同时测定蜂王浆中多种硝基咪唑类药物残留量的检测方法

摘要

本发明涉及蜂王浆中硝基咪唑类药物残留量的方法，尤其涉及采用液相色谱－质谱/质谱法测定蜂王浆中羟基甲硝唑、2－甲硝咪唑、羟基二甲硝咪唑、甲硝唑、二甲硝咪唑、洛硝哒唑、氯甲硝咪唑、苯硝咪唑、羟基异丙硝唑和异丙硝唑等硝基咪唑类药物残留量的方法。同时测定蜂王浆中多种硝基咪唑类药物残留量的检测方法，本发明采用甲醇沉淀蛋白，提取，再采用HLB固相萃取小柱和C18固相萃取小柱净化，采用色谱－质谱/质谱仪测定。本发明具有专属性强、灵敏度高、结果准确的特点，不仅测定硝基咪唑原药还包括一些代谢产物，方法的测定低限10μg/kg，测定低限满足目前国内外对蜂王浆中硝基咪唑类药物残留量的要求。回收率范围为70.7％～105.0％；相对标准偏差小于12.7％。

说明书

技术领域

本发明涉及蜂王浆中硝基咪唑类药物残留量的方法，尤其涉及采用液相色谱-质谱/质谱法测定蜂王浆中羟基甲硝唑、2-甲硝咪唑、羟基二甲硝咪唑、甲硝唑、二甲硝咪唑、洛硝哒唑、氯甲硝咪唑、苯硝咪唑、羟基异丙硝唑和异丙硝唑等硝基咪唑类药物残留量的方法。

背景技术

硝基咪唑类药物(Nitroimidazoles)是一类抗菌素和抗原虫药，该类药物主要用于治疗和预防禽组织鞭毛滴虫病(火鸡黑头病)、牛胎毛滴虫病及猪密螺旋体性痢疾和鱼中寄生虫的有效药。其共同特点是咪唑环上带N-1甲基和5-硝基取代基，只有C-2位上的取代基不同。硝基咪唑类药物代谢迅速，主要代谢产物是由咪唑环C2上的甲基被氧化成羟甲基，成为侧链羟甲基。

由于硝基咪唑类药物含有的硝基杂环类化合物具有细胞诱变性，从而导致有致癌作用和潜在的致畸作用，已引起了临床的高度重视，因此，硝基咪唑类药物在大多数国家中为禁止使用或允许使用但必须严格监控的药物。20世纪80年代末以来，美国FDA已开始禁止硝基咪唑类药物用于食用动物的治疗，欧盟理事会96/23/EC及2377/EC指令、中国农业部《农牧发[2002]1号文件<食品动物禁用的兽药及其它化合物清单>》也已将硝基咪唑类药物列入A类禁用药在活体动物和动物产品中不得检出该类物质。

目前文献报道硝基咪唑类药物及其代谢物的检测方法有筛选法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法、气相色谱-质谱法及液相色谱法串联质谱法，GB/T21318-2007《动物源性食品中硝基咪唑残留量检验方法》公开了动物源性食品中硝基咪唑类药物残留量检验方法。中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1928-2007《进出口动物源性食品中硝基咪哇残留量检测方法液相色谱一质谱/质谱法》公开了动物源性食品中硝基咪唑残留量检测方法。

文献【色谱2006，24(4)：331】只检测了蜂王浆中甲硝唑、二甲硝唑和洛硝哒唑，未测定其代谢产物，方法采用加0.25mol/L氢氧化钠溶液使蜂王浆蛋白质变性，再用乙酸乙酯提取样品中3种硝基咪唑药物残留，提取液浓缩后直接定容，液相色谱-质谱/质谱检测。

中国发明专利申请(申请号：200810195887.9)公开了蜂产品中多类农兽药残留同时检测的方法，样品加入提取液三氯乙酸或高氯酸和提取液醋酸盐、磷酸盐或硼酸盐溶液，控制PH值4.5-9.0；离心，滤液入固相萃取柱中萃取，洗脱并吹干萃取柱，用草酸-甲醇溶液洗柱，洗脱液用甲醇水溶液定容，入液相色谱-串联质谱分析测试，所得的色谱峰与各已知药物的标准色谱峰对照，根据保留时间和质谱离子的丰度确定所检出药物的具体名称。该方法只需对品样进行一次前处理，即可同时提取磺胺类、喹诺酮类、大环内酯类、林可胺类、硝基咪唑类、B-内酰胺类、四环素类、氯霉素类、磺胺增效剂类、杀虫脒，三唑醇等11大类60多种兽药的药物残留，分析效率高，检测成本大降低。

发明内容

为了解决现有蜂王浆中硝基咪唑类药物残留检测的难题，本发明的目的是提供一种利用液相色谱-质谱/质谱法专属性强、灵敏度高、准确的蜂王浆中硝基咪唑类药物残留的检测方法。

为了实现上述的目的，本发明的同时测定蜂王浆中多种硝基咪唑类药物残留量的检测方法，该方法包括以下的步骤：

①提取：称取试样置于具塞离心管中，加同位素内标溶液，加水，混匀，静置，再加甲醇沉淀蛋白，于旋涡混合器上混匀，离心，过滤，移取上清液，加磷酸盐缓冲溶液稀释，混匀，加氯化钠和有机溶剂提取，样品残渣再加入有机溶剂，重复上述操作，合并提取溶液，水浴浓缩至近干；

②净化：加水溶解残渣并将溶液转移至HLB固相萃取小柱中，弃去流出液，抽干，用甲醇洗脱，收集全部洗脱液于另一离心管中，洗脱液水浴下浓缩至近干；再用甲醇溶解将溶液转移至C₁₈固相萃取小柱中，洗脱，收集全部洗脱液于另一离心管中，洗脱液水浴下浓缩至近干，用甲醇-0.15％(V/V)甲酸溶液的混合液溶解残渣定容，混匀，溶液过滤膜，供液相色谱-质谱/质谱仪测定；

③色谱-质谱/质谱仪测定：标准工作液和样品溶液在液相色谱-质谱/质谱条件中分别进样，以质量浓度X为横坐标，峰面积的比值Y为纵坐标，绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量；样品溶液中出现的质量色谱峰保留时间与混合基质标准工作液一致，允许偏差小于±2.5％，该色谱峰所对应的药物质谱定性离子的相对丰度与浓度相当混合基质标准工作液的相对丰度一致，相对丰度偏差不超过规定，则可确定含有该药物。

作为优选，上述的步骤①中同位素内标溶液选用二甲硝咪唑-d3、洛硝哒唑-d3，羟基二甲硝咪唑-d3、羟基异丙硝唑-d3和异丙硝唑-d3。作为再优选，上述的步骤①中二甲硝咪唑-d3、洛硝哒唑-d3同位素内标溶液的浓度为200ng/mL，羟基二甲硝咪唑-d3、羟基异丙硝唑-d3、异丙硝唑-d3同位素内标溶液的浓度为100ng/mL。

作为优选，上述的步骤①中有机溶剂选用乙酸乙酯或乙腈或二氯甲烷。最优选，上述的步骤①中有机溶剂选用乙酸乙酯。

作为优选，上述的步骤①中磷酸盐缓冲溶液的pH值为5.0～9.0。最优选，pH值为8.0。

作为优选，上述的步骤②中甲醇-0.15％体积浓度的甲酸溶液混合液中甲醇和甲酸溶液的混合体积比为1∶9。

作为优选，上述的步骤③中高效液相色谱条件如下：

色谱柱：    ZORBAXEclipseXDBC₈柱，5μm，150mm×4.6mm(i.d)

流动相：    甲醇和0.15％甲酸溶液，梯度洗脱程序

流速：      400μL/min

进样量：    30μL

柱温：      室温

梯度：      0～8.0min13％甲醇；

            8.0～8.1min线性增加至40％甲醇；

            8.1～15.5min线性增加至80％甲醇；

            15.5～19min线性增加至100％甲醇；

            19～19.1min降至13％甲醇

            19.1～19.1min13％甲醇。

作为优选，上述的步骤③中质谱条件如下：

电离模式、极性：    ESI，正离子模式positiveion

电喷雾电压：        4800V

离子源温度：        540℃。

作为优选，上述的硝基咪唑类残留为羟基甲硝唑、2-甲硝咪唑、羟基二甲硝咪唑、甲硝唑、二甲硝咪唑、洛硝哒唑、氯甲硝咪唑、苯硝咪唑、羟基异丙硝唑和异丙硝唑中多种。作为再优选，上述的硝基咪唑类残留为羟基甲硝唑、2-甲硝咪唑、羟基二甲硝咪唑、甲硝唑、二甲硝咪唑、洛硝哒唑、氯甲硝咪唑、苯硝咪唑、羟基异丙硝唑和异丙硝唑10种。

本方法采用甲醇使蜂王浆蛋白质变性(蜂王浆为含有大量蛋白质的均匀胶体，要从蜂王浆中提取药物残留，必须破坏其胶体状态。文献报道酸沉淀、乙酸铅沉淀等方法，本方法采用有机溶剂甲醇沉淀蛋白的方法，解决有些药物在酸性条件下不稳定的问题，没有添加其他化学试剂，降低了其对结果杂质的干扰。)在磷酸盐缓冲盐条件(pH8)，再用乙酸乙酯提取，OasisHLB和C₁₈固相萃取小柱净化，通过测得的样品种的色谱峰与各药物已知的标准色谱峰进行对照，确定检出药物的具体名称。

本发明建立了一种专属性强、灵敏度高、结果准确同时检测10种硝基咪唑类药物的液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)法，不仅测定硝基咪唑原药还包括一些代谢产物，方法的测定低限10μg/kg，测定低限满足目前国内外对蜂王浆中硝基咪唑类药物残留量的要求。本方法尽管7种硝基咪唑类药物选用同位素内标稀释内标法定量，样品净化溶液经液相色谱-质谱/质谱多反应监测选择离子分析，但检测蜂王浆复杂基质时仍然存在基质效应，用样品空白提取液作为标准溶液的稀释溶液，可使标准和样品溶液具有同样的离子化条件，从而消除了样品基质效应。回收率范围为70.7％～105.0％；相对标准偏差小于12.7％。

附图说明

图1～图10分别为羟基甲硝唑、2-甲硝咪唑、羟基二甲硝咪唑、甲硝唑、二甲硝咪唑、洛硝哒唑、氯甲硝咪唑、苯硝咪唑、羟基异丙硝唑和异丙硝唑10种硝基咪唑类药物及其代谢物空白样品溶液加混合标准溶液的选择离子流图。

图11为不同溶液pH对提取效率的影响的框图。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式做一个详细的说明。

本发明的同时测定蜂王浆中多种硝基咪唑类药物残留的检测方法，该方法包括以下的步骤：

一、提取

称取2g试样(精确到0.01g)置于50mL具塞离心管中，加0.2mL二甲硝咪唑-d3、洛硝哒唑-d3同位素内标溶液(200ng/mL)，羟基二甲硝咪唑-d3、羟基异丙硝唑-d3、异丙硝唑-d3同位素内标溶液(100ng/mL)，加10mL水，混匀，静置2min，再加甲醇至20mL，于旋涡混合器上以2000r/min混匀1min，以6000r/min离心10min，过滤，移取10.0mL上清液，加10mL磷酸盐缓冲溶液(溶解13.8g磷酸二氢钠于950mL水中，用0.1mol/L氢氧化钠溶液调节溶液pH值到8.0，最后用水稀释至1L)稀释，混匀，加2g氯化钠和20mL乙酸乙酯提取，样品残渣再加入20mL乙酸乙酯，重复上述操作，合并乙酸乙酯提取溶液，在45℃以下水浴减压浓缩至近干。

二、净化

加15mL水分次溶解残渣并将溶液转移至HLB固相萃取小柱中(依次用5mL甲醇，5mL水预洗)，弃去流出液，抽干，用6mL甲醇洗脱，控制流速1mL/min～2mL/min，收集全部洗脱液于10mL离心管中，洗脱液在50℃以下水浴下减压浓缩至近干，10mL甲醇将溶液转移至C₁₈固相萃取小柱中(用5mL甲醇预洗)，控制流速1mL/min～2mL/min，收集全部洗脱液，洗脱液在50℃以下水浴下减压浓缩至近干，用1.0mL甲醇-0.15％甲酸溶液(1+9，V/V)溶解残渣，混匀，溶液过0.45μm，滤膜，供液相色谱-质谱/质谱仪测定。

三、测定

标准工作液和样品溶液在表1设定的液相色谱-质谱/质谱条件分别进样，以质量浓度X(μg/kg)为横坐标，峰面积的比值Y为纵坐标，绘制5点标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液种药物的响应值应在仪器检测的线性范围内。在上述色谱条件下，判断样品中是否存在相应的被测物，需要满足如下条件：样品溶液中出现的质量色谱峰保留时间与混合基质标准工作液一致，允许偏差小于±2.5％，该色谱峰所对应的药物在表2中的质谱定性离子的相对丰度与浓度相当混合基质标准工作液的相对丰度一致，相对丰度偏差不超过表3的规定，则可确定含有该药物。

表3为硝基咪唑类药物的母离子、子离子和碰撞能量等质谱参数。在表1和表2设定的高效液相色谱和质谱条件下，空白蜂王浆样品添加回收实验的回收率范围见表4。羟基甲硝唑、2-甲硝咪唑、羟基二甲硝咪唑、甲硝唑、二甲硝咪唑、洛硝哒唑、氯甲硝咪唑、苯硝咪唑、羟基异丙硝唑和异丙硝唑10种硝基咪唑类药物及其代谢物基质加标的选择离子流图见图1～图10。

表1高效液相色谱和质谱条件参数

 液相条件 色谱柱  ZORBAX Eclipse XDB C₈柱，5μm，150mm×4.6mm(i.d) 流动相  甲醇(A)和0.15％甲酸溶液(B)，梯度洗脱程序 流速  400μL/min 进样量  30μL 柱温  室温 梯度  0～8.0min 13％甲醇(A)；  8.0～8.1min线性增加至40％甲醇(A)；  8.1～15.5min线性增加至80％甲醇(A)；  15.5～19min线性增加至100％甲醇(A)；  19～19.1min降至13％甲醇(A)  19.1～19.1min13％甲醇(A) 质谱条件 电离模式、极性  ESI，正离子模式positive ion 电喷雾电压  4800V 离子源温度(TEM)  540℃

表2硝基咪唑类药物的质谱参数

表3定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差

  相对离子丰度  ＞50％＞20％～50％＞10％～20％  ≤10％  允许的相对偏差  ±20％±25％±30％  ±50％

表4空白蜂王浆样品添加回收的回收率范围

四、方法的线性关系和方法的测定低限

本发明硝基咪唑类药物混合标准工作曲线溶液是用空白样品基质溶液加混合标准溶液制备，浓度为5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、60ng/mL的混合标准工作溶液，相当于样品中含有5μg/kg、10μg/kg、20μg/kg、50μg/kg、60μg/kg硝基咪唑类药物。在本法所确定的实验条件下进样，测定其峰面积，以质量浓度X(μg/kg)为横坐标，峰面积的比值Y为纵坐标，绘制硝基咪唑类药物混合标准溶液工作曲线，见表5。

表5离子对、线性方程、相关系数

  化合物  离子对名称  线性方程  相关系数  羟基甲硝唑  188.1/123.0  Y＝0.0247X+-0.0119  0.9999  2-甲硝咪唑  128.0/82.0  Y＝1.62×10⁵X+2×10⁵  0.9997  羟基二甲硝咪  唑  158.0/140.1  Y＝0.0538X+-0.0279  1.0000  甲硝唑  172.0/128.2  Y＝0.0649X+-0.0184  1.0000  二甲硝咪唑  142.0/96.0  Y＝0.055X+-0.0446  0.9999  洛硝哒唑  201.01/140.2  Y＝0.0289X+0.000125  0.9998  氯甲硝咪唑  162.0/116.0  Y＝6.39×10⁴X+-315  0.9997  苯硝咪唑  164.0/118.0  Y＝2.98×10⁵X+1.94×10⁵  0.9992  羟基异丙硝唑  186.3/168.1  Y＝0.0354X+0.0587  0.9990  异丙硝唑  170.2/109.0  Y＝0.0402X+0.0771  1.0000

五、提取条件的选择

硝基咪唑类药物具有酸碱两性性质，在弱碱性条件，以分子状态游离，可以用有机溶剂二氯甲烷、乙腈、乙酸乙酯提取；由于二氯甲烷具有比较大的毒性，因此一般不采用。乙腈沸点高，在旋转蒸发浓缩过程中导致回收率偏低，本发明选用乙酸乙酯作为样品提取溶剂。

本发明采用在中性和pH8磷酸盐缓冲溶液碱性条件下，加乙酸乙酯提取10种硝基咪唑混合标准溶液对比试验，外标法定量，结果显示，中性条件下，硝基咪唑类药物回收率在27～68％之间，碱性条件下大多数硝基咪唑类药物的回收率高于中性条件下，结果见图11。

六、样品稀释溶剂的确定

样品稀释溶液的选择对待测物质的峰形、分离度和灵敏度有很大影响，一般采用流动相作为样品稀释溶液，梯度色谱洗脱程序时，选用起始时的流动相比例。本发明分别选用甲醇∶0.15％甲酸(1+9，V/V)；甲醇∶0.15％甲酸(3+7，V/V)；甲醇∶水(1+9，V/V)；甲醇∶水(3+7，V/V)作为样品稀释溶液进行试验，从色谱图可以看出，定容溶液中甲醇溶剂的比例高于起始时甲醇比例3倍时保留时间最短的羟基甲硝唑、2-甲硝咪唑、羟基二甲硝咪唑、甲硝唑出现申舌色谱峰且灵敏度低，当定容溶剂中选择使用0.15％甲酸且比例与起始流动相比例相同时，可能因为维持流动相的低pH值以抑制硅醇基的解离和增加硝基咪唑化合物的溶解，待测化合物可得到较高的灵敏度和对称尖锐的峰形，因此本发明选用甲醇∶0.15％甲酸(1+9，V/V)作为样品稀释溶剂。