可能不含丝氨酸。5mmol/L的二硫苏糖醇抑制了50％的酶活，说明二硫键可能是稳定三级结构所必需。此外，5mmol/L的变性剂尿素对酶活力也没有影响。

⑦人工底物检测酶的底物特异性

将人工底物L-Lysine p-nitroanilide dihydrobromide(L-赖氨酸硝基苯酯氢溴酸盐)，Z-L-Phe p-nitroanilide(苄氧羰基保护L-苯丙氨酸硝基苯酯)用二甲亚枫(DMSO)配成5mmol/L的浓度备用。该酶对上述两种底物均未表现出水解作用。

⑧天然底物检测蛋白酶的底物特异性

50μg氧化型牛胰岛素B链溶于250μL10mmol/L pH 9.0的Tris-HCl缓冲液。控制底物/酶质量比为3000∶1，40℃进行反应，在0、3、6、9、12、15、18、30、60min分别取出30μl样品，100℃加热5min使酶失活。使用MILLIPORE公司的ziptip C180.6μμL脱盐柱对牛胰岛素酶切产物进行脱盐。将反应3min和60min的酶切牛胰岛素B链样品用Maidi-tof进行检测，Maidi-tof检测委托中国科学院生物物理所完成。

本发明低温碱性蛋白酶具有较广的酶切位点。从3min酶切样品的分析结果可以看出，此蛋白酶优先切割Ala14-Leu15，Leu15-Tyr16，Tyr 16-Leu17，其中Leu15-Tyr16是绝大部分碱性蛋白酶的酶切位点。60min样品分析结果中可以确定的酶切位点有Asn3-Gln4，Gln4-His5，Cys7-Gly8，Glu13-Ala14，Ala14-Leu15，Leu15-Tyr16，Tyr 16-Leu17，Tyr 26-Thr27，可能存在的酶切位点有Phe25-Tyr26，Leu6-Cys7，Gly8-Ser9，Gly20-Glu21，Val18-Cys19，Cys19-Gly20，Val12-Glu13，此蛋白酶在P1位点并未表现出较强的选择性。

⑨酶的动力学常数测定

配制pH9.0，浓度为0.05-0.5％的酪蛋白溶液，测定各个底物浓度(S)对应的反应初速度(S)，以1/[V]为纵坐标，1/[S]为横坐标作图，得到方程：Y＝0.00131+7.95136E-4*X(R＝0.9987)，由斜率及截距算出K_m＝0.607m l，υ_max＝763.359U/ml。

实施例3本发明低温碱性蛋白酶的洗涤性能

(1)本发明低温碱性蛋白酶与洗涤剂组分及商业洗涤剂的相容性

将本发明低温碱性蛋白酶分别与终浓度5mmol/L的金属离子鳌合剂乙二胺四乙酸(EDTA)，2％H₂O₂及2g/L的各种商业洗涤剂相混合以模拟洗涤环境，室温下放置30min后以pH9.0，0.5％的酪蛋白为底物测定酶活力，对照为加入了等体积缓冲液的酶液。

本发明低温碱性蛋白酶与各种洗涤剂组分及商业洗涤剂的相容性见图6，对照为同样体积的pH9.0，50mmol/L Gly-NaOH缓冲。蛋白酶对EDTA，表面活性剂十二烷基磺酸钠(SDS)，氧化剂和漂泊剂的耐受性常用于衡量其在洗涤环境下的稳定性。室温下放置30min后，该蛋白酶对EDTA，SDS和H₂O₂耐受性良好，剩余酶活分别为79.6％，62.4％和97％显示了良好相容性。

该蛋白酶与商业洗涤剂相容性良好：奥妙洗衣粉对Pseudomonas mosseliiXG1蛋白酶活力影响最大，处理后残余酶活为84.9％，其他洗涤剂对酶活力基本没有影响。

(2)本发明低温碱性蛋白酶在合成洗衣粉中的去污性能与比较

将发明低温碱性蛋白酶加入到基础洗涤剂(立白去渍霸)中，以相同的酶含量(1％)、不同的洗涤温度进行去污性能的比较。试验采用“标准污布”在一个模拟的洗涤系统中进行，其中织物/洗涤液大约为1.5g/L，每种酶在规定条件下独立试验三次，结果取平均值。通过测定人工污布(太原日化所)洗涤后的白度变量ΔR(ΔR＝加酶洗涤污布白度值-基础洗涤污布白度值)，比较去污效果；以高效蛋白酶波力低温酶Polarzyme(丹麦诺维信公司)作为检测去污性能对照(见图7)，该图显示不同温度下各种蛋白酶的洗涤效能。实验结果表明：与波力低温酶Polarzyme相比，本发明低温碱性蛋白酶的加入增加了市售洗衣粉的去污有效性能，且效果明显好于对照酶。

其他实验条件：涡轮式洗衣机，搅拌速度100转/min。浸泡15min后洗涤20min，洗涤后冲水时间20min；基础洗涤剂的添加量2.0g/L、洗涤液pH8.0、水硬度150ppmCaO。