一种同步式提高异养小球藻的生物量和叶黄素的方法

摘要

本发明提供了一种同步式提高异养小球藻的生物量和叶黄素的方法，包括如下步骤：活化后的小球藻异养培养3～5天，使其处于对数生长期；然后将小球藻种子液按10％～50％体积接种量接入含Basal培养基的发酵罐中进行分批培养；小球藻在发酵罐中培养24h～72h，小球藻生长进入对数生长期后，发酵罐中的小球藻在保持葡萄糖浓度为7g/L～10g/L条件下采用分段式恒速流加培养，同时在发酵罐中添加番茄汁提取物，以促进叶黄素的积累。本发明采用分段恒速流加培养基和番茄汁提取物，实现了小球藻高细胞密度培养，同时实现叶黄素的高效积累。

说明书

技术领域

本发明涉及一种异养培养小球藻的发酵工艺，具体涉及一种同步式提高异养小球藻的生物量和叶黄素的方法。

背景技术

小球藻(Chlorella)是一种营养丰富、食用安全的单细胞绿藻，小球藻保健/功能性食品是目前国内外非常流行的健康食品，具有补充膳食营养、强化免疫、促进细胞生长和延缓衰老、维持正常血压和胆固醇水平、解毒等显著功效。小球藻中的叶黄素(lutein)是一种天然类胡萝卜素，抗氧化活性非常突出，具有能防治眼睛年龄相关性视黄斑退化(AMD)和白内障、抑制肿瘤的发生与生长、强化免疫等多种功效。叶黄素作为营养、保健、着色等多功能天然色素，已经广泛应用于医药、食品、保健品、饲料、化妆品等工业领域。

到目前为止，叶黄素的规模化生产主要是从万寿菊中提取，但这种生产方式需要占用大量的种植面积，且易于受到季节气候等外在环境因素的影响。通过发酵法异养培养小球藻生产叶黄素，可以充分利用现有的发酵技术与设备，且不受自然条件的限制，是叶黄素生产的一种的替代方式。

迄今为止，主要是利用光生物反应器来实现小球藻的高细胞密度培养。经对现有技术的文献检索发现，Del Campo等在Microbiol Biotechnol(微生物生物技术)发表的“Accumulation of astaxanthin and lutein in Chlorella zofingienisis”(小球藻中积累叶黄素)，该文中提出使用C.zofingiensis藻株，经过360h的光照自养培养，得到浓度为21mg/l的叶黄素，生产效率为0.06mg/l/h。Del Campo等在J Biotechnol(生物技术)发表的“Luteinproduction by Muriellopsis sp.in an outdoor tubular photobioreactor”(室外管式光照反应器培养Muriellopsis生成叶黄素)，该文中提出使用室外管式光照反应器培养Muriellopsis，经过240h培养得到浓度为35mg/l的叶黄素，生产效率为0.15mg/l/h。异养培养小球藻可以克服光合自养培养的诸多缺陷，具有生长速度更快、能实现纯种培养、单位体积产率高、便于自动化控制、产品质量稳定等优势，是提高小球藻产量的有效途径，比封闭式光生物反应器系统更具有优势。因此利用工业发酵技术进行小球藻的异养化高细胞密度培养，成为小球藻大规模高效工业化生产的又一发展趋势。

有鉴于此，国内外的科技工作者主要是研究通过补料流加培养方式来实现小球藻的高细胞密度生长，已取得了相当成绩的进展，如Shi XM(史贤明)等在Biotechnology Progress(生物技术进展)上发表的“High-yield production of lutein by the green microalga Chlorellaprotothecoides in heterotrophic fed-batch culture”(通过原壳小球藻的异养分批-补料培养高效生长叶黄素)，该文中提出一种原壳小球藻的分批-补料培养工艺，并通过间歇式流加培养实现细胞干重和生产效率达到48g/l和0.2g/l/h。Shi XM(史贤明)等在2008年5月发表专利《异养培养小球藻的补料优化方法》，该专利提出在建立混合神经网络模型的基础上进行分批-补料培养的优化，可使小球藻的最高细胞浓度和生产效率分别达到100g/l(干重)和1.0g/l/h以上。采用简单的流加培养方式异养培养小球藻，可以在一定程度上提高小球藻的细胞密度，但对同时提高小球藻中的叶黄素含量效果不一定显著，难以实现小球藻在高细胞密度下叶黄素的高效积累。

叶黄素作为异养小球藻的初级代谢产物，其生物合成基本属于生长相关型的。但目前以最大生物量为目标的发酵工艺，更关注的是通过改进发酵工艺来提高小球藻的生物量，以期提高总的叶黄素产率，缺乏有效的工艺手段与小球藻中叶黄素的合成代谢调控相结合，因此难以在提高生物量的同时提高叶黄素的含量，最终有效提高叶黄素产量。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的上述不足，提供一种同步式提高异养小球藻的生物量和叶黄素的方法。该方法基于对小球藻中叶黄素生物合成代谢调控的研究，筛选出了叶黄素合成的有效促进剂(合成代谢前体物)，并在流加培养过程中同时加入促进剂，实现了异养小球藻的高细胞密度及叶黄素的高效积累。本发明通过如下技术方案实现：

一种同步式提高异养小球藻的生物量和叶黄素的方法，包括如下步骤：

(1)活化后的小球藻异养培养3～5天，使其处于对数生长期；

(2)然后将小球藻种子液按10％～50％体积比(即接种量：小球藻种子液体积与小球藻种子液和培养基总体积的比)接种量接入含Basal培养基的发酵罐中，同时往发酵罐中添加葡萄糖和氮源进行分批培养，通过控制通气量保持发酵罐中的溶解氧饱和浓度20％～50％，通气过程中搅拌浆转速与溶氧浓度相偶联，起始转速控制在180～200r/m，Basal培养基的pH控制在6.1～6.5，培养温度控制在28±0.5℃，葡萄糖和氮源的摩尔比为6～12∶1；

(3)步骤(2)中的小球藻在发酵罐中培养24h～72h，小球藻生长进入对数生长期后，发酵罐中的小球藻在保持葡萄糖浓度为7g/L～10g/L条件下采用分段式恒速流加培养，同时在发酵罐中添加番茄汁提取物，以促进叶黄素的积累。

上述同步式提高异养小球藻的生物量和叶黄素的方法中，各步骤中的培养基均采用改良的Basal培养基，其组分mg/L为1升水中含有：KH₂PO₄1250，MgSO₄·7H₂O1000，EDTA500，H₃BO₃114.2，CaCl₂·2H₂O111，FeSO₄·7H₂O49.8，ZnSO₄·7H₂O88.2，MnCl₂·4H₂O14.2，MoO₃7.1，CuSO₄·5H₂O15.7，(CoNO₃)2·6H₂O4.9。

上述同步式提高异养小球藻的生物量和叶黄素的方法中，所述氮源采用无机氮源硝酸盐或者有机氮源尿素。

上述同步式提高异养小球藻的生物量和叶黄素的方法中，葡萄糖和氮源的摩尔比为8.9～10.1∶1。

上述同步式提高异养小球藻的生物量和叶黄素的方法中，所述分段式恒速流加培养具体为：将整个培养过程分为4～6阶段，每个阶段24h，通过流加培养基的方式控制每个阶段发酵罐中的葡萄糖浓度为7g/L～10g/L，同时在每个阶段开始时于发酵罐中添加番茄汁提取物，以促进叶黄素的积累。

上述同步式提高异养小球藻的生物量和叶黄素的方法中，分段式恒速流加培养所用的培养基中葡萄糖浓度为480g/L、尿素浓度为68.57g/L，流加用的培养基中的Basal培养基组分与葡萄糖按比例提供，该比例为上述分批培养时Basal培养基中的组分与所添加葡萄糖的比例。

上述同步式提高异养小球藻的生物量和叶黄素的方法中，在发酵罐中进行小球藻的分段式恒速流加培养的同时，流加番茄汁提取物，每个阶段添加番茄汁提取物的量为3～5ml/L，使得小球藻生物量浓度和叶黄素含量同时提高。

上述同步式提高异养小球藻的生物量和叶黄素的方法中，番茄汁提取物的制备过程为：市售纯番茄汁先冷冻干燥，将番茄汁粉置于离心管中，加入丙酮，在振荡器上振荡混匀，离心，取上清液；渣经反复提取变成白色为止，合并上清液并氮气吹干，用DMSO定容。

上述同步式提高异养小球藻的生物量和叶黄素的方法中，番茄汁提取物的制备方法为：市售纯番茄汁先冷冻干燥，称取250mg的番茄汁粉，置于10mL的离心管，加5mL的丙酮，在振荡器上振荡混匀，离心，取上清液；渣经反复提取变成白色为止，合并提取液并氮气吹干，用DMSO定容至50ml。为了更好地实现本发明，步骤(1)中发酵罐溶氧浓度必须保持在20％-50％之间，除了控制通气量和搅拌浆转速的调节，可以通过通入纯氧以保证溶氧的稳定。

所述步骤(3)中第一次补加培养基优选控制在24h。

步骤(3)中根据小球藻生长期的变化，优选的补加培养基时间段如下：(24h-72h)、(72h-109h)、(72h-109h)、(168h-215h)、(215h-240h)。

所述步骤(4)中，添加的番茄汁提取物每ml含有总类胡萝卜素0.846μg/ml，主要成分为番茄红素。根据流加补料研究确定添加量为0.0005mg/L番茄红素。(附HPLC图)

本发明采用分段式恒速流加培养基的操作方式，维持发酵液中的低葡萄糖浓度(10g/L)，有效延长小球藻的对数期，小球藻生物量浓度大大提高，实现了小球藻高细胞密度45.5g/L。

本发明在分段式恒速流加过程中，采用分阶段添加叶黄素促进剂-番茄汁提取物的方法，有效增加了合成叶黄素的代谢流量，使得小球藻生物量提高的同时叶黄素得到高效积累。

本发明利用叶黄素生物合成途径的代谢调控技术，以低浓度葡萄糖流加补料的发酵方式，来实现异养小球藻的生物量和叶黄素同时高产的方法。具体来说，本发明采用分段式恒速流加培养基的操作方式，实现异养小球藻的高细胞密度；通过对叶黄素合成代谢途径的分析，筛选出了促进叶黄叶黄素高效积累和适应小球藻细胞生长的诱导物-番茄汁提取物，确定了最适于叶黄素大量积累的使用浓度；根据高密度培养过程中小球藻生长期变化和叶黄素含量状况，分段恒速流加培养基和番茄汁提取物，实现了小球藻高细胞密度培养的同时叶黄素的高效积累。与现有技术相比，具有如下的优点及效果：

(1)本发明将优化发酵工艺和叶黄素诱导积累条件进行技术集成，既能提高小球藻细胞浓度，同时又能高效积累叶黄素，一举两得。

(2)本发明采用成本低廉的番茄汁提取物作为叶黄素的合成促进剂，其机理在于：番茄汁提取物提供了大量的合成叶黄素的多种前体物质(主要是番茄红素)，在小球藻细胞中直接得到转化，使叶黄素含量较对照组显著提高40.65％。番茄是一种较为廉价的果蔬，番茄汁提取物的制备也和简单经济，因此采用番茄汁提取物作为促进异养小球藻高产叶黄素的添加剂具有重要的实用价值。

(3)本发明采用的分段式恒速流加操作方式简单可行，放大培养可以按照本发明中流加方式实施放大。

附图说明

图1为实施例1中7L发酵罐中小球藻分段式恒速流加培养时细胞生长、葡萄糖消耗的变化趋势图。

图2为实施例1中7L发酵罐中小球藻分段式恒速流加培养时叶黄素产量和叶黄素含量的变化趋势图。

图3为实施例中小球藻番茄汁提取液的HPLC图谱。

图4为图3所示HPLC图谱中峰1对应的紫外/可见吸收光谱图。

图5为图3所示HPLC图谱中峰2对应的紫外/可见吸收光谱图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

下列实施例中如无特别说明，可按照常规条件，例如按照《生化实验方法和技术》(高等教育出版社，1997)，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

(1)所采用的小球藻藻株为Chlorella protothocoides CS-41(购自CSIRO MarineLaboratory Hobart，Australia)，将活化后的小球藻异养培养5天，使其处于对数生长期；然后将小球藻种子液按10％(v/v)接种量接入含Basal培养基的发酵罐中，Basal培养基的组分mg/l为1升水中含有：KH₂PO₄ 1250，MgSO₄·7H₂O 1000，EDTA 500，H₃BO₃ 114.2，CaCl₂·2H₂O 111，FeSO₄·7H₂O 49.8，ZnSO₄·7H₂O 88.2，MnCl₂·4H₂O 14.2，MoO₃ 7.1，CuSO₄·5H₂O 15.7，(CoNO₃)₂·6H₂O 4.9；同时在Basal培养基中添加葡萄糖和尿素，葡萄糖添加量为10g/L，葡萄糖和尿素的摩尔比为8.9。在7升发酵罐中进行分批培养，培养条件为：培养基装量3.5升；接种量10％(v/v)；pH6.5±0.2；温度28±0.5℃，溶解氧50％饱和浓度；搅拌浆转速与溶氧浓度相偶联，起始转速控制在200r/m；在外接补充纯氧时，可在气路中添加一个无菌水瓶以保持气流湿润，维持发酵罐内的水分平衡。

(2)小球藻在发酵罐中培养24h后，小球藻生长进入对数生长期后，发酵罐中的小球藻采用分段式恒速流加培养，即开始在发酵罐中流加培养基，维持发酵罐中的葡萄糖浓度在10g/L左右；流加用的培养基中葡萄糖浓度为480g/L、尿素浓度为68.57g/L，流加用的培养基中的其他组分与葡萄糖按比例提供，比例为上述分批培养时Basal培养基中的组分与所添加葡萄糖的比例(重量比)。

小球藻接种24h后小球藻生长进入对数期，葡萄糖消耗速率很快，开始进行分段式恒速流加培养，补加葡萄糖，具体分段如下：第一段(从起始点24h-72h)培养基的流加速率为3.5ml/h；到72h因耗糖速率增大，改变流加速率。第二段(72h-109h)流加速率为4.68ml/h；到109h进入对数旺盛期，耗糖速率更快，加大流加速率，第三段(72h-109h)流加速率为6.2ml/h；到168h进入对数后期，虽然耗糖速度下降，但是生物量浓度仍不断上升，降低流加速率，第四段(168h-215h)流加速率为3.12ml/h；到215h糖的消耗速率进一步降低，进入生长稳定期，因此降低流加速度。第五段(215h-240h)流加速率为1.6ml/h。

(3)在24h、72h、109h和168h时分别添加番茄汁提取物10.5ml；

(4)待培养结束后取样测定生物量浓度和叶黄素含量，生物量采用干重法测定，测得生物量浓度最高为45.5g/L；叶黄素含量通过HPLC来测定，测得叶黄素含量最高为2.825mg/g。

在上述整个培养过程中，要定时取样监测生物量浓度、葡萄糖浓度、叶黄素含量，计算总叶黄素产量。葡萄糖浓度的测定采用SBA-80生物分析仪进行测定；小球藻生物量采用细胞干重法测定。实验结果见附图1和附图2.

由图1所示，在维持10g/L的葡萄糖浓度下培养小球藻，小球藻细胞生长有短暂的延滞期，随后即开始大量消耗葡萄糖，小球藻生物量浓度也逐渐增加。当培养到24小时时，小球藻细胞即进入对数生长前期，小球藻细胞生长迅速，生物量浓度迅速增加，由于葡萄糖耗糖速率很快，因此必须开始补加培养基，其中流加葡萄糖浓度为480g/L，流加培养基中的其他组分与葡萄糖按比例提供，流加速率为3.5mL/h；到72小时时，由图所示，小球藻细胞进入对数生长中期，耗糖速率不断加大，因此加大流加的速率，改变流加速率为4.68mL/h；到109小时时，小球藻细胞进入对数旺盛期，耗糖速率更快，加大流加的速率，流加速率为6.2mL/h；到168h小球藻生长进入对数后期，虽然耗糖速度下降但是生物量浓度仍不断上升，改变流加速率，流加速率为3.12mL/h；到215h残糖的浓度下降速率较小，进入生长稳定期，因此降低流加速度，流加速率为1.6mL/h。从图中可以看到从补料开始小球藻的生物量持续上升，到215小时时，达到最高的生物量，小球藻生物量浓度为45.5g/L。因此采用215小时为收获小球藻生物量浓度的最适时间。

由图2所示，由于转接的小球藻种子液是处于生长对数期的种子液，因此小球藻细胞中叶黄素的含量相对较高，随着培养的进行，0-24小时段，叶黄素含量不断降低，但是由于生物量浓度增加，因此叶黄素产量不断增加。在进入对数生长期后，叶黄素含量也不断上升，在细胞进入稳定期后，细胞进一步合成叶黄素，但叶黄素含量上升变得缓慢，当培养至190小时，叶黄素含量达到最高值为2.825mg/g，这时叶黄素含量不再上升，而生物量浓度仍有微量上升，因此叶黄素产量仍有微量上升，当培养至215小时，叶黄素产量达到最高值为128.31mg/L。因此采用215小时为收获叶黄素的最适时间。

在上述过程中采用的番茄汁提取物的制备方式为：市售纯番茄汁先置于冷冻干燥机中处理直至得到番茄细胞干粉，称取10mg的番茄汁粉，置于10mL的离心管，加约2mL的丙酮，在振荡器上至充分振荡混匀，离心，取上清液；渣经反复提取变成白色为止。合并提取液并氮气吹干，用DMSO定容至2ml，并按此方法制备番茄汁提取物50ml，番茄汁的色谱图如图3、4、5所示。小球藻番茄汁提取液的HPLC图谱见图3。从图中可以观察到两个主要峰，通过与相应标准品的HPLC保留时间和紫外-可见吸收光谱进行比较，峰1和峰2分别确定为β-胡萝卜素和番茄红素。

实施例2

(1)所采用的小球藻藻株为Chlorella protothocoides CS-41(购自CSIRO MarineLaboratory Hobart，Australia)，将活化后的小球藻异养培养5天，使其处于对数生长期；然后将小球藻种子液按10％(v/v)接种量接入含Basal培养基的发酵罐中，Basal培养基的组分mg/l为1升水中含有：KH₂PO₄ 1250，MgSO₄·7H₂O 1000，EDTA 500，H₃BO₃ 114.2，CaCl₂·2H₂O 111，FeSO₄·7H₂O 49.8，ZnSO₄·7H₂O 88.2，MnCl₂·4H₂O 14.2，MoO₃ 7.1，CuSO₄·5H₂O 15.7，(CoNO₃)₂·6H₂O 4.9；同时在Basal培养基中添加葡萄糖和尿素，葡萄糖添加量为7g/L，葡萄糖和尿素的摩尔比为10.1。在7升发酵罐中进行分批培养，培养条件为：培养基装量3.5升；接种量10％(v/v)；pH6.5±0.2；温度28±0.5℃，溶解氧20％饱和浓度；搅拌浆转速与溶氧浓度相偶联，起始转速控制在200r/m；

(2)小球藻在发酵罐中培养24h后，小球藻生长进入对数生长期后，发酵罐中的小球藻采用分段式恒速流加培养，即开始在发酵罐中流加培养基，维持发酵罐中的葡萄糖浓度在10g/L左右；流加用的培养基中葡萄糖浓度为480g/L、尿素浓度为68.57g/L，流加用的培养基中的其他组分与葡萄糖按比例提供，比例为上述分批培养时Basal培养基中的组分与所添加葡萄糖的比例(重量比)。

小球藻接种24h后小球藻生长进入对数期，葡萄糖消耗速率很快，开始进行分段式恒速流加培养，补加葡萄糖，具体分段如下：第一段(从起始点24h-72h)培养基的流加速率为2.45ml/h；到72h因耗糖速率增大，改变流加速率。第二段(72h-109h)流加速率为3.28ml/h；到109h进入对数旺盛期，耗糖速率更快，加大流加速率，第三段(72h-109h)流加速率为4.34ml/h；到168h进入对数后期，虽然耗糖速度下降，但是生物量浓度仍不断上升，降低流加速率，第四段(168h-215h)流加速率为2.18ml/h；到215h糖的消耗速率进一步降低，进入生长稳定期，因此降低流加速度。第五段(215h-240h)流加速率为1.12ml/h。

(3)在24h、72h、109h和168h时分别添加番茄汁提取物10.5ml；

(4)待培养结束后取样测定生物量浓度和叶黄素含量，生物量采用干重法测定，测得生物量浓度最高为43.6g/L；叶黄素含量通过HPLC来测定，测得叶黄素含量最高为2.53mg/g。

实施例3

(1)所采用的小球藻藻株为Chlorella protothocoides CS-41(购自CSIRO MarineLaboratory Hobart，Australia)，将活化后的小球藻异养培养5天，使其处于对数生长期；然后将小球藻种子液按10％(v/v)接种量接入含Basal培养基的发酵罐中，Basal培养基的组分mg/l为1升水中含有：KH₂PO₄ 1250，MgSO₄·7H₂O 1000，EDTA 500，H₃BO₃ 114.2，CaCl₂·2H₂O 111，FeSO₄·7H₂O 49.8，ZnSO₄·7H₂O 88.2，MnCl₂·4H₂O 14.2，MoO₃ 7.1，CuSO₄·5H₂O 15.7，(CoNO₃)₂·6H₂O 4.9；同时在Basal培养基中添加葡萄糖和尿素，葡萄糖添加量为10g/L，葡萄糖和尿素的摩尔比为8.9。在7升发酵罐中进行分批培养，培养条件为：培养基装量3.5升；接种量50％(v/v)；pH6.1±0.2；温度28±0.5℃，溶解氧50％饱和浓度；搅拌浆转速与溶氧浓度相偶联，起始转速控制在200r/m；

(2)小球藻在发酵罐中培养24h后，小球藻生长进入对数生长期后，发酵罐中的小球藻采用分段式恒速流加培养，即开始在发酵罐中流加培养基，维持发酵罐中的葡萄糖浓度在10g/L左右；流加用的培养基中葡萄糖浓度为480g/L、尿素浓度为68.57g/L，流加用的培养基中的其他组分与葡萄糖按比例提供，比例为上述分批培养时Basal培养基中的组分与所添加葡萄糖的比例(重量比)。

小球藻接种24h后小球藻生长进入对数期，葡萄糖消耗速率很快，开始进行分段式恒速流加培养，补加葡萄糖，具体分段如下：第一段(从起始点24h-72h)培养基的流加速率为3.25ml/h；到72h因耗糖速率增大，改变流加速率。第二段(72h-109h)流加速率为4.50ml/h；到109h进入对数旺盛期，耗糖速率更快，加大流加速率，第三段(72h-109h)流加速率为5.82ml/h；到168h进入对数后期，虽然耗糖速度下降，但是生物量浓度仍不断上升，降低流加速率，第四段(168h-215h)流加速率为2.75ml/h；到215h糖的消耗速率进一步降低，进入生长稳定期，因此降低流加速度。第五段(215h-240h)流加速率为1.10ml/h。

(3)在24h、72h、109h和168h时分别添加番茄汁提取物10.5ml；

(4)待培养结束后取样测定生物量浓度和叶黄素含量，生物量采用干重法测定，测得生物量浓度最高为41.2g/L；叶黄素含量通过HPLC来测定，测得叶黄素含量最高为2.45mg/g。

实施例4

(1)所采用的小球藻藻株为Chlorella protothocoides CS-41(购自CSIRO MarineLaboratory Hobart，Australia)，将活化后的小球藻异养培养3天，使其处于对数生长期；然后将小球藻种子液按10％(v/v)接种量接入含Basal培养基的发酵罐中，Basal培养基的组分mg/l为1升水中含有：KH₂PO₄ 1250，MgSO₄·7H₂O 1000，EDTA 500，H₃BO₃ 114.2，CaCl₂·2H₂O 111，FeSO₄·7H₂O 49.8，ZnSO₄·7H₂O 88.2，MnCl₂·4H₂O 14.2，MoO₃ 7.1，CuSO₄·5H₂O 15.7，(CoNO₃)₂·6H₂O 4.9；同时在Basal培养基中添加葡萄糖和尿素，葡萄糖添加量为10g/L，葡萄糖和尿素的摩尔比为8.9。在7升发酵罐中进行分批培养，培养条件为：培养基装量3.5升；接种量20％(v/v)；pH6.1±0.2；温度28±0.5℃，溶解氧50％饱和浓度；搅拌浆转速与溶氧浓度相偶联，起始转速控制在180r/m；

(2)小球藻在发酵罐中培养24h后，小球藻生长进入对数生长期后，发酵罐中的小球藻采用分段式恒速流加培养，即开始在发酵罐中流加培养基，维持发酵罐中的葡萄糖浓度在10g/L左右；流加用的培养基中葡萄糖浓度为480g/L、尿素浓度为68.57g/L，流加用的培养基中的其他组分与葡萄糖按比例提供，比例为上述分批培养时Basal培养基中的组分与所添加葡萄糖的比例(重量比)。

小球藻接种24h后小球藻生长进入对数期，葡萄糖消耗速率很快，开始进行分段式恒速流加培养，补加葡萄糖，具体分段如下：第一段(从起始点24h-48h)培养基的流加速率为3.5ml/h；到48h因耗糖速率增大，改变流加速率，第二段(72h-109h)流加速率为6.2ml/h；到72h进入对数旺盛期，耗糖速率更快，加大流加速率，第三段(72h-109h)流加速率为8.2ml/h；到109h进入对数后期，虽然耗糖速度下降，但是生物量浓度仍有微量上升，降低流加速率，第四段(168h-215h)流加速率为3.50ml/h；到168h时小球藻生物量浓度达到了最高值为40.08g/L。

(3)在24h、48h、72h和109h时分别添加番茄汁提取物10.5ml；

(4)待培养结束后取样测定生物量浓度和叶黄素含量，生物量采用干重法测定，测得生物量浓度最高为40.8g/L；叶黄素含量通过HPLC来测定，测得叶黄素含量最高为2.25mg/g。