石莼目绿藻无性繁殖系育苗方法

摘要

本发明公开了石莼目绿藻无性繁殖系育苗方法，是将野生藻体离体分割到阈值以下(通常小于1～5mm)的片段，进行组织培养，待片段细胞再生出有假根的幼体，将假根及幼体从固着基上剥离下来，粉碎后充气培养，诱导假根及幼体组织进行孤雌生殖，释放游动细胞或不动细胞，并萌发形成新的植株，达到无性繁殖系的扩增，用于苗种生产。本发明具有育苗生产周期短、不受季节限制、遗传性状稳定、生产成本低的突出优点。

说明书

技术领域

本发明涉及一种通过海藻组织培养大量生产石莼目绿藻无性繁殖系幼苗的方法。

背景技术

石莼目藻类包括袋礁膜、浒苔、孔石莼等经济种类，藻体内含有丰富的丰富的蛋白质及各种氨基酸，维生素，膳食纤维、微量元素等，具有降血压、抗肿瘤、治疗便秘等功效，深受日本及东南亚一些国家欢迎。石莼目藻体结构简单，一层或两层细胞，外形为叶状体或管状体，该目藻类适应性强，广温广盐，尤其适宜在河口等富营养化海区生长。因此，开展石莼目海藻的栽培，不仅可以带来可观的经济效益，而且具有良好的生态效益。

我国目前还没有经济绿藻进入规模化养殖阶段，日本已经开展了礁膜和浒苔的人工育苗和规模化养殖，其苗种生产是利用绿藻的有性生殖特性进行的，然而其存在生产周期长，供苗无保证的不足。

目前，关于绿藻酶解育苗的研究取得了一些进展，申请号为200510050824.0的中国专利申请公开了一种经济绿藻育苗方法，但酶解育苗过程中使用昂贵的酶液，在大规模苗种生产中应用，成本过高；而且酶解的材料为野生或养殖的混杂藻体，遗传性状不稳定，不利于良种化养殖。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的是建立一种无性繁殖系苗种生产方法，可用于石莼目绿藻的规模化生产，解决育苗生产周期长、受季节限制、遗传性状不稳定、生产成本过高等问题。

本发明的技术方案是：将野生藻体离体分割到阈值以下(小于1～5mm)的片段，进行组织培养，待片段细胞再生出有假根的幼体，将假根及幼体从固着基上剥离下来，粉碎后充气培养，诱导假根及幼体组织进行孤雌生殖，释放不动细胞并萌发形成新的植株，达到无性繁殖系的扩增。

本发明包括以下步骤：

1)采集性状较好的未成熟的野生石莼目绿藻藻体，清除附生动物和杂藻后，选择藻体的中部偏上区域，切下后，切割成1~5mm以下的片断；

2)将切割完毕的片段放在PES培养基中培养，培养条件为光强：55-95μmolm^-2s^-1，温度20-25℃；培养时间一周左右；此时，片段上的营养细胞经过了脱分化形成游离细胞或再分化形成游动细胞(两根鞭毛)的过程，再生形成新的幼苗，幼苗先形成初生假根，再进一步形成盘状的次生假根；

3)将假根从附着基上剥离下来，充气培养，假根上的细胞能脱落下来，每个脱落的细胞能再生成新的能附着的幼苗，培养到一定阶段，将这些幼体或假根用粉碎机粉碎，再充气培养，通过这种方式可以建立并大量扩增无性繁殖系；将这些无性繁殖系喷洒到苗网上，充气培养，48h后，幼苗附着牢固，就可以实现人工育苗，用于规模化养殖。

所述的1)中的切割过程是通过用手术刀片切割或组织捣碎机(转速：0-12000转/分)对离体组织进行切割的。

所述的1)中所述的切割成1~5mm以下的片断是指：由于片段的阈值大小与种类和野生藻体的生长阶段有关，幼体在1mm以下，未成熟的成体在5mm以下，片段内的细胞才能出现再生。故而切割片断的大小一般为幼体在1mm以下，未成熟的成体在5mm以下。

所述的野生藻体为未成熟的藻体，即藻体上无有性生殖器官，最好选择形态特征典型的幼体。

有益效果本发明具有育苗生产周期短、不受季节限制、遗传性状稳定、生产成本低的突出优点。

具体实施方式

下面结合实例对发明进一步进行说明。

实施例1：以缘管浒苔为材料，对本发明作进一步详细的叙述。

1.从海区采集野生的缘管浒苔藻体，用保温箱低温运回实验室，选择健康完整的个体，显微镜检查无繁殖器官形成，用软毛笔洗刷藻体表面，清除附着的杂藻或动物。用消毒海水冲洗干净。

2.在藻体中上部选择一定区域，将其切下，用手术刀片切或组织捣碎机粉碎，至1-2mm(直径)，将切好的片段置于培养皿或三角烧瓶中静置培养，培养液为PES培养基，培养条件为光强55-95μmol m^-2s^-1，温度20-25℃。每隔3天换一次培养液，大约一周左右，片段上的细胞经过脱分化或再分化过程形成不动细胞或游动细胞，这些细胞不经两性结合，能进一步发育形成带有假根的幼体，培养到一定阶段，将这些幼体或假根用组织捣碎机粉碎，连同培养液放到三角烧瓶或气升式藻类反应器中进行充气培养，就可以大量扩增缘管浒苔的无性系。将这些无性系喷洒到紫菜苗网上，充气培养，48h后，幼苗附着牢固，就可以下海暂养。待幼苗长到2-3cm，就可以分网养殖。

实施例2：以孔石莼为材料，对本发明作进一步详细的叙述。

1.从自然海区采集生长旺盛，颜色碧绿的孔石莼藻体，用保温箱低温运回实验室后，在藻体中上部选择一定大小(如2×2cm2)区域，将其切下，镜检无繁殖器官，用软毛笔洗刷藻体表面，清除杂藻，用消毒海水反复冲洗干净。

2.将清洗干净的藻体片段，用刀片切至5mm以下片段，培养皿或三角烧瓶中静置培养，培养液为PES培养基，培养条件为光强55-95μmol m^-2s^-1，温度20-22℃。每隔3天换一次培养液，大约6d后，大部分营养细胞转化为游动细胞释放出来，少量转化为不动细胞，其中的游动细胞不经两性细胞结合直接发育成带有假根的幼体，不动细胞或者发育成正常幼体或者继续分裂成囊状体，培养到一定阶段后，将这些带假根的幼体从附着基质上剥离下来，用组织捣碎机粉碎，在三角烧瓶或气升式反应器中充气培养，可以大量扩增孔石莼的无性繁殖系。将这些无性系喷洒到紫菜苗网上，充气培养，48h后，幼苗附着牢固，就可以下海暂养。待幼苗长到2-3cm，就可以分网养殖。

实施例3：以袋礁膜为材料，对本发明作进一步详细的叙述。

1.从自然海区采集生长旺盛期的袋礁膜藻体，用保温箱低温运回实验室后，在藻体中上部选择一定大小(如1×1cm²)区域，将其切下，镜检无繁殖器官，用软毛笔洗刷藻体表面，清除杂藻，用消毒海水反复冲洗干净。

2.将清洗干净的藻体片段，用组织捣碎机粉碎至1mm以下，在培养皿或三角烧瓶中静置培养，培养液为PES培养基，培养条件为光强55-95μmol m^-2s^-1，温度21-23℃。每隔3天换一次培养液，大约一周左右，除少部分转化为不动细胞，形成囊状体外，大部分营养细胞转化为孢子囊，孢子囊释放出游孢子，后者进一步发育成带有盘状假根的幼体，培养一段时间后，将幼体及假根从附着基质上剥离下来，在三角烧瓶或气升式反应器中充气培养，可以大量扩增袋礁膜的无性繁殖系。将这些无性系喷洒到紫菜苗网上，充气培养，48h后，幼苗附着牢固，就可以下海暂养。待幼苗长到2-3cm，就可以分网养殖。