发酵多杀菌素产生菌的培养基

摘要

本发明提供一种以Saccharopolyspora spinosa NRRL 18395为菌种，发酵多杀菌素产生菌的培养基，其组分及含量为：碳源5.0～9.0％、氮源3.0～7.0％、植物油0.2～2.5％、氨基酸0.1～0.5％、CaCO3 0.1～1.0％和水81.0～91.6％。利用本发明的发酵培养基，可使多杀菌素产生菌在原有发酵水平基础上最高提高19倍，有利于国内多杀菌素的产业化。

说明书

技术领域

本发明属于生物农药生产技术领域，具体涉及一种发酵多杀菌素产生菌的培养基。

背景技术

多杀菌素(Spinosad)是1982年美国礼莱公司科研人员从维尔京群岛土壤中分离的刺糖多胞菌(Saccharopolyspora spinosa)发酵液中提取得到的一种新颖的大环内酯类超高效生物源杀虫剂。由美国陶氏农业科学公司生产，于1999年在我国注册商品名为催杀(Tracer 48％悬浮液)和菜喜(Success 2.5％悬浮液)，分别应用于小菜蛾和棉铃虫等的防治。其有效成份为Spinosyn A和D，其中A和D比例分别为85％和15％。多杀菌素主要应用于对棉铃虫、烟青虫、小菜蛾、果蝇、甜菜夜蛾、蓟马等的防治，适用于棉花、茶、蔬菜和苹果、梨、桃等落叶果树。到1999年多杀菌素已经在24个国家、100多种作物上进行了注册登记。

由于多杀菌素的毒性低，阳光下易分解，使用悬浮液不同pH对其活力不受影响，经美国环保局(Enviromental Protection Agency)测定该药剂不滞留于环境中，为低毒、高效的生物杀虫剂。

多杀菌素因其具有降解完全，对害虫高效，对哺乳动物、鸟类、鱼类甚至大多数益虫具有宽广的安全界限等优点而获得美国“总统绿色化学品挑战奖”。多杀菌素的一个重要特点是其选择毒性比远高于其他常用农药，比阿维菌素大300-400倍。

美国专利US5362634公开了一种多杀菌素产生菌发酵用培养基，其中供试菌株为Saccharopolyspora spinosa NRRL 18395，所述发酵培养基的配方及含量为：葡萄糖4％、植物蛋白(部分酶水解)1.5-3％、棉籽粉1.0％、CaCO₃0.3％、大豆油1.0％、加自来水至1升。该培养基的发酵单位为59.3mg/L。鉴于此发酵配方的发酵单位偏低，因此不利于产业化。

国内对多杀菌素的研究尚处于试验阶段。与其它农抗产生菌一样，环境条件是影响多杀菌素产生菌的产素水平的一个重要因素，因此研究一种高效、价格低廉的发酵培养基是解决多杀菌素产业化问题的一个技术关键。在现有的技术中，多杀菌素的发酵培养基效果不佳，发酵单位偏低，不能满足产业化的需要，并且存在原料成本较高和来源有限等问题，并在发酵过程中无法有效控制消除泡沫，发酵液中常含有没有被利用完全的多糖从而导致发酵液粘稠不利用后续提取步骤的进行。因此解决以上问题成为多杀菌素产业化过程中必须面对的问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是通过培养基优化实验，提供一种有利于产生多杀菌素(发酵单位提高)的发酵培养基。利用本发明的发酵培养基，可使多杀菌素产生菌在原有发酵水平基础上最高提高19倍，有利于国内多杀菌素的产业化。

本发明中，％比为重量百分比；

术语“速效碳源”指葡萄糖、果糖、甘露醇。

术语“迟效碳源”指蔗糖、麦芽糖、乳糖、淀粉、糊精、可溶性淀粉。

本发明提供一种以Saccharopolyspora spinosa NRRL 18395为菌种，发酵多杀菌素产生菌的培养基，其组分及含量为：碳源5.0～9.0％、氮源3.0～6.0％、植物油0.2～2.5％、氨基酸0.1～0.5％、CaCO₃ 0.1～1.0％和水81.0～91.6％。

其中，所述的碳源可以选自葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖、甘露醇、乳糖、淀粉、糊精、可溶性淀粉或其组合；优选为葡萄糖，其含量优选为8.0％。

所述的氮源可以选自全脂奶粉、鱼粉蛋白胨、花生粕粉、玉米浆、棉籽粉、花生饼粉或其组合；优选为棉籽粉和鱼粉蛋白胨，且所述棉籽粉∶鱼粉蛋白胨的重量比为2～4∶0～2，优选为3∶2。

所述的植物油可以选自大豆油、棉籽游、玉米油、葵花油或其组合；优选为葵花油，其含量优选为2.0％。

所述氨基酸可以选自谷氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、缬氨酸、亮氨酸或其组合；优选为赖氨酸，其含量优选为0.1％。

所述水可以选自自来水或蒸馏水，优选为自来水。

本发明最优选的培养基的组分及含量为：葡萄糖8.0％、棉籽粉3.0％、鱼粉蛋白胨2.0％、葵花油2.0％、赖氨酸0.1％、CaCO₃ 0.5％、和自来水100ml。

上述最优选配方的培养基的发酵单位最高可达1150mg/L，是原有发酵水平的19倍。

本发明培养基配方中，所用的氮源配方简单，来源丰富；所用碳源中不含多杀菌素产生菌不容易利用的迟效碳源，这样就使得发酵液离心后上清液保持澄清，有利于后续提取步骤的进行；另外，此配方中所用植物油含量增加至2.0％，不仅使发酵单位有了提高，而且对于发酵过程中利用泡敌会严重抑制多杀菌素产生的情况来说更有利发酵过程当中泡沫的消除。

具体实施方式

实施例1：本发明培养基最佳配方的确定

1)：单一碳源类型的确定实验

方法：以基础发酵培养基配方为对照，氮源成分及加量不变，分别加入葡萄糖、淀粉、可溶性淀粉、糊精、果糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、甘露醇等多碳源进行单一因素碳源实验，每种碳源加量相当，均为6％。摇瓶发酵8天，进行HPLC效价测定。

2)：碳源组合实验

根据上述结果进行选择葡萄糖作为速效碳源，与其他迟效碳源进行组合实验。摇瓶发酵8天，进行HPLC效价测定。

3)：葡萄糖加量实验

在基础培养基其他成分不变的情况下，将葡萄糖作为唯一碳源，分别添加不同量进行实验，摇瓶发酵8天，进行HPLC效价测定。

  葡萄糖加量(％)  相对效价(％)  葡萄糖6.0  0.82  葡萄糖7.0  0.94  葡萄糖8.0  1.00  葡萄糖9.0  0.61

由上述结果表明，迟效碳源对多杀菌素生产效果不明显，因此本实验只选用了葡萄糖作为多杀菌素产生菌的唯一碳源，加量为8％。

4)：单一氮源实验

方法：以基础发酵培养基配方为对照，碳源成分及加量不变，分别加入奶粉、鱼粉蛋白胨、花生粕粉、玉米浆、棉籽粉、花生饼粉进行单一因素氮源实验，每种氮源加量相当，均为3.4％。摇瓶发酵8天，进行HPLC效价测定。

5)：氮源组合正交实验

方法：根据实验1-3结果，确定葡萄糖作为唯一碳源，保持加量为8％不变。根据实验4中单一氮源实验结果选取全脂奶粉、棉籽粉、鱼粉蛋白胨进行三水平三因子实验。

由以上实验得出氮源含量及配比为棉籽粉∶鱼粉蛋白胨＝3∶2为最佳.

6)：前体植物油添加实验

油脂在发酵过程中常常能被菌体利用，菌体具有活跃的脂肪酶，把油脂水解成脂肪酸和甘油，二者通过代谢为菌体提供碳源和能源。多杀菌素为新型的大环内酯类化合物，生物合成也是通过聚酮合成途径，因此，从另一个角度来说，油脂水解并且通过代谢后生成的短链脂肪酸，也为多杀菌素的合成提供了前体。除此之外，在发酵过程中添加油脂还能代替泡敌起到消除泡沫的作用，尤其对于多杀菌素的合成会受到泡敌严重抑制的情况来说，油的添加意义重大。

由以上实验确定碳氮源类型及加量后，进行前体油添加实验

由此确定葵花油效果最好。在此基础上进行葵花油加量实验。

7)：前体氨基酸类型实验

多杀菌素为新型的大环内酯类化合物，生物合成也是通过聚酮合成途径，而支链氨基酸经过代谢后产生短链脂肪酸，可以促进多杀菌素的聚酮合成。因此本实验选用了几种支链氨基酸来做为前体。并且蛋氨酸也可为多杀菌素的合成提供必要的甲基，来促进产物的合成。

在前期实验基础上确定碳、氮源、油类型及添加量，并作为对照，然后进行氨基酸添加实验，每种氨基酸添加量为1％。

8)：水类型实验

在确定培养基中各营养成分后，进行水类型实验.

实施例2

利用多杀菌素产生菌Saccharopolyspora spinosa发酵，发酵培养基按照下表所列数据(重量百分比)进行配置：

葡萄糖5.0、棉籽粉2.0、鱼粉蛋白胨1.0、葵花油2.0、赖氨酸0.2、CaCO₃0.3和自来水89.5。

121℃灭菌30min。接种量10％，装量100ml/750ml，置于28℃恒温室中旋转式摇床250rpm摇瓶发酵8天后，取发酵液2ml，离心取菌丝体，用6ml的丙酮浸泡过夜，再离心取上清进行HPLC效价测定，发酵单位为536mg/L。

实施例3

利用多杀菌素产生菌Saccharopolyspora spinosa发酵，发酵培养基按照下表所列数据(重量百分比)进行配置：

葡萄糖8.0、棉籽粉3.0、鱼粉蛋白胨2.0、葵花油2.0、赖氨酸0.1、CaCO₃0.5和自来水84.4.

121℃灭菌30min。接种量10％，装量100ml/750ml，置于28℃恒温室中旋转式摇床250rpm摇瓶发酵10天后，取发酵液2ml，离心取菌丝体，用6ml的丙酮浸泡过夜，再离心取上清进行HPLC效价测定，发酵单位为1150mg/L。

实施例4

利用多杀菌素产生菌Saccharopolyspora spinosa发酵，发酵培养基按照下表所列数据(重量百分比)进行配置：

葡萄糖6.0、棉籽粉4.0、鱼粉蛋白胨1.0、葵花油0.2、赖氨酸0.1、CaCO₃0.4和自来水88.3。

121℃灭菌30min。接种量10％，装量100ml/750ml，置于28℃恒温室中旋转式摇床250rpm摇瓶发酵10天后，取发酵液2ml，离心取菌丝体，用6ml的丙酮浸泡过夜，再离心取上清进行HPLC效价测定，发酵单位为807mg/L。

实施例5

葡萄糖7.0、棉籽粉4.0、鱼粉蛋白胨2.0、葵花油2.5、赖氨酸0.1、CaCO₃0.2和自来水84.2。

121℃灭菌30min。接种量10％，装量100ml/750ml，置于25℃恒温室中旋转式摇床250rpm摇瓶发酵10天后，取发酵液2ml，离心取菌丝体，用6ml的丙酮浸泡过夜，再离心取上清进行HPLC效价测定，发酵单位为733mg/L。

实施例6

葡萄糖9.0、棉籽粉3.5、鱼粉蛋白胨2.0、葵花油1.0、赖氨酸0.3、CaCO₃1.0和自来水83.2。

121℃灭菌30min。接种量10％，装量100ml/750ml，置于25℃恒温室中旋转式摇床250rpm摇瓶发酵10天后，取发酵液2ml，离心取菌丝体，用6ml的丙酮浸泡过夜，再离心取上清进行HPLC效价测定，发酵单位为952mg/L。

实施例7

葡萄糖8.0、棉籽粉2.0、鱼粉蛋白胨2.0、葵花油0.5、赖氨酸0.5、CaCO₃0.7和自来水86.3。

121℃灭菌30min。接种量15％，装量80ml/750ml，置于25℃恒温室中旋转式摇床250rpm摇瓶发酵10天后，取发酵液2ml，离心取菌丝体，用6ml的丙酮浸泡过夜，再离心取上清进行HPLC效价测定，发酵单位为625mg/L。

实施例8

葡萄糖6.0、棉籽粉2.5、鱼粉蛋白胨1.5、葵花油1.5、赖氨酸0.3、CaCO₃0.6和自来水87.6。

121℃灭菌30min。接种量10％，装量100ml/750ml，置于25℃恒温室中旋转式摇床250rpm摇瓶发酵8天后，取发酵液2ml，离心取菌丝体，用6ml的丙酮浸泡过夜，再离心取上清进行HPLC效价测定，发酵单位为668mg/L。

实施例9

葡萄糖5.0、棉籽粉2.5、鱼粉蛋白胨0.5、葵花油1.0、赖氨酸0.1、CaCO₃0.6和自来水90.3。

121℃灭菌30min。接种量10％，装量100ml/750ml，置于25℃恒温室中旋转式摇床220rpm摇瓶发酵8天后，取发酵液2ml，离心取菌丝体，用6ml的丙酮浸泡过夜，再离心取上清进行HPLC效价测定，发酵单位为421mg/L。

实施例10

葡萄糖7.0、棉籽粉3.0、鱼粉蛋白胨0.5、葵花油1.7、赖氨酸0.4、CaCO₃0.6和自来水86.8。

121℃灭菌30min。接种量20％，装量40ml/750ml，置于28℃恒温室中旋转式摇床250rpm摇瓶发酵8天后，取发酵液2ml，离心取菌丝体，用6ml的丙酮浸泡过夜，再离心取上清进行HPLC效价测定，发酵单位为689mg/L。

实施例11

葡萄糖7.0、棉籽粉4.5、鱼粉蛋白胨1.5、葵花油2.5、赖氨酸0.1、CaCO₃1.0和自来水83.4。

121℃灭菌30min。接种量10％，装量100ml/750ml，置于28℃恒温室中旋转式摇床250rpm摇瓶发酵8天后，取发酵液2ml，离心取菌丝体，用6ml的丙酮浸泡过夜，再离心取上清进行HPLC效价测定，发酵单位为413mg/L。

实施例12

葡萄糖6.0、棉籽粉4.0、葵花油2.0、赖氨酸0.1、CaCO₃ 0.5和自来水87.4。

121℃灭菌30min。接种量10％，装量100ml/750ml，置于28℃恒温室中旋转式摇床250rpm摇瓶发酵8天后，取发酵液2ml，离心取菌丝体，用6ml的丙酮浸泡过夜，再离心取上清进行HPLC效价测定，发酵单位为356mg/L。

附表：

主要试剂

主要仪器