硅胶柱层析分离大黄酚和大黄素甲醚的方法

摘要

本发明公开了一种硅胶柱层析分离大黄酚和大黄素甲醚的方法，包括：将硅胶装柱，或取商品硅胶填充柱，将含大黄酚与大黄素甲醚混合物的样品用溶剂溶解与硅胶拌样，并挥干溶剂后上样，或用低极性溶剂溶解直接进样，在适宜压力下，先用石油醚洗脱极性小于大黄酚的杂质，再用石油醚/醋酸丁酯，比例为100/0.1～10/1洗脱大黄酚与大黄素甲醚，薄层层析跟踪检测，相同流份合并，依次分离得到大黄酚与大黄素甲醚，分别经结晶与重结晶得到纯品。本发明方法载样量大，分离效率高，所采用洗脱剂安全、环保，可反复回收利用，成本低廉，既适用于试验室少量制备，又可实现大批量工业化生产，所得大黄酚和大黄素甲醚纯度均达99％以上，可作为中药化学对照品使用，或作为医药及化工原料应用。

说明书

技术领域

本发明涉及中草药成分提取与分离，更确切地说涉及高纯度大黄酚和大黄素甲醚的分离方法。

背景技术

大黄酚和大黄素甲醚属于蒽醌类化合物，是天然存在于多种中药中的两种有效成分，如大黄、虎杖、决明子、何首乌等中药均含有该两种游离蒽醌苷元或与糖结合的蒽醌苷类。大黄酚具有止血、抗衰老的作用，还具有对AlCl₃致急性衰老小鼠记忆障碍的保护作用及抗常压缺氧、急性脑缺氧和提高机体耐力的作用。大黄酚经氧化可制成大黄酸，再经乙酰化可制成双醋瑞因，后者是治疗骨关节炎的重要药品原料。大黄素甲醚对人体宫颈癌Hela细胞生长抑制作用较强，还可有效抑制ICAM-1和caspase-3的表达，减轻脑出血血肿周围组织损伤。大黄酚和大黄素甲醚极性相近，酸碱度也相近，对其混合物的分离比较困难。

目前对其分离方法研究有不少报道，包括纤维素粉柱、磷酸氢钙柱、硅胶干柱层析、离心薄层分离及硅胶柱层析等，虽均有一定特点和优点，但缺点也十分明显，如纤维素粉难制备，商品纤维素粉价高，磷酸氢钙需要用酸调至合适pH值，处理麻烦且不易常握最佳条件，硅胶干柱层析与离心薄层制备量十分有限。现有的硅胶柱层析分离方法中使用最多的洗脱剂为石油醚与石油醚/醋酸乙酯系统，单纯以石油醚洗脱虽可获得不错的分离效果，但由于石油醚极性过小，洗脱时间大大延长，生产效率低下，而石油醚/醋酸乙酯系统对大黄酚和大黄素甲醚的分离效果很差，载样量小，无法批量制备。

王定勇等于《广东药学院学报》2007年10月25卷5期报道了一种高效分离大黄酚和大黄素甲醚的简便方法，采用硅胶柱色谱进行分离，在以工业级柱层析硅胶(100～200目)为填充剂的色谱柱上，以石油醚∶乙酸乙酯∶甲酸(体积比100∶1∶0.5)为洗脱剂，可以将大黄酚和大黄素甲醚完全分离。硅胶柱层析中分离大黄酚与大黄素甲醚时于石油醚/醋酸乙酯中加入少量甲酸或醋酸确实可以明显改善分离效果，但甲酸与醋酸沸点均很高，与石油醚/醋酸乙酯沸点相差大，溶剂回收后三者之间的比例变化较大，不利于回收溶剂的再利用，另外本方法洗脱剂中含有酸，对色谱柱和回收设备要求耐酸腐蚀，而工业生产常用不锈钢设备，故本方法仅适用于试验室小量制备，无法适应工业化大量生产。

中国专利申请CN1594261的专利“一种高纯度大黄素甲醚和大黄酚的制备方法”公开了一种高速逆流色谱法(HSCCC)从中药大黄中分离高纯度大黄素甲醚和大黄酚的制备方法，但本方法需要的高速逆流色谱仪价格昂贵，最佳分离条件需要反复摸索而得，制备量也十分有限，难以推广应用。

中国专利授权公告CN1310164的专利“一种分离大黄素甲醚和大黄酚的方法”公开了一种根椐酸碱质子理论的原理，选择适宜的溶剂，使大黄素甲醚和大黄酚之间的Pka之差加大，进而用pH梯度萃取法使二者达到良好的分离的方法。但该方法大量使用强酸、强碱及有机溶剂萃取，势必对环境造成较大污染，并且萃取次数多，容易乳化，萃取过程成分的交叉很难避免，产品纯度必然受到影响。

发明内容

本发明目的是：提供一种硅胶柱层析分离大黄酚和大黄素甲醚的方法，克服现有分离大黄酚和大黄素甲醚生产工艺存在的缺点，以及无法满足药理活性的筛选与临床应用需求的缺陷，是一种工艺简便，适合工业化批量生产的生产工艺。

本发明的技术方案是：

采用硅胶柱，用商品硅胶填充柱或自装柱，常压分离采用100-300目粒径的硅胶，干法装柱或与石油醚搅拌均匀，去除气泡后湿法装柱，用石油醚洗脱平衡好备用。选用粒径更细的硅胶可获得更好的分离效果，如硅胶H和硅胶G，但需要柱前加压，采用低压或中压，或柱后真空减压，以提高流速。通过对含两种游离蒽醌苷元或与糖结合的蒽醌苷类的中药直接提取或将蒽醌苷水解后提取得到大黄酚与大黄素甲醚混合物，将其用溶剂，如丙酮、氯仿、醋酸乙酯等溶解与硅胶拌样，并挥干溶液剂后上样，或用低极性溶剂，如石油醚溶解直接进样，根据选用硅胶粒径的不同，采用常用、低压、中压或柱后真空减压，先用石油醚洗脱极性小于大黄酚的杂质，再用石油醚/醋酸丁酯，比例为100/0.1～10/1洗脱大黄酚与大黄素甲醚，薄层层析跟踪检测，相同流份合并，依次分离得到大黄酚与大黄素甲醚，分别经结晶与重结晶得到纯品。

产品检测使用高效液相色谱仪，紫外检测器。C₁₈-ODS柱；流动相：甲醇-水(85∶15)；流速：1.0ml/min；样品进样浓度约0.1mg/ml，进样量为10μl，大黄酚与大黄素甲醚混合物采用外标法进行定量分析。大黄酚与大黄素甲醚的纯度分析采用峰面积归一化法检测。

本发明的优点是：

1、本发明硅胶柱层析中采用的洗脱剂石油醚/醋酸丁酯较石油醚/醋酸乙酯系统分离效果好，载样量大。

2、本发明方法中的洗脱剂可反复回收利用，成本低廉。中国专利授权公告号为CN1310164的专利中列出成本核算，制备1克大黄素甲醚的材料与试剂成本约需200元人民币，而采用本发明方法，同等的材料成本，以分析纯试剂计算，可分出3克以上的大黄素甲醚和10克以上的大黄酚，材料成本优势明显，而时间也仅需2-4天。

3、本发明方法所用洗脱剂安全、低毒、可重复利用，有利于操作人员的劳动保护和环境保护。

4、本发明工艺路线简化易操作，可实现从实验室小量制备到工业化批量生产。

下面结合实施例对本发明作进一步描述：

具体实施方式

实施例1大黄酚和大黄素甲醚混合物的制备

取大黄粉15kg，加10倍量20％硫酸，于水浴上加热3小时，过滤，滤饼水洗至近中性后70℃干燥。取干燥后粉末用乙酸乙酯分数次加热回流提尽总游离蒽醌，回收乙酸乙酯液得总游离蒽醌580g，以丙酮溶解，将其与600克硅胶(100-200目)拌样，于旋转蒸发仪上蒸干溶剂，取出，60℃干燥，研细，过80目筛，上硅胶短粗柱(1.2kg硅胶，100-200目，干法装柱)，用氯仿快速洗脱，回收氯仿，得大黄酚和大黄素甲醚混合物230克。产品分析使用岛津高效液相色谱仪，LC-10ATvp溶剂输送泵，SPD-10Avp紫外-可见检测器。HW-2000色谱工作站(上海千谱软件有限公司)。色谱柱：Shim-packVP-ODS柱(150×4.6mm，5μm)；甲醇-水(85∶15)；检测波长：254nm流速：1.0ml/min；灵敏度：0.02AUFS。样品进样浓度约0.1mg/ml，进样量为10μl，采用外标法进行定量分析，结果测得混合物中大黄酚含量为68.1％、大黄素甲醚含量为20.6％

实施例2大黄酚和大黄素甲醚的常压硅胶柱层析分离

取实施例1制备的大黄酚和大黄素甲醚混合物50克，以氯仿溶解，将其与50克硅胶(100-200目)拌样，于旋转蒸发仪上蒸干溶剂，取出，60℃干燥，研细，过80目，备用。另取200-300目的硅胶2kg，与石油醚(60～90°)搅拌均匀，去除气泡后湿法装柱，用石油醚(60～90°)洗脱平衡，上样，先用石油醚洗脱极性小于大黄酚的杂质，再用石油醚(60～90°)/醋酸丁酯，比例为100/0.5～30/1梯度洗脱，硅胶薄层层析跟踪检测，展开剂为石油醚(60～90°)∶醋酸丁酯(20∶1)，日光下检视，相同流份合并，依次分离得到大黄酚与大黄素甲醚，大黄酚用醋酸乙酯结晶与重结晶，得金黄色六角型片状结晶纯品26.3g，大黄素甲醚分别用甲醇与丙酮结晶与重结晶，得金黄色针晶纯品7.6g。纯度检测采用高效液相色谱峰面积归一化法测定，具体色谱条件同实施例1，测得大黄纯度为99.8％，大黄素甲醚纯度为99.2％。以上总共消耗石油醚(60～90°)15.5升(含可再次利用的石油醚/醋酸丁酯混合物6.5升)、醋酸丁酯500ml。所用时间为4天。

实施例3大黄酚和大黄素甲醚的低压硅胶柱层析分离

取实施例1制备的大黄酚和大黄素甲醚混合物10克，以氯仿溶解，将其与10克硅胶(200-300目)拌样，于旋转蒸发仪上蒸干溶剂，取出，60℃干燥，研细，过100目筛，备用。另取500g硅胶H，与石油醚(60～90°)搅拌均匀，去除气泡后湿法装柱，用石油醚(60～90°)洗脱平衡，上样，球型加液球加入洗脱液，用氮气瓶加压，压力为2～3kPa，先用石油醚洗脱极性小于大黄酚的杂质，再改用石油醚(60～90°)/醋酸丁酯，比例为100/1～20/1梯度洗脱，硅胶薄层层析跟踪检测，展开剂为石油醚(60～90°)∶醋酸丁酯(20∶1)，日光下检视，相同流份合并，依次分离得到大黄酚与大黄素甲醚，大黄酚用丙酮结晶与重结晶，得金黄色六角型片状结晶纯品5.5g，大黄素甲醚用丙酮结晶与重结晶，得金黄色针晶纯品1.4g。纯度检测采用高效液相色谱峰面积归一化法测定，具体色谱条件同实施例1，测得大黄纯度为99.5％，大黄素甲醚纯度为99.4％。以上总共消耗石油醚(60～90°)6升(含可再次利用的石油醚/醋酸丁酯混合物1.5升)、醋酸丁酯250ml。所用时间为3天。

实施例4大黄酚和大黄素甲醚的真空减压硅胶柱层析分离

取实施例1制备的大黄酚和大黄素甲醚混合物5克，以氯仿溶解，将其与5克硅胶(200-300目)拌样，于旋转蒸发仪上蒸干溶剂，取出，60℃干燥，研细，过100目筛，备用。另取200g硅胶H，与石油醚(60～90°)搅拌均匀，装入500ml垂容漏斗内，置抽滤瓶上，抽滤瓶以橡皮管连接真空泵，真空减压抽干溶剂，压实，硅胶表面压平后上样，样品上平铺20克200-300目的硅胶，压实，加一张大小适宜的圆型滤纸，先用石油醚真空减压洗脱极性小于大黄酚的杂质，再分别用石油醚(60～90°)/醋酸丁酯，100∶1、50∶1、30∶1、20∶1真空减压梯度洗脱，硅胶薄层层析跟踪检测，展开剂为石油醚(60～90°)∶醋酸丁酯(10∶1)，日光下检视，相同流份合并，依次分离得到大黄酚与大黄素甲醚，大黄酚用乙酸乙酯结晶与重结晶，得金黄色六角型片状结晶纯品2.2g，大黄素甲醚用丙酮结晶与重结晶，得金黄色针晶纯品0.65g。纯度检测采用高效液相色谱峰面积归一化法测定，具体色谱条件同实施例1，测得大黄纯度为99.4％，大黄素甲醚纯度为99.1％。以上总共消耗石油醚(60～90°)2000ml、醋酸丁酯100ml。从装柱至样品全部洗脱完毕仅用时6小时。