碱性氨基酸盐酸盐结晶的取得方法

摘要

本发明的目的在于：提供一种产品收率和品质与以往技术中的大致相同并且更简便的、从含有硫酸根离子的碱性氨基酸发酵液中分离取得碱性氨基酸盐酸盐的方法。本发明提供一种从含有硫酸根离子的碱性氨基酸发酵液或者以产生碱性氨基酸的微生物的生物菌体为催化剂进行了酶反应的含有硫酸根离子的酶反应液中取得碱性氨基酸盐酸盐结晶的方法，其特征在于，(1)向含有硫酸根离子的碱性氨基酸发酵液或者酶反应液中，添加选自钙、钾、镁和钡中的金属的氯化物，使该硫酸根离子以该金属的硫酸盐结晶的形式析出，(2)从该碱性氨基酸发酵液中除去该金属的硫酸盐结晶，(3)将除去了该金属的硫酸盐结晶的碱性氨基酸发酵液维持在该金属的硫酸盐的饱和溶解度以下的同时进行冷却，使碱性氨基酸以其盐酸盐结晶的形式析出，(4)分离并采集该碱性氨基酸结晶。

说明书

技术领域

本发明涉及从含有硫酸根离子的碱性氨基酸发酵液或者以产生碱性氨基酸的微生物的生物菌体为催化剂的酶反应液中取得碱性氨基酸盐酸盐结晶的方法。

背景技术

碱性氨基酸发酵液和酶反应液通常包含来自于发酵培养基或酶反应基质液中使用的氮源的硫酸铵的硫酸根离子。

以往，为了从这种含有硫酸根离子的发酵液或酶反应液中取得纯度高的碱性氨基酸盐酸盐结晶，是使含有硫酸根离子的碱性氨基酸发酵液或酶反应液流经氨型阳离子交换树脂，吸附碱性氨基酸，硫酸根离子和与碱性氨基酸交换的氨离子同时以硫酸铵溶液的形式被排除到体系外。然后，洗涤吸附有碱性氨基酸的离子交换树脂，用氨水洗提碱性氨基酸，以洗提液中碱性氨基酸自身的形式(游离态)浓缩。而且，采用盐酸中和使游离态碱性氨基酸晶析，得到碱性氨基酸盐酸盐结晶。

但是，该取得方法存在以下问题。即，(1)为了将贯流液的硫酸铵溶液作为副产物活用，必需进行浓缩，因此，需要大量的蒸汽，和(2)洗涤树脂时产生大量的废水。

此外，取得碱性氨基酸的其它方法包括例如：向赖氨酸发酵液中添加氢氧化钾溶液，使之晶析以取得赖氨酸基(游离态)的方法(专利文献1)和对赖氨酸发酵液进行活性炭过滤除去发酵微生物菌体后，向滤液中添加氢氧化钙溶液，使硫酸钙析出除去，然后，浓缩除去氨以取得赖氨酸基的方法(专利文献2)。而且，向赖氨酸基中添加盐酸，以赖氨酸盐酸盐结晶的形式取得赖氨酸基。

但是，在上述方法中，使用金属氢氧化物和盐酸，但金属氢氧化物昂贵，与其作为金属的价值相比，作为副产物产生的该金属硫酸盐的价格非常低，结果成为一种副原料成本高的流程。此外，当加入金属氢氧化物，浓缩成规定的赖氨酸浓度时，由于在高pH区域进行加热浓缩，所以引起赖氨酸的分解反应。

另外，在该方法中，金属硫酸盐结晶和该氨基酸溶液的混悬液因该氨基酸处在碱(游离态)形式，所以粘度高，两者的分离困难。结果，大量的该氨基酸附着在金属硫酸盐上被排出，因而该氨基酸的产品回收率降低。

而在本发明的方法中，该氨基酸以盐酸盐的形式存在，所以粘度低，金属硫酸盐结晶和该氨基酸溶液在混悬液中的固液结晶分离容易，该氨基酸的产品回收率也高。

而且还存在下述问题等：金属氢氧化物通常是50％以下的水溶液，添加它将降低体系内氨基酸浓度，蒸汽成本上升；也不是没有考虑向体系内添加金属氢氧化物100％的粉末，但是，操作上危险，存在困难；同时，包括加入金属氢氧化物的工序和添加盐酸的工序，操作烦杂。

以往，不使碱性氨基酸发酵液中存在的碱性氨基酸硫酸盐和金属氯化物作用的理由是因为认为碱性氨基酸硫酸盐(的硫酸根)和金属氯化物不发生阴离子交换反应。即，溶液状态的碱性氨基酸硫酸盐和固相状态的金属氯化物是固液体系，所以不会认为发生氯彼此之间的平衡反应。这种固液体系的情况，一般认为就算是把金属氯化物以固体形式添加，其也依旧以固体形式存在，而溶解的碱性氨基酸硫酸盐依旧溶解着。

专利文献1：欧洲专利第0534865号公报

专利文献2：俄国专利第183581号公报

顺便提一下，在本发明中，碱性氨基酸只要是根据发酵法或者以微生物细胞为催化剂的酶法能生成的，则无特殊限制。氨基酸例如可举出：精氨酸、组氨酸和赖氨酸等。氨基酸的形态无特殊限制，但优选L-体。

本发明中的所谓微生物是具有生产目的氨基酸能力的微生物，或者是具有催化由基质生成目的氨基酸的反应的能力的微生物。前者用鉴于于发酵法，后者用于酶法。微生物可以是细菌、酵母、丝状菌等中的任一种，但优选细菌。此外，细菌可以是革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌中的任一种。并且，微生物可一种单独使用，也可以多种连用。

L-赖氨酸的生产菌及其育种方法具体可举出：WO95/23864号、WO96/17930号、WO2005/010175号、特开昭56-18596号、美国专利第4346170号、特开2000-189180号等例示的公知的生产菌和其育种方法。此外，L-精氨酸的生产菌及其育种方法具体可举出：美国专利申请公开2002/058315A1、俄国专利第2001112869号、EP1170358A1、EP1170361A1等例示的公知的生产菌和其育种方法。再者，L-组氨酸的生产菌及其育种方法可举出：俄国专利第2003677号、俄国专利第2119536号、美国专利第4,388,405号、美国专利第6,344,347号、美国专利第6,258,554号、俄国专利第2003677号和第2119536号、特开昭56-005099号、EP1016710A等例示的公知的生产菌和其育种方法。L-鸟氨酸的生产菌及其育种方法也是同样。

发明内容

发明要解决的课题

鉴于上述背景技术，本发明的目的在于：发现一种产品收率和品质与以往技术中的大致相同并且更简便的、从含有硫酸根离子的碱性氨基酸发酵液或者以产生碱性氨基酸的微生物的生物菌体为催化剂的酶反应液(以下在本说明书中，如果不特别说明，则关于发酵液的说明只要没必要在技术上作其它解释，则认为其也兼作关于酶反应液的说明。)中分离取得碱性氨基酸盐酸盐的方法。

解决课题的手段

本发明人等为达到上述目的进行了反复深入的研究，结果发现，采用向含有硫酸根离子的碱性氨基酸发酵液中添加金属氯化物，使该硫酸根离子以该金属的硫酸盐结晶的形式析出，将其分离，然后冷却，使碱性氨基酸以其盐酸盐结晶的形式析出的方法，能取得收率和品质高的碱性氨基酸盐酸盐结晶，基于这一见解完成了本发明。

即，本发明包括以下方式。

[1]从含有硫酸根离子的碱性氨基酸发酵液或者以产生碱性氨基酸的微生物的生物菌体为催化剂进行了酶反应的含有硫酸根离子的酶反应液中取得碱性氨基酸盐酸盐结晶的方法，其特征在于，(1)向含有硫酸根离子的碱性氨基酸发酵液或者酶反应液中，添加选自钙、钾、镁和钡中的金属的氯化物，使该硫酸根离子以该金属的硫酸盐结晶的形式析出，(2)从该碱性氨基酸发酵液中除去该金属的硫酸盐结晶，(3)将除去了该金属的硫酸盐结晶的碱性氨基酸发酵液维持在该金属的硫酸盐的饱和溶解度以下的同时进行冷却，使碱性氨基酸以其盐酸盐结晶的形式析出，(4)分离并采集该碱性氨基酸结晶。

[2][1]所述的方法，其特征在于，将该碱性氨基酸发酵液或者酶反应液中含有的菌体在所述工序(1)之前或所述工序(2)之后除去。

[3][1]或[2]所述的方法，其特征在于，该碱性氨基酸是精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或组氨酸。

[4][1]～[3]任一项所述的方法，其特征在于，硫酸根离子相对于该含有硫酸根离子的碱性氨基酸发酵液或酶反应液中的碱性氨基酸的当量比为50～150％。

[5][1]～[4]任一项所述的方法，其特征在于，该金属的氯化物的添加量以相对于该硫酸根离子的当量比计为80～120％。

发明的效果

根据本发明，可从含有硫酸根离子的碱性氨基酸发酵液中以非常简便的方法取得收率和品质良好的碱性氨基酸盐酸盐。

具体实施方式

下面，具体说明本发明。

根据本发明的方法，在从含有硫酸根离子的碱性氨基酸发酵液中取得碱性氨基酸盐酸盐结晶时，首先，进行向含有硫酸根离子的碱性氨基酸发酵液中，添加选自钙、钾、镁和钡中的金属的氯化物，使该硫酸根离子以该金属的硫酸盐结晶的形式析出的工序。

此时，本发明中使用的含有硫酸根离子的碱性氨基酸发酵液如下。即，当然必须含有硫酸根离子，但其浓度范围是在该碱性氨基酸发酵液中，硫酸根离子相对于碱性氨基酸的当量比率为50～150％的范围，优选为90～110％的范围。这是因为该当量比率比150％多时，存在供反应的氯化物离子量不必要地增加的缺点，而该当量比率比50％低时，由于超过pH8.5，所以存在该碱性氨基酸发生分解的缺点。

此处，所谓碱性氨基酸只要是精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、组氨酸或其衍生物即可，且它们可以是L体或D体的光学活性体，还可以是外消旋体。

本发明使用的碱性氨基酸发酵液或碱性氨基酸酶反应液其中所含的该碱性氨基酸的主要反离子只要是硫酸根离子即可。此外，还可以是发酵液中包含发酵生成的碱性氨基酸结晶的晶析发酵液，但此时，是在除去该结晶之后或者使其溶解之后，再供本发明的方法使用。

添加金属氯化物使该金属的硫酸盐结晶析出时的条件如下。本发明使用的金属氯化物可从氯化钙、氯化钾、氯化镁和氯化钡(包括它们的水合物)中适当选择，但优选是氯化钙和氯化钾。两者之中更优选氯化钾。其理由是因为副产品可直接活用作为肥料。

金属氯化物的添加量与硫酸根离子量相关，相对于硫酸根离子按当量比计为80～120％，优选为90～100％。

碱性氨基酸发酵液中含有的菌体预先除不除去均可。但是，从提高金属硫酸盐结晶的分离性的观点考虑，最好预先将菌体除去。

此外，在添加金属氯化物之际，可以将该碱性氨基酸发酵液浓缩，也可以不浓缩维持原状。浓缩的情况，从操作性的观点考虑，优选金属氯化物的添加时间为在浓缩之前添加。其理由是在使溶解度低的金属硫酸盐结晶析出的情况，过饱和如果大，则浆液浓度将极端增高，导致分离困难。更优选的方法是在浓缩前添加，分离析出的金属硫酸盐结晶之后，将该分离母液浓缩。

添加氯化钾的情况，添加时间在浓缩前后均可。但是，添加氯化钙的情况是在浓缩前添加氯化钙，除去硫酸钙之后浓缩，然后再次析出并分离硫酸钙，需要2次析出分离操作，很烦杂。

在添加金属氯化物之际，该碱性氨基酸发酵液的pH和温度优选pH3～8.5和温度20～90℃。具体而言，添加氯化钙的情况优选pH3～8.5和温度20～90℃。添加氯化钙以外的金属氯化物的情况优选pH3～8.5和温度50～90℃。其理由是pH超过8.5时，将促进碱性氨基酸的分解反应，导致回收率下降，而如果比3低，则碱性氨基酸溶解度上升，回收率下降，此外还因为要保持溶解度低，则添加碱，结果导致成本上升。将金属氯化物按上述规定量使用时，通常落入该范围，但必要时，适当采用酸或碱调整pH值。另外，添加氯化钙以外的金属氯化物的情况，温度比50℃低时，为防止碱性氨基酸的析出，不能提高浓度倍率，在其后的工序中难以得到高晶析率，而温度如果超过90℃，则该氨基酸发生分解。

作为在使金属硫酸盐结晶晶析之际的其它的注意事项，在金属氯化物结晶存在的固液阴离子交换反应体系的情况下，选取充分的反应时间是必要的。其为在金属氯化物添加后通产2小时以上，优选10小时以上。完全溶解体系的情况，由于仅是使金属硫酸盐浓缩晶析，所以仅需要通常的浓缩时间。

其次，进行从该碱性氨基酸发酵液除去该金属的硫酸盐结晶的工序。除去方法包括各种离心分离机，无特殊限制，但从母液的温度保持容易的观点出发，优选SDC(超级倾析器型分离机)。

接下来进行将除去了该金属的硫酸盐结晶的碱性氨基酸发酵液维持在该金属硫酸盐的饱和溶解度以下的同时冷却，使碱性氨基酸盐酸盐析出的工序。应予说明，此处冷却晶析是主要的，但也可根据需要在其前后加入浓缩操作。

通过冷却晶析使碱性氨基酸结晶析出时，维持碱性氨基酸发酵液中的该金属硫酸盐浓度在饱和溶解度以下是重要的。为此，要预先掌握该金属硫酸盐在碱性氨基酸饱和溶液中的饱和溶解度。例如，pH5.5且温度20℃时，精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸和组氨酸任何一种的情况下，硫酸钾时都是10g/dl，而硫酸钙时都是0.05g/dl。本领域技术人员可通过预备试验容易地确定所给情况的操作条件。本发明在达到所述溶解度之前停止浓缩晶析或冷却晶析。

接下来进行分离晶析的碱性氨基酸盐酸盐结晶的工序。分离方法和上述从该碱性氨基酸发酵液中除去该金属硫酸盐结晶的情况相同。但分离方法和上述从该碱性氨基酸溶液中分离该金属硫酸盐结晶的情况不同，与注意温度保持相比，更应该注意提高脱水率，除去附着母液，以提高碱性氨基酸的产品纯度，所以适合使用篮式离心分离机等分离性优异的离心分离装置。

由此得到的碱性氨基酸盐酸盐结晶的收率和品质与以往方法相比毫不逊色。具体而言，例如精氨酸的情况，使用氯化钾的采用本发明方法的氨基酸的精制方法，虽然在未进行循环的一级的一次通过中，回收率还不足50％，但是最终，通过将发酵液中的杂质经浓缩的所述氨基酸母液部分地抽出到体系外，将残留物再次混合回收到下一循环的发酵除菌液中，维持收率，在该条件下进行精制，可确保收率90％、纯度99％。氯化钙的情况下，也能确保收率为90％，纯度95％。此外，赖氨酸的情况下，使用氯化钾时，收率为90％，纯度为99％，使用氯化钙时，收率为90％，纯度为99％。

实施例

下面，通过实施例和比较例更具体地说明本发明，但本发明并不限于这些实施例。

实施例1：赖氨酸盐酸盐结晶的取得(使用KCl)

含有硫酸根离子的赖氨酸发酵液(赖氨酸硫酸盐发酵液)的制造：可用下述公知的方法制造：将碳源、氮源和微量营养素溶解于水中，加热杀菌后，倒入发酵罐。在其中添加预先增殖的生产赖氨酸的微生物的混悬液，开始培养。培养中用冷水控制发酵温度保持在35～40℃，此外，向发酵罐内一边补充空气一边控制溶解氧。伴随着培养的进行，一边补充不足的碳源、氮源和其它、若干的营养素，一边以培养25～40小时为基准，当培养中的赖氨酸生产速度下降时，结束培养。

对得到的赖氨酸硫酸盐发酵液除菌，得到下述组成的除菌液。

[表1]

将该除菌液减压浓缩到以赖氨酸基(游离态赖氨酸)换算为37w/w％(50mmHg)，添加142g氯化钾(KCl)，于60℃搅拌3小时。然后，采用台式精选机分离混悬液中的结晶，结果得到135g的硫酸钾(K₂SO₄)湿结晶和729g的赖氨酸盐酸盐溶液。在保持60℃的同时向该溶液中添加水258g，以防止硫酸钾的析出，然后，于20℃的浴中经6小时缓慢地冷却至20℃。此外，在冷却中途，在40℃时，添加10g的赖氨酸盐酸盐二水合物结晶作为结晶用的晶种。冷却后，采用台式离心分离机分离，结果取得76g的赖氨酸盐酸盐二水合物结晶。再采用流化床干燥机在110℃干燥30分钟，结果取得纯度99％的赖氨酸盐酸盐无水物结晶61g和母液770g。

另一方面，采用循环赖氨酸发酵母液的方法，根据下述方法取得赖氨酸盐酸盐无水物结晶。将该最终母液760g混合到下一循环的发酵除菌液1947g(赖氨酸含量202g(按赖氨酸盐酸盐换算))中，添加氯化钾116g后，浓缩至赖氨酸浓度为130g/100g-H₂O。浓缩后，保持混悬液温度为60℃的同时，分离混悬液中的硫酸钾，得到137g的硫酸钾和890g的上清液。然后，向该上清液中添加160g水，然后，自60℃冷却至20℃，由此可得到215g的赖氨酸盐酸盐二水合物的湿结晶。再在110℃干燥30分钟，结果可得到纯度99％的赖氨酸盐酸盐的无水物结晶180g。

这样反复循环9次，结果以回收率90％取得纯度99％的赖氨酸盐酸盐无水物结晶。

实施例2：赖氨酸盐酸盐结晶的取得(使用CaCl₂)

采用和实施例1同样的方法制造赖氨酸硫酸盐发酵液。为保存发酵液，用硫酸调至pH3.0进行保管。将赖氨酸硫酸盐发酵液进行MF膜除菌，得到下述组成的除菌液。

[表2]

为了将该除菌液的pH值调节为中性，加入12g氢氧化钙(Ca(OH)2)，使pH＝5.5。于25℃搅拌30分钟，结果硫酸钙结晶析出。采用Nutsche过滤该混悬液，结果得到9.8g的硫酸钙结晶。向滤液中加入114g氯化钙(CaCl₂)，结果硫酸钙析出。将其用Nutsche过滤，结果得到231g硫酸钙二水合物的湿结晶和1475g的赖氨酸盐酸盐溶液。采用减压浓缩将其浓缩至370g，结果得到60℃的赖氨酸盐酸盐浓缩液(浓度35g/dl)。将该赖氨酸盐酸盐溶液冷却至20℃，取得赖氨酸盐酸盐的混悬液，采用台式精选机进行结晶分离，结果由于大量含有硫酸钙二水合物的湿结晶，所以不优选。因此，首先，通过采用Nutsche过滤该浓缩液，得到硫酸钙二水合物的湿结晶和赖氨酸盐酸盐溶液。将该赖氨酸盐酸盐溶液冷却至20℃，取得赖氨酸盐酸盐的混悬液，采用台式精选机进行结晶分离，得到203g赖氨酸盐酸盐二水合物的湿结晶。再采用流化床干燥机于110℃干燥30分钟，则可取得纯度99％的赖氨酸盐酸盐无水物结晶156g。

然后，采用循环赖氨酸发酵母液的方法，根据和实施例1中同样的方法可取得赖氨酸盐酸盐无水物结晶。这样反复循环9次，结果可取得回收率90％、纯度99％的赖氨酸盐酸盐无水物结晶。

实施例3：精氨酸盐酸盐结晶的取得(使用KCl)

含有硫酸根离子的精氨酸发酵液(精氨酸硫酸盐发酵液)的制造：使用生产精氨酸的微生物代替生产赖氨酸的微生物，其它和实施例1中同样操作，可制造精氨酸硫酸盐发酵液。

将得到的精氨酸硫酸盐发酵液除菌，得到下述组成的除菌液。

[表3]

向该除菌液中，添加氯化钾42g使之溶解后，浓缩至精氨酸浓度为100g/100g-H₂O。浓缩后，采用台式精选机分离60℃混悬液中析出的结晶，得到40g硫酸钾的湿结晶和230g精氨酸溶液。然后，向该溶液中添加水30g，冷却至20℃，采用台式精选机对混悬液进行分离，取得30g的精氨酸盐酸盐湿结晶和226g精氨酸溶液。

然后，采用循环精氨酸发酵母液的方法，对取得精氨酸盐酸盐结晶的方法根据模拟法进行试算。经计算，反复循环9次时，可取得回收率90％、纯度99％的精氨酸盐酸盐结晶。

产业实用性

本发明可用于使用碱性氨基酸盐酸盐的动物饲料领域和化妆品原料领域、医药原料领域中。