基于环介导等温扩增技术的单核增生李斯特菌基因快速诊断试剂盒及其检测方法

摘要

本发明提供一种基于环介导等温扩增技术的单核增生李斯特菌基因快速诊断试剂盒及其检测方法，该试剂盒由两对引物、DNA聚合酶、反应液、样品预处理液、显色液和阳性对照液组成，以上六种液体分别置于容器中。本发明的基因快速诊断试剂盒应用六个区段，四条引物，根据是否扩增就能判断靶标物质的存在与否，因此具有高特异性。本发明的基因快速诊断试剂盒快速、高效、灵敏度高，只需一个恒定温度就能扩增反应，不需要特殊试剂与设备。本发明的基因快速诊断试剂盒鉴定简便，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测试剂，具体涉及一种基于环介导等温扩增技术的单核增生李斯特菌基因快速诊断试剂盒及其检测方法。

背景技术

目前对单核增生李斯特菌有多种检测方法，从以病原微生物分离鉴定、形态学鉴定和自动生化鉴定为主的国家标准(GB/T4789.7-2003)，到特异蛋白的免疫学检测技术、核酸探针、聚合酶链式反应(PCR)技术等分子生物学检测方法[食品安全检测与现代生物技术，化学工业出版社，2004年]。其中病原核酸检测在快速性、安全性、准确性和灵敏性等方面都有很大的提高，这些新技术试图突破传统的形态学、生化反应等微生物学检测旧模式，不需要对微生物进行分离提纯，而直接用样品或样品的增菌液对其基因及基因产物进行快速检测，并且与分子生物学技术及生物信息学手段相结合，向准确、快速、灵敏和自动化的方向发展。

以聚合酶链式反应(PCR)技术为代表的病原核酸检测技术在实际应用中也存在一些问题，如普通聚合酶链式反应(PCR)技术需要专门的仪器，而且存在容易交叉污染和操作过程烦琐的缺点。而荧光实时定量聚合酶链式反应(real time PCR)技术虽然较好地解决了交叉污染的问题，并简化了操作过程，但却需要更复杂的定量测定仪器，因此不适用于现场快速检测。而且实时定量聚合酶链式反应PCR技术中荧光探针的成本较高，加大了推广应用的难度。免疫学检测技术快速简便成本低廉，但要求高质量高稳定性的单克隆抗体，否则因准确性不够，目前只能是辅助检测手段。所以及时运用生物技术发展的最新成果对满足病原微生物检测要求的不断提高具有重要意义。其中等温扩增(Isothermal Amplification)核酸快速检测技术是病原核酸检测技术上的长足进步，现已建立起来的环介导等温扩增技术(LAMP)具有很多的优越性，且目前也未见有用环介导等温扩增技术检测单核增生李斯特的基因快速诊断试剂盒。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种检测成本低、使用方便、检测快速高效、灵敏度高的基于环介导等温扩增技术的单核增生李斯特菌基因快速诊断试剂盒，该试剂盒是基于环介导等温扩增技术来检测单核增生李斯特菌的。

本发明的另一个目的是提供上述单核增生李斯特菌基因快速诊断试剂盒的检测方法。

本发明的上述目的是通过如下技术方案予以实现的：

一、本发明的单核增生李斯特菌基因快速诊断试剂盒，是由两对引物、Bst DNA聚合酶、反应液、稳定液、样品预处理液、显色液和阳性对照液组成，以上六种液体分别置于容器中，其中：

所述两对引物为：

外引物F3：ACAAGACTTCACCAATCCA，如SEQ ID NO：1所示；

外引物B3：GTCTTTTAAGTGGAGTAAACCTT，如SEQ ID NO：2所示；

内引物FIP：TAAGTCTCTTTGCAATTGACCGACTTTTACGTGTACACAGAAAAGCG，如SEQ ID NO：3所示；

内引物BIP：CCTGTGCCAAAGCATTTTTACATTTTTTAGGCAAGTCATCTTGTTCG，如SEQ ID NO：4所示；

上述反应液含有1.6～2mmol/L dNTP、20～25mmol/L Tris-HCl、10～12.5mmol/L氯化钾、10～12.5mmol/L硫酸铵、8～10mmol/L硫酸镁、0.1～0.125％TritonX-100、0.8～1mol/L甜菜碱、内引物FIP/BIP各1.6～2mol/L和外引物F3/B3各0.2～0.25mol/L。优选的比例是：反应液含有2mmol/L dNTP、25mmol/L Tris-Cl、12.5mmol/L氯化钾、12.5mmol/L硫酸铵、10mmol/L硫酸镁、0.125％TritonX-100、1mol/L甜菜碱、内引物FIP/BIP各2mol/L和外引物F3/B3各0.25mol/L。(0.1～0.125％TritonX-100是：Triton X-100占反应液的体积百分比为0.1～0.125％)

上述样品预处理液含有10～20mmol/L pH 8.0的Tris-HCl、1～2mmol/L EDTA和1～1.2％Triton X-100。优选的比例是：样品预处理液含有20mmol/L pH 8.0的Tris-HCl、2mmol/L EDTA和1.2％TritonX-100。(1～1.2％Triton X-100是：Triton X-100占样品预处理液的体积百分比为1～1.2％)

上述阳性对照为单核增生李斯特菌基因组DNA。

上述显色液优选为SYBR Green I。

上述稳定液优选为石蜡油。

二、本发明基因快速诊断试剂盒的生产工艺

1、将内引物FIP/BIP和外引物F3/B3合成纯化后，定量配制，浓度检测，抽样质检；

2、将反应液无菌分装，并按照实验用进行浓度确定，抽样质检；

3、将稳定液无菌分装，抽样质检；

4、将阳性对照标本制备，分装，抽样质检；

5、组装试剂盒。

三、本发明基因快速诊断试剂盒的检测方法

1、样品处理：

将待测样品于离心管中离心，去上清，沉淀中加入样品预处理液并混合均匀，沸水浴灭活后冰上冷却，高速离心后，上清即为待用的样品模板DNA；

2、环介导等温扩增技术反应过程

在反应管中加入反应液38～40体积％、Bst DNA聚合酶0.9～1.8体积％、稳定液52～54.5体积％、样品模板DNA 4.5～9体积％，63～65℃恒温反应45～90min。所述体积百分比是指占四个组分总体积的体积百分比。

3、反应后处理

在上述反应管和阳性对照组中分别加入显色液，混匀，样品组显色与对照组相同则为阳性，否则为阴性。

本发明所说的基于环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplication of DNA，简称LAMP)快速检测单核增生李斯特菌的方法，是利用Bst DNA聚合酶和根据靶基因序列设计的两对特殊的内、外引物(即内引物FIP/BIP和外引物F3/B3)，特异性识别靶序列上的六个独立区域，启动循环链置换反应，在靶标DNA区启动互补链合成，结果在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物。LAMP反应过程中，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg²⁺结合，产生副产物——焦磷酸镁乳白色沉淀，即可通过肉眼观察判定结果。LAMP反应是在恒温(63～65℃)条件下45～90分钟内完成。这种比较温和的温度条件以及没有温度循环使所需仪器简单化，克服了传统PCR固有的检测时间长、容易污染及检测成本高等缺点。此外，这种检测方法对检测人员的技术素质要求较低，实际操作极为简便，不需要特殊的试剂和仪器设备，有利于建立成本低廉的快速筛选体系。LAMP法是一种简便、快速、高度特异性的基因扩增法。将恒温基因扩增技术与PCR技术(包括荧光实时定量PCR技术)进行比较，可以发现该技术在灵敏度、特异性和检测范围等方法学指标上相当于或优于PCR技术，且不依赖任何专门的仪器设备即可实现现场高通量快速检测，而且检测成本远低于荧光定量PCR技术。国内目前尚未有这方面的试剂盒出售。目前国家标准中以微生物分离培养和形态学鉴定为主、结合生化分析和血清学分型鉴定的通行方法，初步鉴定需2～3天，完成鉴定报告需10～15天；采用本发明的基因快速诊断试剂盒仅需2小时。并且，本发明的反应液中加入了显色液，鉴定结果更为直观清晰。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：1.本发明的基因快速诊断试剂盒只需一个恒定温度就能扩增反应，不需要特殊试剂与设备，检测成本低；2.本发明的基因快速诊断试剂盒应用六个区段，四条引物，根据是否扩增就能判断靶标物质的存在与否，因此具有高特异性；3.本发明的基因快速诊断试剂盒扩增快速且高效，在不到1小时即可完成扩增，且产率高；4.本发明的基因快速诊断试剂盒灵敏度高，扩增模板仅需10拷贝或更少；5.本发明的基因快速诊断试剂盒鉴定简便，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg²⁺结合，产生副产物一焦磷酸镁沉淀，可通过肉眼观察鉴定，并且加入显色液后，阴阳性结果显色差异显著，验证率高，更加明显可靠。

附图说明

图1为细菌及细菌DNA混合液LAMP结果图；

图1中，1为阳性对照；2为阴性对照；3-9分别为：英诺克李斯特氏菌、绵羊李斯特氏菌、威尔斯李斯特氏菌、格氏李斯特氏菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157、金黄色葡萄球菌；10-30为21例单增李斯特菌；31为细菌DNA混合液。

图2为单增李斯特氏菌不同稀释浓度LAMP检测结果；

图2中，l为细菌原液；2-11分别为10¹-10¹⁰稀释倍数；12为阳性对照；13为阴性对照。

图3为单增李斯特氏菌不同稀释浓度LAMP检测结果；

图3中，M为Marker；1为阳性对照；2为阴性对照；3为细菌原液，4-13分别为10¹-10¹⁰稀释倍数。

具体实施方式

实施例1  试剂盒的制备

(1)按以下序列经DNA合成仪合成寡聚脱氧核酸引物：

外引物F3：ACAAGACTTCACCAATCCA，如SEQ ID NO：1所示；

外引物B3：GTCTTTTAAGTGGAGTAAACCTT，如SEQ ID NO：2所示；

内引物FIP：TAAGTCTCTTTGCAATTGACCGACTTTTACGTGTACACAGAAAAGCG，如SEQ ID NO：3所示；

内引物BIP：CCTGTGCCAAAGCATTTTTACATTTTTTAGGCAAGTCATCTTGTTCG，如SEQ ID NO：4所示；

(2)购置DNA聚合酶：Bst DNA聚合酶置于容器。

(3)配制反应液：反应液含有2mmol/LdNTP、25mmol/L Tris-Cl、12.5mmol/L氯化钾、12.5mmol/L硫酸铵、10mmol/L硫酸镁、0.125体积％TritonX-100、1mol/L甜菜碱、内引物FIP/BIP各2mol/L和外引物F3/B3各0.25mol/L，置于容器。

(4)配制样品预处理液：样品预处理液含有20mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)、2mmol/L EDTA和1.2体积％Triton X-100，置于容器。

(5)购置稳定液：石蜡油，置于容器。

(6)购置显色液：SYBR Green I，置于容器。

(7)提取阳性对照：单核增生李斯特菌基因组DNA，置于容器。

(8)将上述7个容器装成试剂盒，封装。

制备工艺简述如下：

1、将内引物FIP/BIP和外引物F3/B3合成纯化后，定量配制，浓度检测，抽样质检；

2、将反应液无菌分装，并按照实验用进行浓度确定，抽样质检；

3、将稳定液分装，抽样质检；

4、将阳性对照标本制备，分装，抽样质检；

5、组装试剂盒。

实施例2  试剂盒的制备

反应液的配方为：反应液含有1.8mmol/LdNTP、20mmol/LTris-Cl、10mmol/L氯化钾、10mmol/L硫酸铵、8mmol/L硫酸镁、0.1体积％TritonX-100、0.8mol/L甜菜碱、内引物FIP/BIP各1.6mol/L和外引物F3/B3各0.2mol/L。

样品预处理液的配方为：样品预处理液含有10mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)、1mmol/L EDTA和1体积％Triton X-100。

其他同实施例1。

实施例3  单增李斯特菌基因快速诊断试剂盒的应用

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株

本公司用菌株有28株，主要来源于美国标准生物品收藏中心、临床分离菌株和环境分离菌株。详见表1。

表1  菌株名称及来源

  菌株来源  菌株及编号  美国标准生物品收藏  中心(ATCC)  单增李斯特氏菌(7466)、英诺克李斯特氏菌(33090)、  绵羊李斯特氏菌(19119)、威尔斯李斯特氏菌(35897)、  格氏李斯特氏菌(25401)；  临床分离株  来源于检测样品中的单增李斯特菌20株；  其它菌株  沙门氏菌、大肠杆菌O157、金黄色葡萄球菌各1株。

1.1.2主要仪器和试剂

1.2分离菌株的鉴定

1.2.1单增李斯特菌的培养单增李斯特菌穿刺培养的菌种用营养肉汤复苏，30℃，培养24-48小时。于普通营养琼脂平板30℃培养24-48小时分离出单菌落。

1.2.2临床分离株的分离鉴定临床分离株增菌后，于牛津平板上分离出单菌落，接种于三糖铁(TSI)斜面培养基观察是否产酸、产气和产硫化氢等项目，同时接种于硫化氢-靛基质-动力(SIM)琼脂试验，培养于25℃，观察是否有动力且成伞形状或月牙状生长。挑可疑单菌落作革兰氏染色，采用广东环凯微生物科技有限公司的单核增生性李斯特菌生化鉴定盒进行生化确认。

1.3样品处理(模板DNA提取)

1.3.1取1mL液体培养的菌液样品，10000rpm离心2分钟，获得菌体沉淀；

1.3.2在上述菌体沉淀中加入100μL样品预处理液混合均匀，沸水中煮20分钟后立即置于冰上冷却10分钟，10000rpm离心2分钟，上清即为样品模板DNA。

1.4环介导等温扩增技术的反应过程

1.4.1在200μL反应管配制反应体系：反应液22μL，Bst DNA聚合酶0.5μL(4U)，稳定液30μL，模板DNA 2.5μL。

1.4.2将配制好的反应管于65℃恒温反应1小时。

1.5反应后处理

向上述反应产物中加入2μL SYBR Green I，混匀，同时也向阳性对照管(单增李斯特氏菌基因组DNA)和阴性对照管(去离子水)中加入SYBR Green I混匀，若反应管与阳性对照管一样显现绿色则为阳性，若反应管与阴性对照管一样显现橙色则为阴性。

1.6电泳

配制0.2％琼脂糖凝胶电泳。以SYBR Green I作为染料进行显色反应观察结果。

1.7特异度试验

1.7.1纯菌株LAMP检测用LAMP方法对28株细菌进行扩增，根据显色反应观察结果，绿色为阳性，橙色阴性，验证方法特异性。

1.7.2几种菌株混合DNA检测用LAMP对单增李斯特氏菌及沙门氏、大肠杆菌O157、金黄色葡萄球菌的DNA等体积混合液取2ul作LAMP检测。

1.8灵敏度试验将单增李斯特氏菌(7466)于普通营养琼脂平板上纯培养24-48小时后，挑两满环菌落混悬于5mL无菌生理盐水中，用生理盐水10倍倍比稀释至10^-10。选择适宜的3个浓度级取100ul平铺于普通营养琼脂平板上，分别作3个平板，30℃培养48h，取菌落数在30～300之间的平板作平板计数，该浓度级的3个平板的菌落数的均数推算细菌浓度，为菌落平均数×稀释倍数×10；同时，各浓度级取1mL，提取DNA，作LAMP检测。

1.9重复性试验特异度试验和灵敏度试验分别重复2次。

2结果

2.1单增李斯特氏菌LAMP检测方法的建立

2.2特异度试验单增李斯特氏菌(7466)检测结果阳性，7株非单增李斯特氏菌均阴性，单增李斯特氏菌及沙门氏菌、大肠杆菌O157、金黄色葡萄球菌4种细菌DNA混合液为阳性，如图1。结果显示试剂盒具有高特异性。

2.3灵敏度试验经菌落平板计数，选择第6个稀释度进行读数，平均菌落数为181cfu，推算细菌原液浓度为1.81×10⁸cfu/mL，LAMP方法可检测到第5个稀释度，为1.81×10³cfu/mL。如图2。

2.4电泳观察对上述LAMP产物进行电泳观察，产物梯状条带清晰，符合正常扩增的条带模式，如图3所示。

2.5重复性试验特异度试验重复两次，结果一致。灵敏度试验重复两次，数量级一致。

<110>广州华峰生物科技有限公司

<120>基于环介导等温扩增技术的单核增生李斯特菌基因快速诊断试剂盒及其检测

     方法

<130>

<160>4

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

外引物F3：ACAAGACTTCACCAATCCA

<210>2

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

外引物B3：GTCTTTTAAGTGGAGTAAACCTT

<210>3

<211>47

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

内引物FIP：TAAGTCTCTTTGCAATTGACCGACTTTTACGTGTACACAGAAAAGCG

<210>4

<211>47

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

内引物BIP：CCTGTGCCAAAGCATTTTTACATTTTTTAGGCAAGTCATCTTGTTCG