7及20位脱氢水飞蓟宾双烷醚及其制备方法和药物用途

摘要

本发明涉及7及20位脱氢水飞蓟宾双烷醚及其制备方法和药物用途，该类化合物具有显著抑制自由基诱导的脂过氧化物生成的活性；强效的保护双氧水引起的大鼠肾上腺嗜铬瘤PC12细胞损伤作用，即对模拟脑神经细胞的PC12细胞有抗氧化损伤保护作用；说明其对保护脑细胞组织抗氧化和脑神经抗氧化、防治老年性痴呆症等神经退行性疾病有积极作用。此外，该类化合物还对亚铁离子显示出强效螯合作用。药效学结果表明该类脱氢水飞蓟宾双醚化合物可以预期用于制备防治神经退行性疾病类药物的用途。

说明书

技术领域

本发明涉及有机合成和医药技术领域。具体而言，本发明涉及7位和20位同时烷基取代的脱氢水飞蓟宾双醚的制备方法及其药物用途，该类化合物具有显著抑制自由基诱导的脂过氧化物生成的活性；强效的对抗双氧水引起的大鼠肾上腺嗜铬瘤PC12细胞损伤作用，即对模拟脑神经细胞的PC12细胞有抗氧化损伤保护作用；说明其对保护脑细胞组织抗氧化和脑神经抗氧化、防治老年性痴呆症等神经退行性疾病有积极作用。此外，该类化合物还对亚铁离子显示出强效螯合作用，以上药效学结果表明该类脱氢水飞蓟宾双烷醚化合物可以预期用于制备防治神经退行性疾病类药物的用途。

背景技术

神经退行性疾病(neurodegenerative disease)是极为可怕的一系列毁灭性的疾病，其可以毁坏中枢神经系统功能，导致多种认知缺陷和/或行动缺陷。就目前的医疗技术而言，此类疾病是致残率及致死率均高的不可治愈性疾病。已构成现代社会尤其是老龄化社会的一大健康隐患。老年性痴呆症(即Alzheimer’s Disease，简称AD)、帕金森氏症(即Parkinson’s Disease，简称PD)、亨廷顿舞蹈病、蛋白感染素病(prion disease)、肌萎缩性(脊椎)侧索硬化都遭遇到大量的神经元丢失。全世界尤其是发达国家将越来越多的研究经费投入到这种神经退行性疾病的成因和治疗研究中，开发了一系列防治神经退行性疾病的新药，并取得了很好的经济效益和社会效益。其中，老年性痴呆症在我国发病率逐年增高，给国民生活带来极大的负面影响，给患者家庭和社会保障体系带来了巨大的负担。

衰老是老年性痴呆的一大诱因，而衰老基本上都是由自由基攻击细胞开始的。自由基是一种十分有害的物质，能导致细胞死亡或不可逆的伤害。除了引起衰老外，还导致神经退行性发生和神经元死亡。该类活性氧(reactive oxygen species，简称ROS)可对细胞主要成分如细胞核、线粒体DNA、细胞膜和细胞质蛋白质造成损伤。实验发现：神经元对自由基非常敏感，此类自由基和活性氧的产生一旦出现失衡，神经元细胞很可能遭到持续损伤并造成神经退行性疾病诸如老年性痴呆。老年性痴呆患者的脑组织解剖检查发现许多自由基攻击的痕迹：如线粒体DNA和核DNA损伤、蛋白氧化损伤、脂质过氧化、产生深度糖基化最终产物(AGEs)等。自由基攻击β-淀粉样蛋白使之聚合形成纠结及结块，或者生成多肽自由基。抗氧化剂如自由基清除剂可以减缓自由基对β-淀粉样蛋白的毒性损伤。

越来越多的实验证明氧化还原性金属如铜和铁，以及氧压(oxygen stress)是导致老年性痴呆症的重要诱因。铜和铁金属可以与Aβ肽直接作用，生成的β淀粉样蛋白是造成AD患者的元凶。金属与Aβ的结合可以使Aβ的物化性质改变从而导致该肽的病变。Huang等人的体外实验证实：金属可以促进Aβ的堆积，在AD患者脑部解剖学检验还发现难溶的淀粉样块中金属铜、铁和锌的含量极高，异于常态。采用金属螯合剂可以大大减轻此类蛋白沉积物。在对APP转基因AD症小鼠的研究中还发现，金属螯合剂可以减轻小鼠脑中Aβ淀粉样蛋白的沉积量。双氧水实验证明，金属螯合剂还可以有效减轻双氧水对Aβ的细胞毒性以及降低Aβ淀粉样蛋白的前体物APP的生成。因此，能够与金属离子形成复合物的物质有望与抗氧化剂一同形成治疗AD的药物[X.Huang，R.D.等，Ann.N.Y.Acad.Sci.，2004，1012：153-163]。Aβ能够催化Fe³⁺还原为Fe²⁺，而过程中产生活性氧以及双氧水，双氧水又与Fe²⁺进行Fenton反应从而生成危害性最强的羟基阴离子。故而能够螯合Fe²⁺的物质将有效地降低羟基阴离子的生成，从而减轻脑损伤和老年性痴呆的几率。

脂质过氧化是自由基作用于多不饱和脂肪酸的产物，含量与自由基的生成正相关，由于机体有抗氧化的酶系及非酶系的保护作用，使自由基不断产生又不断被清除。随着年龄的增长，体内的抗氧化剂不断下降，清除自由基的能力逐渐减弱，脂质过氧化作用则增强，脂质过氧化产物增多。脂质过氧化是AD一个重要的发病机理[Busciglio等，Nature，1995，378：776-779]。研究指出：在与AD近似乃至一致的退行性疾病唐氏综合症(Down Syndromes)，神经元发生凋亡而死亡，这种凋亡便是由脂质过氧化引起。使用过氧化氢酶和自由基清除剂可以阻止这种脂质过氧化造成的神经元凋亡。

此外，活性氧能造成细胞膜双磷脂层的变化和损伤，有些双磷脂层的破坏直接造成AD的病因[Nitsch，R.M.，Proc.Natl.Acad.SCi.U.S.A.1992，89：1671-1675]。Markesbery的研究显示：脂质过氧化可以造成细胞膜双磷脂层的降解从而导致AD患者发病[Markesbery，W.R.，Free Radic Bio Med，1997，23：134-147]。因此，使用抗氧化剂和铁离子螯合剂都可以减缓脂质过氧化和AD的进程。现在常见的抗氧化制剂有维生素C、维生素E、银杏制剂EGb761、褪黑激素、黄酮和胡萝卜素类。由于市场的需要，更多的抗氧化剂诸如雌激素类也开始活跃。

众多的抗自由基天然产物除了前述的维生素C、维生素E、银杏制剂EGb761、褪黑激素、黄酮和胡萝卜素外，水飞蓟提取物也是少数几个在临床上广泛应用的药物之一。三十多年的临床实验证明该药具有确切的疗效和低毒性(参阅Flora K.等，Am.J.Gastroenterol，1998，93，139-143；Saller R.等，Drugs，2001，61(14)，2035-2063)。水飞蓟素中水飞蓟宾含量最多，活性也相对最高。故关于水飞蓟宾(Silybin)之药效学研究最为广泛。国家食品与药品监督管理局制订的国家药品标准水飞蓟素一栏中，要求含水飞蓟素以水飞蓟宾计算，不得少于68％。

由于水飞蓟宾类化合物具有确切的疗效，因此以Silybin为母体化合物，设计合成并用药效学试验寻找水飞蓟宾类新的衍生物，使其能够具有更高或者更新的药理活性，以期获取自主知识产权的新药，实属必要。如发明人在水飞蓟宾的B环上引入甲氧基就显著提高了其清除超氧阴离子自由基的活性[杨雷香，赵昱等，“Synthesis andAntioxidant Properties Evaluation of Novel Silybin Analogue”，Journalof Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry，2006，21(4)，399-404]。

根据碳链越长、碳数越多则亲脂性越强的设计原则，同时其亲脂性得到加强，有利于提高其通过血脑屏障、在脑部脂质体层直接发挥药效的功力，我们设计并合成出了新的7位和20位同时取代的一系列烷基脱氢水飞蓟宾双醚，以期这些Silybin衍生物对老年性痴呆等脑神经退行性疾病起到预防及治疗的作用。

鉴于至今尚无相关文献报道增强了引入上述亲脂性基团后的脱氢水飞蓟宾是否能提高其抗氧化活性，为了证明此类新型结构的化合物抗神经退行相关之药效学活性，本发明还用了多种抗氧化损伤药效学模型对我们设计合成出的化合物进行了检验和药效学评价。首先，我们测试了H₂O₂诱发PC12细胞的抗氧化损伤能力。目前比较肯定的用于研究神经退行性疾病(主要是胆碱能神经系统)的体外细胞模型主要有3种：原代培养的海马、皮层、基底前脑神经细胞，大鼠肾上腺嗜铬瘤PC12细胞和海马HT22细胞株。PC12细胞在培养过程中以其易获得性和细胞均一性而成为神经科学离体研究中的重要工具细胞，并用于研究多种神经系统疾病，如AD、帕金森病等。双氧水H₂O₂是一种强氧化剂，它能穿透细胞膜使细胞内反应性氧自由基产生增加。本发明通过测试经H₂O₂处理后PC12细胞的死亡情况来评价新合成的抗氧化剂保护神经细胞抗氧化损伤的能力。

其次，研究了合成出的化合物对大鼠肝匀浆脂质过氧化的抑制作用。采用维生素C-Fe²⁺非酶系统诱导大鼠肝匀浆产生脂质过氧化产物丙二醛(MDA)，MDA能与硫代巴比妥酸(TBA)反应，产物在532nm处有最大吸收，通过MDA量的变化能够间接反映化合物对肝匀浆脂质过氧化的抑制作用。再者，本发明还采用了对亚铁离子Fe²⁺螯合试验，检测该水飞蓟宾双醚的作用，以期对该化合物制备有效防治老年性痴呆症获得理论根据。

药理学研究结果显示：测试化合物有强效抑制自由基诱导的脂质过氧化物生成的活性，其并且对模拟脑神经细胞的PC12细胞有抗氧化损伤和细胞保护作用，再者，实验发现其对亚铁离子有强效的清除作用。说明设计合成的脱氢水飞蓟宾双醚不仅对保护脑细胞组织抗氧化和脑神经抗氧化、防治老年性痴呆症有积极作用，从而可以预期用于制备该类药物的用途，还可以预期发展成为防治其他神经退行性疾病如帕金森氏症(PD)、亨廷顿舞蹈病、肌萎缩性(脊椎)侧索硬化的药物或药物组合物。由此完成了本发明。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有式(I)所示结构的7位、20位同时烷基取代的脱氢水飞蓟宾双醚或其可药用盐：

式(I)

其中，R是含3-7个碳的烷基，此处烷基是指饱和的或不饱和的直链或支链烷基；10，11位同时为R构型或同时为S构型。

优选的式(I)化合物包括下列结构：

I-a：7，20-双烯丙基-脱氢水飞蓟宾醚；

I-b：7，20-双(1-丁烯基)-脱氢水飞蓟宾醚；

I-c：7，20-双(2-甲基-2-丁烯基)-脱氢水飞蓟宾醚。

本发明还提供了一种制备式(I)化合物的方法，其特征是：水飞蓟宾在碱催化下与过量的烷基卤素反应制备而得；反应温度为30℃至回流，反应时间为15分钟至48小时。其中碱是无机碱或有机碱，烷基卤素是指烷基溴；过量是指参与反应的烷基卤素的摩尔数是参与同一反应的水飞蓟宾的1.5-2.8倍；水飞蓟宾是指非对应体的水飞蓟宾A或水飞蓟宾B或它们的混合物。

本发明的另一目的是提供了式(I)所示结构的7位和20位烷基取代的脱氢水飞蓟宾双醚或其可药用盐在制备一种防治神经退行性疾病类药物中的药物用途，所述的神经退行性疾病是指老年性痴呆症、帕金森氏症、亨廷顿舞蹈病、肌萎缩性脊椎侧索硬化。

本发明的又一目的是提供了一种用于防治神经退行性疾病包括老年性痴呆症(AD)、帕金森氏症(PD)、亨廷顿舞蹈病、肌萎缩性(脊椎)侧索硬化病的药物或药物组合物，其含有治疗有效量的作为活性成分的式(I)所示结构的7位和20位烷基取代的脱氢水飞蓟宾双醚或其可药用盐和可药用辅料。

本发明的再一目的是提供了式(I)化合物或其可药用盐用于制备防治肝脑脂质过氧化有关的其他生理改变或疾病药物的用途；尤其是用于防治自由基诱导之脂过氧化物生成引起的急/慢性肝损伤类疾病、炎症，也包括由脂质过氧化引起的自身免疫性疾病、放射治疗后遗症、肿瘤、心肌缺血、心肌肥厚、衰老、变态反应、动脉粥样硬化症药物的用途。

本发明的又一目的是提供了一种用于防治自由基诱导之脂过氧化物生成引起的急/慢性肝损伤类疾病、炎症，也包括由脂质过氧化引起的自身免疫性疾病、放射治疗后遗症、肿瘤、心肌缺血、心肌肥厚、衰老、变态反应、动脉粥样硬化症的药物或药物组合物，其含有治疗有效量的作为活性成分的式(I)所示之7位和20位烷基取代的脱氢水飞蓟宾双醚或其可药用盐和可药用辅料。

本发明的有益之处在于：提供了新型7位和20位同时烷基取代的脱氢水飞蓟宾双醚，并用药理实验揭示了该类化合物具有强效抗脂质过氧化，保护脑神经细胞和金属离子螯合能力，从而可预期其发展成为新型抗氧化剂药物及防治包括老年性痴呆症在内的神经退行性疾病药物的制药用途；具有潜在的巨大社会效益和经济效益。本发明中式(I)化合物由天然药物为母体制备而得，方法简单、步骤短，成本低，污染小，适于节能减排大环境下的产业化。

具体实施方式

为了更好地理解本发明的实质，下面首先用实施例的形式说明化合物制备的过程，实施例给出了化合物的部分物理和化学及波谱学数据。必须说明，本发明的实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。除非另有说明，本发明中的百分数是重量百分数。

实施例1：化合物I-a即7，20-双烯丙基-脱氢水飞蓟宾醚的制备

在干燥的反应瓶中，0.240克水飞蓟宾溶于4毫升DMF中，加入0.276克碳酸钾，搅拌10分钟使溶解完全。缓慢滴加烯丙溴0.125克，搅拌10分钟，再保持75℃加热反应3小时。静置冷却，加入20毫升蒸馏水，醋酸乙酯萃取3次(每次10毫升)，合并有机层，20毫升蒸馏水洗，无水硫酸钠干燥，减压浓缩。得棕黄色粗品，经200～300目硅胶(10克)柱层析，氯仿∶醋酸乙酯∶醋酸＝20∶1∶0.1洗脱，得到黄色晶体(I-a)74.3毫克。收率26.6％。

化合物I-a名称：2-[2，3-二氢-3-(4-烯丙基氧基-3-甲氧基苯基)-2-羟甲基-1，4-苯并二氧六环-6-]-7-(烯丙基氧基)-3，5，-二羟基-4H-1-苯并吡喃-4-酮：核磁共振氢谱¹H NMR(400MHz，氘代氯仿)δ：3.48(双双峰，J＝14.0，6.8Hz，2H，H-23)，3.95(单峰，3H，OCH₃)，4.12(双双峰，J＝14.4，7.2Hz，1H，H-10)，4.60(双峰，J＝5.2Hz，2H，H-1′)，4.59(宽单峰，2H，H-1″)，5.02(双峰，J＝8.4Hz，1H，H-11)，5.18～5.45(多重峰，4H，H-3′& H-3″)，6.01(多重峰，2H，H-2′& H-2″)，6.36(双峰，J＝1.6Hz，1H，H-6)，6.42(宽单峰，1H，H-8)，6.96～6.99(多重峰，3H，芳香环Ar-H-16，H-18 & H-22)，7.08(双峰，J＝8.4Hz，1H，H-21)，7.75(宽单峰，1H，H-13)，7.79(双峰，J＝8.4Hz，1H，H-15)，12.64(单峰，1H，5-OH)；电喷雾质谱ESI-MS：561(M+H)⁺。

实施例2：化合物I-b即7，20-双(1-丁烯基)-脱氢水飞蓟宾醚的制备

在干燥的反应瓶中，0.240克水飞蓟宾溶于4毫升DMF中，加入0.276克碳酸钾，搅拌10分钟使溶解完全。缓慢滴加4-溴-1-丁烯0.135克，搅拌10分钟，再保持75℃加热反应3小时。静置冷却，加入20毫升蒸馏水，醋酸乙酯萃取3次(每次10毫升)，合并有机层，20毫升蒸馏水洗，无水硫酸钠干燥，减压浓缩。得棕黄色粗品，经200～300目硅胶(10克)柱层析，氯仿∶醋酸乙酯∶醋酸＝20∶1∶0.1洗脱，得到黄色晶体(I-b)70毫克。收率23.8％。

化合物I-b名称：2-[2，3-二氢-3-(4-烯丁基氧基-3-甲氧基苯基)-2-羟甲基-1，4-苯并二氧六环-6-]-7-(烯丁基氧基)-3，5，-二羟基-4H-1-苯并吡喃-4-酮：R_f(氯仿∶醋酸乙酯∶醋酸＝20∶1∶0.5)0.45；核磁共振氢谱¹H NMR(400MHz，氘代氯仿)δ：2.50～2.65(多重峰，4H，H-2′&H-2″)，3.61(宽双双峰，J＝8.8，3.2Hz，1H，H-23a)，3.88(多重峰，1H，H-23b)，3.95(单峰，3H，OCH₃)，4.05～4.15(多重峰，5H，H-1′，H-1″&H-10)，5.02(双峰，J＝8.4Hz，1H，H-11)，5.05～5.21(多重峰，4H，H-4′& H-4″)，5.78～5.92(多重峰，2H，H-3′& H-3″)，6.34(双峰，J＝2.2Hz，1H，H-6)，6.41(双峰，J＝2.0Hz，1H，H-8)，6.94(双峰，J＝8.4Hz，1H，H-16)，6.98(宽双峰，J＝8.4Hz，1H，H-15)，7.00(宽双峰，J＝8.8Hz，1H，H-22)，7.08(双峰，J＝8.8Hz，1H，H-21)，7.76(宽单峰，双峰，J＝1.6Hz，1H，H-13)，7.77(宽单峰，双峰，J＝1.6Hz，1H，H-18)，12.64(单峰，1H，5-OH)；核磁共振碳谱¹³C NMR(100MHz，氘代氯仿)δ：33.20(CH₂，C-2′)，34.46(CH₂，C-2″)，55.98(OCH₃)，61.55(CH₂，C-23)，67.66(CH₂，C-1′)，71.88(CH₂，C-1″)，76.28(CH，C-11)，78.67(CH，C-10)，92.44(CH，C-8)，98.24(CH，C-6)，105.93(C，C-4a)，109.37(CH，C-13)，114.68(CH，C-18)，116.97(CH₂，C-4′)，117.06(CH₂，C-4″)，117.27(CH，C-16)，117.50(CH，C-21)，120.75(CH，C-15)，122.76(CH，C-22)，123.84(C，C-14)，127.50(C，C-17)，133.7(CH，C-3′)，134.43(CH，C-3″)，138.12(C，C-3)，143.60(C，C-20)，145.59(C，C-16a)，146.43(C，C-12a)，146.89(C，C-19)，155.45(C，C-2)，156.63(C，C-8a)，161.85(C，C-5)，164.67(C，C-7)，178.77(C，C-4)；电喷雾质谱ESI-MS：589(M+H)⁺。

实施例3：化合物I-c即7，20-双(2-甲基-2-烯丁基)-脱氢水飞蓟宾醚的制备

在干燥的反应瓶中，0.48克水飞蓟宾溶于6毫升DMF中，加入0.55克碳酸钾，搅拌10分钟使溶解完全。缓慢滴加异戊烯基溴0.33克，搅拌10分钟，再加热回流反应2小时。静置冷却，加入20毫升蒸馏水，醋酸乙酯萃取3次(每次10毫升)，合并有机层，10毫升蒸馏水洗，无水硫酸钠干燥，减压浓缩。得棕黄色粗品，经200～300目硅胶(20克)柱层析，氯仿∶醋酸乙酯∶醋酸＝7∶1∶0.1洗脱，得到黄色晶体(I-c)220毫克。收率35.6％。

化合物I-c名称：2-{2，3-二氢-3-[4-(2-甲基-2-烯丁基氧基)-3-甲氧基苯基]-2-羟甲基-1，4-苯并二氧六环-6-}-7-(2-甲基-2-烯丁基氧基)-3，5，-二羟基-4H-1-苯并吡喃-4-酮：R_f(氯仿∶醋酸乙酯∶醋酸＝7∶1∶0.5)0.49；核磁共振氢谱¹H NMR(400MHz，氘代氯仿)δ：1.75(宽单峰，6H，2×CH₃)，1.79(宽单峰，3H，CH₃)，1.81(宽单峰，3H，CH₃)，3.60(多重峰，1H，H-23a)，3.75(多重峰，1H，H-23b)，3.85(单峰，3H，OCH₃)，4.15(多重峰，1H，H-10)，4.55～4.63(多重峰，4H，H-1′& H-1″)，5.02(双峰，J＝8.0Hz，1H，H-11)，5.44～5.53(多重峰，2H，H-2′&H-2″)，6.35(双峰，J＝1.6Hz，1H，H-6)，6.42(宽单峰，1H，H-8)，6.92～7.01(多重峰，3H，芳香环Ar-H-16，H-18 & H-22)，7.08(双峰，J＝8.8Hz，1H，H-21)，7.75(宽单峰，1H，H-13)，7.79(双峰，J＝8.0Hz，1H，H-15)，12.69(单峰，1H，5-OH)；电喷雾质谱ESI-MS：617(M+H)⁺。

本发明中的式(I)化合物具有多种重要的生物活性，本发明通过药效学试验，发现式(I)化合物具有确切的体外抑制自由基诱导之脂质过氧化物生成的活性、保护脑神经细胞抗氧化损伤活性，以及螯合金属离子的作用。表明式(I)化合物可以预期用于制备防治神经退行性疾病类药物的用途，所述的神经退行性疾病是指老年性痴呆症(AD)、帕金森氏症(PD)、亨廷顿舞蹈病、肌萎缩性(脊椎)侧索硬化等病种；还可以防治肝脑脂质过氧化物生成引起的急/慢性肝损伤类疾病、肝炎、脑动脉粥样硬化症药物。

本发明的式(I)化合物或其可药用盐可以与药学上常用的辅料或载体结合，制备得到具有抵御脂质过氧化物引起之损害、保护脑神经细胞抗氧化损伤、以及螯合金属离子作用的抗氧化药物或药物组合物，可用于防治老年性痴呆症(AD)、帕金森氏症(PD)、亨廷顿舞蹈病、肌萎缩性(脊椎)侧索硬化等神经退行性疾病，还可用于治疗急/慢性肝损伤类疾病、肝炎、脑动脉粥样硬化症等疾病。上述各类药物或药物组合物可以采用注射剂、片剂、胶囊剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、外用搽剂等剂型。

本发明中所述剂型都可以根据现已公认的药剂学常识经由常规制备而得，在这些公知知识和技术基础上制备出的含有本发明权利要求化合物的药物或药物组合物之其他剂型都在本发明的保护范围内。

为了更好地理解本发明的实质，下面分别用药理相关实施例的形式列举式(I)化合物对双氧水H₂O₂所致PC12细胞损伤的保护作用试验之结果、抑制自由基诱导之脂质过氧化物生成的活性试验、以及螯合金属亚铁离子作用之结果，说明其在制药领域中的用途以及用于制备相关抗氧化剂类药物、防治神经退行性疾病类药物的根据。药理相关实施例给出了化合物的部分活性数据。同样必须说明，本发明列举的这些实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。

实施例4：式(I)化合物I-a对双氧水H₂O₂所致PC12细胞损伤的保护作用活性试验

4.1实验材料与样品

4.1.1细胞：大鼠肾上腺嗜铬瘤PC12细胞购自中科院上海细胞所。

4.1.2实验试剂：

4.1.2.1双氧水(hydrogen peroxide，H₂O₂)、硝基四氮唑兰(nitrobluetetrazolium，NBT)、菲咯嗪(ferrozine)购自Sigma公司；

4.1.2.2槲皮素(quercetin)由浙江大学药学院中药与天然药物研究室实验室提供(纯度为99％)；水飞蓟宾(Silybin)购自辽宁盘锦天缘药业有限公司，HPLC检测纯度98％；

4.1.2.3Tris碱，DMEM培养基购自Gibco公司；

4.1.2.43-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide(MTT)购自Amresco公司；

4.1.2.5小牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；

4.1.2.6青霉素和链霉素由石家庄制药集团有限公司生产；

4.1.2.7其它试剂均为国产分析纯，购自杭州华东医药试剂有限公司。

4.1.3实验仪器：

4.1.3.1酶标仪：Synergy-HT型，BIO-TEK公司；

4.1.3.2立式自动电热压力蒸汽灭菌器：LDZX-40BI型，上海申安医疗器材厂；

4.1.3.3紫外分光光度计：UV-1201型，北京瑞利分析仪器公司；

4.1.3.4超纯水系统：UPWS-I-60D型，杭州永洁达净化科技有限公司；

4.1.3.5除菌过滤器：Sterifi1500型，Millipore公司；

4.1.3.6气浴恒温振荡器：THZ-C，江苏省金坛市医疗仪器厂；

4.1.3.7二氧化碳CO₂细胞培养箱：MMM，德国公司；

4.1.3.8倒置显微镜：XD-2型，重庆光电仪器有限公司。

4.2实验原理：

双氧水H₂O₂是一种主要的活性自由基的前体，它可引起中枢神经系统细胞的凋亡，PC12细胞(大鼠肾上嗜铬细胞瘤)可模拟脑神经细胞，因此常用它来作为研究药物与神经细胞之间关系的模型，用MTT测细胞的存活率，如果待测化合物有清除由H₂O₂引起的自由基、保护细胞抗氧化损伤的作用，则其细胞存活率就高，相应之OD值也高，反之细胞存活率和OD值均低。本发明之药理学试验采用对唐希灿所报道之方法(Xiaoqiu Xiao等，Neurosci Letter，1999，275：73-76)加以改进来测定化合物对PC12细胞的保护作用。

4.3细胞培养：

PC12细胞用含10％小牛血清，100U/毫升青霉素和100U/毫升链霉素的DMEM培养基培养，于37℃、5％CO₂细胞培养箱中孵育，常规方法传代培养。

4.4实验方法：

4.4.1细胞毒性的测定：首先用改良的MTT法测定了待测化合物对PC12细胞增殖的作用。PC12细胞用胰酶-EDTA消化液消化，收集细胞，计数，用含10％小牛血清的DMEM培养基稀释至8000个/毫升的密度，然后接种于96孔细胞板中，细胞培养箱中继续培养，24小时后，分别将新配的待测的二甲亚砜溶液以浓度梯度加入到各孔中，使孔中化合物I-a的最终浓度分别为32、16、8微克/毫升。72小时后，加入10微升MTT(5毫克/毫升)的生理盐水溶液，继续在37℃，5％CO₂潮湿空气的培养箱中培养3小时，弃去原液，每孔中加入150微升二甲亚砜，振荡溶解生成的MTT晶体甲臜，用酶标仪在570nm波长下比色，细胞生长抑制率计算公式如下：

％细胞生长抑制率＝(OD_溶剂对照-OD_样品)/OD_溶剂对照×100％。

4.4.2化合物I-a对H₂O₂所致PC12细胞损伤的保护作用的测定：PC12细胞用DMEM培养基培养，培养基中含10％牛血清，100U/毫升青霉素和100U/毫升链霉素。细胞以每孔8000个的密度加到96孔板中，在37℃，50％CO₂潮湿空气的培养箱中培养36小时。用倒置显微镜观察细胞的形态变化以及用MTT法测定细胞的存活率。细胞经36小时的孵育后，分别将新配的化合物I-a的二甲亚砜溶液以浓度梯度加入到各孔中。作用2小时后加入新配的H₂O₂(终浓度为600微摩尔/升)作用3小时，显微镜观察记录，弃去原培养液，加入新的培养液100微升，然后加入MTT 10微升，3小时后，小心吸去培养液，加入150微升DMSO溶解甲臜，于570nm处读数。采用槲皮素和水飞蓟宾为阳性对照药物。

4.4.3试验结果：见表一。

表一化合物I-a及对照品组对双氧水损伤PCI2细胞保护作用

4.5结论：

试验结果表明，化合物I-a具有较强的对抗自由基引起的PC12细胞损伤作用，即对模拟脑神经细胞的PC12细胞有抗氧化损伤保护作用，其保护半数PC12细胞浓度IC₅₀＝20.54微摩尔/升，证实了其对保护PC12细胞免受自由基损伤之能力大大强于水飞蓟宾，且强于于槲皮素(槲皮素保护半数PC12细胞浓度IC₅₀＝58.4微摩尔/升)。说明该类7，20位烷基取代脱氢水飞蓟宾双醚或其可药用盐属于具有强效保护模拟脑神经细胞的PC12细胞作用的抗氧化物质。

测定化合物对H₂O₂所致PC12细胞损伤的保护作用可作为初步探讨其保护中枢脑神经细胞的作用机理之依据。故据该化合物表现出之对双氧水损伤所致PC12细胞的保护作用，可预期其对神经退行性疾病类药物中的治疗有积极作用。

实施例5：式(I)化合物I-b对双氧水H₂O₂所致PC12细胞损伤的保护作用活性试验

5.1实验材料与样品：同实施例4。

5.2实验仪器：同实施例4。

5.3实验原理：同实施例4。

5.4细胞培养：PC12细胞培养同实施例4。。

5.5实验方法：

5.5.1细胞毒性的测定：首先用改良的MTT法测定了待测化合物对PC12细胞增殖的作用。PC12细胞用胰酶-EDTA消化液消化，收集细胞，计数，用含10％小牛血清的DMEM培养基稀释至8000个/毫升的密度，然后接种于96孔细胞板中，细胞培养箱中继续培养，24小时后，分别将新配的待测的二甲亚砜溶液以浓度梯度加入到各孔中，使孔中化合物I-b的最终浓度分别为32、16、8微克/毫升。72小时后，加入10微升MTT(5毫克/毫升)的生理盐水溶液，继续在37℃，5％CO₂潮湿空气的培养箱中培养3小时，弃去原液，每孔中加入150微升二甲亚砜，振荡溶解生成的MTT晶体甲臜，用酶标仪在570nm波长下比色，细胞生长抑制率计算公式如下：

％细胞生长抑制率＝(OD_溶剂对照-OD_样品)/OD_溶剂对照×100％。

5.5.2化合物I-b对H₂O₂所致PC12细胞损伤的保护作用的测定：PC12细胞用DMEM培养基培养，培养基中含10％牛血清，100U/毫升青霉素和100U/毫升链霉素。细胞以每孔8000个的密度加到96孔板中，在37℃，50％CO₂潮湿空气的培养箱中培养36小时。用倒置显微镜观察细胞的形态变化以及用MTT法测定细胞的存活率。细胞经36小时的孵育后，分别将新配的化合物I-b的二甲亚砜溶液以浓度梯度加入到各孔中。作用2小时后加入新配的H₂O₂(终浓度为600微摩尔/升)作用3小时，显微镜观察记录，弃去原培养液，加入新的培养液100微升，然后加入MTT 10微升，3小时后，小心吸去培养液，加入150微升DMSO溶解甲臜，于570nm处读数。采用槲皮素和水飞蓟宾为阳性对照药物。

5.5.3试验结果：见表二。

表二化合物I-b及对照品组对双氧水损伤PC12细胞保护作用

5.6结论：

试验结果表明，化合物I-b具有较强的对抗自由基引起的PC12细胞损伤作用，即对模拟脑神经细胞的PC12细胞有抗氧化损伤保护作用。其保护半数PC12细胞浓度IC₅₀＝22.2微摩尔/升，说明其对保护PC12细胞免受自由基损伤之能力大大强于水飞蓟宾，且强于于槲皮素(槲皮素保护半数PC12细胞浓度IC₅₀＝58.4微摩尔/升)。说明该类7，20位烷基取代脱氢水飞蓟宾双醚或其可药用盐属于具有强效保护模拟脑神经细胞的PC12细胞作用的抗氧化物质。

测定化合物对H₂O₂所致PC12细胞损伤的保护作用可作为初步探讨其保护中枢脑神经细胞的作用机理之依据。故据该化合物表现出之对双氧水损伤所致PC12细胞的保护作用，可预期其对神经退行性疾病类药物中的治疗有积极作用。

实施例6：式(I)化合物I-b抑制自由基诱导之脂过氧化物生成活性的试验

6.1实验原理：

脂质过氧化是自由基作用于多不饱和脂肪酸的产物，含量与自由基的生成正相关，由于机体有抗氧化的酶系及非酶系的保护作用，使自由基不断产生又不断被清除。随着年龄的增长，体内的抗氧化剂不断下降，清除自由基的能力逐渐减弱，脂质过氧化作用则增强，脂质过氧化产物增多。因此，测定样品抗脂质过氧化作用，是筛选抗氧化、抗衰老药物的重要指标之一。本研究用维生素C-Fe²⁺系统诱导大鼠肝匀浆产生脂质过氧化产物丙二醛(MDA)，MDA能与硫代巴比妥酸(TBA)反应，产物在532nm处有最大吸收，通过MDA量的变化间接反映化合物对肝匀浆脂质过氧化的抑制作用[陶巧凤，郑汉其，赵昱等，Journal of Natural Products，2008，71，12-17]。

6.2实验材料与样品

6.2.1试验动物：SD(sprague-dawley)大鼠购自浙江大学实验动物中心。合格证号：SCXK(浙2007-0029)。

6.2.2实验试剂：

6.2.2.1硫酸亚铁FeSO₄溶液：国产FeSO₄分析醇试剂，购自杭州华东试剂公司，使用前按照要求自配；

6.2.2.2维生素C即Vc溶液：国产Vc分析醇试剂，购自杭州华东试剂公司，使用前按照要求自配；

6.2.2.3三氯醋酸(20％)溶液：国产CCl₃CO₂H分析醇试剂，购自杭州华东医药试剂有限公司，使用前按照要求自配；

6.2.2.4磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫代巴比妥酸及其它试剂均为国产分析纯(杭州华东医药试剂有限公司)。

6.2.2.5水飞蓟宾(Silybin)购自辽宁盘锦天缘药业有限公司，HPLC检测纯度98％；

6.3实验仪器：

6.3.1酶标仪：Synergy-HT型，BIO-TEK公司；

6.3.2立式自动电热压力蒸汽灭菌器：LDZX-40BI型，上海申安医疗器材厂；

6.3.3紫外分光光度计：UV-1201型，北京瑞利分析仪器公司；

6.3.4超纯水系统：UPWS-I-60D型，杭州永洁达净化科技有限公司；

6.3.5恒温水浴箱：上海森信试验科学仪器公司；

6.3.6气浴恒温振荡器：THZ-C，江苏省金坛市医疗仪器厂；

6.3.7台式高速冷冻离心机：TGL-16G，上海安亭仪器厂。

6.4实验方法：

6.4.1肝匀浆的制备：取SD实验大鼠5只断头处死，迅速取出肝脏，用超速离心法制备肝匀浆。

6.4.2样品对鼠肝脂质过氧化的抑制作用：在含FeSO₄(4微摩尔/升)与Vc(50微摩尔/升)的1毫升缓冲液中加入200微克/毫升肝匀浆，以诱导产生脂质过氧化，同时加入不同浓度的待测化合物I-b样品，37℃孵育30分钟后加入1毫升三氯醋酸(20％)中止反应加入1.5毫升硫代巴比妥酸(0.76％)，100℃沸水浴处理20分钟，离心去除蛋白沉淀，在532nm波长下测定上清吸光度。脂质过氧化以反应中生成的丙二醛表示，实验以水飞蓟宾作为阳性对照药物。用缓冲液代替反应液作为空白对照组，加入同样体积DMSO的为溶剂对照组。样品对大鼠肝匀浆脂质过氧化抑制率的计算公式计算公式如下：

抑制率(％)＝(OD_样品管-OD_空白管)/(OD_标准管-OD_空白管)×100％。

6.5试验结果：

试验结果见表三。

表三.化合物I-b对大鼠肝微粒体脂质过氧化的抑制作用(半数抑制浓度IC₅₀)

6.6结论：

试验结果表明，化合物I-b属于具有强效的保护细胞抗氧化物质，其具有显著的抑制自由基诱导之脂过氧化物生成能力，其半数抑制浓度IC₅₀为13.67微克/毫升，大大高于水飞蓟宾，说明该类7，20位双烷基取代的脱氢水飞蓟宾双醚衍生物或其可药用盐具有保护细胞膜免受脂质过氧化的作用，可以预期用于制备预防或治疗脑组织氧化损伤或者急/慢性肝损伤类疾病的作用，值得进一步优化结构，或与其他相关药物联合使用。

实施例7：式(I)化合物I-c抑制自由基诱导之脂过氧化物生成活性的试验

7.1实验原理：同实施例6。

7.2实验材料与样品：同实施例6。

7.3实验仪器：同实施例6。

7.4实验方法：

7.4.1肝匀浆的制备：同实施例6。

7.4.2样品对鼠肝脂质过氧化的抑制作用：在含FeSO₄(4微摩尔/升)与Vc(50微摩尔/升)的1毫升缓冲液中加入200微克/毫升肝微粒体，以诱导产生脂质过氧化，同时加入不同浓度的化合物I-c样品，37℃孵育30分钟后加入1毫升三氯醋酸(20％)中止反应加入1.5毫升硫代巴比妥酸(0.76％)，100℃沸水浴处理20分钟，离心去除蛋白沉淀，在532nm波长下测定上清吸光度。脂质过氧化以反应中生成的丙二醛表示，实验以水飞蓟宾作为阳性对照药物。用缓冲液代替反应液作为空白对照组，加入同样体积DMSO的为溶剂对照组。样品对大鼠肝匀浆脂质过氧化抑制率的计算公式计算公式如下：

抑制率(％)＝(OD_样品管-OD_空白管)/(OD_标准管-OD_空白管)×100％。

7.5试验结果：试验结果见表四。

表四.化合物I-c对大鼠肝微粒体脂质过氧化的抑制作用

试验结果表明，化合物I-c具有确切的抑制自由基诱导之脂过氧化物生成能力，其半数抑制浓度IC₅₀为27.91微克/毫升。

7.6结论：化合物I-c属于也具有强效的保护细胞抗氧化物质，其抗脂质过氧化能力强于水飞蓟宾。提示该类7，20位烷基取代脱氢水飞蓟宾双醚或其可药用盐具有一定的保肝护肝功效以及可以预期用于制备预防或治疗脑组织氧化损伤或者急/慢性肝损伤类疾病的作用，值得进一步优化结构，或与其他相关药物联合使用。

实施例8：式(I)化合物I-b对亚铁离子的螯合试验

8.1实验目的：评价化合物螯合亚铁离子的能力。

8.2实验原理：在多种金属离子中，亚铁离子(Fe²⁺)是强促氧化剂，能促进脂质过氧化。Fe²⁺与菲咯嗪(Ferrozine)的复合物在562nm处有最大吸收，根据样品螯合前后吸光度的变化可对测试化合物的金属离子螯合能力做一评价。

8.3实验仪器及试剂：

8.3.1.酶标仪：Synergy-HT型，BIO-TEK公司；

8.3.2.96孔酶标板：杭州四季青生物制品公司；

8.3.3菲咯嗪(Ferrozine)购自Sigma；FeSO₄·7H₂O国产分析纯试剂。

8.4.实验步骤

8.4.1试剂配制：

8.4.1.1亚铁离子液配制：称取FeSO₄·7H₂O 55.6毫克溶于100毫升双蒸水中，配成2.0毫摩尔(mM)液。

8.4.1.2菲咯嗪(Ferrozine)溶液配制：称取246.3毫克Ferrozine溶于100毫升双蒸水中，配成5.0mM液。

8.4.1.3DMSO-水溶液配制：取一定量的DMSO与双蒸水配制成70～80％(v/v)的水溶液，作为溶剂。

8.4.2化合物对Fe²⁺螯合测定：

采用比色法。样品孔中加入DMSO-水溶液(190微升)，化合物稀释后每孔5微升，使其终浓度为100微克/毫升，50微克/毫升，25微克/毫升，加入2.0mM Fe²⁺液(5微升)，再加入5.0mM的Ferrozine溶液10微升。混匀后，静置10分钟，在562nm处比色。空白孔不加Ferrozine溶液，溶剂对照孔加入DMSO。化合物抑制率由样品OD值对于空白和对照OD值计算。

亚铁离子螯合％＝[(OD_溶剂对照-OD_空白)-(OD_样品-OD_样品空白)/(OD_溶剂对照-OD_空白)]×100％。

8.5.实验结果

化合物I-b对亚铁离子半数螯合浓度IC₅₀＝144.6μM；

槲皮素：IC₅₀＝188.2μM；

水飞蓟宾：＞300μM。

8.6.结论

化合物I-b属于强效的亚铁离子螯合剂，其螯合亚铁离子能力大大强于水飞蓟宾，甚至强于阳性对照药物槲皮素。提示该类7，20位烷基取代脱氢水飞蓟宾双醚或其可药用盐具有或可清除老年性痴呆病人脑中存在大量的铁离子功效以及可以预期用于制备预防或治疗脑组织氧化损伤和老年性痴呆症药物的作用，值得进一步优化结构，或与其他相关药物联合使用。

实施例9：式(I)化合物I-c对亚铁离子的螯合试验

9.1实验目的：同实施例8。

9.2实验原理：同实施例8。

9.3实验仪器及试剂：同实施例8。

9.4.实验步骤

9.4.1试剂配制：同实施例8。

9.4.2化合物对Fe²⁺螯合测定：

采用比色法。样品孔中加入DMSO-水溶液(190微升)，化合物稀释后每孔5微升，使其终浓度为100微克/毫升，50微克/毫升，25微克/毫升，加入2.0mM Fe²⁺液(5微升)，再加入5.0mM的Ferrozine溶液10微升。混匀后，静置10分钟，在562nm处比色。空白孔不加Ferrozine溶液，溶剂对照孔加入DMSO。化合物抑制率由样品I-c之OD值对于空白和对照OD值计算。

亚铁离子螯合％＝[(OD_溶剂对照-OD_空白)-(OD_样品-OD_样品空白)/(OD_溶剂对照-OD_空白)]×100％。

9.5.实验结果

化合物I-c对亚铁离子半数螯合浓度IC₅₀＝137.5μM；

槲皮素：IC₅₀＝188.2μM；

水飞蓟宾：＞300μM。

9.6.结论

化合物I-c属于强效的亚铁离子螯合剂，其螯合亚铁离子能力大大强于水飞蓟宾，甚至强于阳性对照药物槲皮素。提示该类7，20位烷基取代脱氢水飞蓟宾双醚或其可药用盐具有或可清除老年性痴呆病人脑中存在大量的铁离子功效以及可以预期用于制备预防或治疗脑组织氧化损伤和老年性痴呆症药物的作用，值得进一步优化结构，或与其他相关药物联合使用。

在上述说明书阐述本发明时，同时提供了实施例和药理相关实施例的目的是举例说明本发明的实际操作过程和本发明的意义。在进入本发明权利要求和其等同物范围内时，本发明的实际应用包括所有一般变化、配合，或改进。