一种生何首乌和制何首乌的质量控制方法

摘要

一种生何首乌和制何首乌的质量控制方法，该方法包括以下步骤：A.称取生何首乌或制何首乌的标准药材的粉末，溶于丙酮中，超声处理后过滤，定容，挥干后，干粉溶于甲醇，甲醇溶液微孔过滤后，得标准药材溶液。再用高效液相色谱法建立标准药材的指纹图谱；再采用同样的方法，建立待测生何首乌或制何首乌的待测指纹图谱；再根据待测指纹图谱与标准指纹图谱的相似度判定待测药材是否合格；B.采用高效液相色谱法测定2，3，4’，5－四羟基二苯乙烯－2－O－β－D－吡喃葡萄糖苷及大黄素两个指标成分的含量。该法判定依据多样，既能实现对生、制何首乌主要化学成分的定性检测，又测定两种主要成分的含量，其检测结果可靠、准确，减少了为质量达标而人为处理的可能性。

说明书

技术领域

本发明一种中药质量控制方法，尤其涉及一种生何首乌及制何首乌的质量控制方法；

背景技术

何首乌始载于《日华子本草》，为蓼科植物何首乌(Polygonum multiflorumThunb)的干燥块根，主产于河南、山东、湖北、四川、江苏、广西等地，多为野生，亦有栽培，是著名的生熟异治的中药，有生何首乌和制何首乌之分；生何首乌其性平，味甘、苦；归心、肝、大肠经；制何首乌其性微温、味甘、涩，归肝、肾经；生何首乌截疟解毒，润肠通便；制何首乌功善补益精血，固肾乌须；李时珍在《本草纲目》中记载：“凡诸名山，深山产者，即大而佳也”；目前生、制何首乌药材市场需求量与日俱增，以次充好的现象时有发生，这严重影响了生、制何首乌在海内外的声誉；

现有中药何首乌的主要质量控制方法，是采用2005年版的《中华人民共和国药典》规定的性状检查，显微鉴定，理化鉴别和一种指标成分(2，3，4’，5-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-吡喃葡萄糖苷)含量的测定。这种质量控制方法中的外观性状鉴别(包括显微鉴定)，主观因素强，检测结果不客观准确，误差大。并且何首乌的药效并不只与单一成分有关，而是由多种活性成份确定，单一的成分含量测定方法存在局限性，不能准确地反映何首乌的药效。因此，现有的中药何首乌的质量控制方法不能满足生产与利用的需要。

发明内容

本发明的目的就是提供一种生何首乌和制何首乌的质量控制方法，该方法判定依据多样，既能实现对生、制何首乌主要化学成分的定性检测，又测定两种主要成分的含量，实现对药材质量的全方位监控；其检测结果可靠、准确，减少了为质量达标而人为处理的可能性。

本发明实现其发明目的，所采用的技术方案是：一种生何首乌和制何首乌的质量控制方法，由以下步骤构成：

A、指纹图谱比较

A1、建立生何首乌或制何首乌标准指纹图谱

取生何首乌或制何首乌的标准药材的粉末0.1-0.3克，溶于8ml的丙酮中，超声处理0.5-1小时后过滤，取滤液，重复三次，合并滤液，添加丙酮，定容至25ml，得标准药材的丙酮溶液，精密量取5ml丙酮溶液，待丙酮挥干后，得干粉，取干粉溶于甲醇得甲醇溶液，甲醇溶液用孔径为0.45微米的微孔滤膜过滤后，得生何首乌或制何首乌的标准药材溶液；

吸取生何首乌或制何首乌的标准药材溶液，注入高效液相色谱仪，建立起生何首乌或制何首乌标准药材的标准指纹图谱；

A2、制作待测生何首乌或制何首乌的指纹图谱

将A1步中的标准生何首乌或制何首乌药材的粉末替换为待测的生何首乌或制何首乌药材的粉末，然后采用A1步完全相同的操作，制得生何首乌或制何首乌待测药材的指纹图谱；

A3、图谱比较

计算出A2步的指纹图谱与A1步的标准指纹图谱的相似度；若指纹图谱与标准指纹图谱相似度≥0.900，将对应的待测药材进行以下步骤的操作；否则为不合格，结束操作；

B、2，3，4’，5-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-吡喃葡萄糖苷指标成分的含量测定

B1、对照品溶液的制备

精密称取3.2-3.4mg的2，3，4’，5-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-吡喃葡萄糖苷对照品，置于10ml容量瓶中，加50％乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，配得浓度为0.32-0.34g/L的对照品溶液；

B2、待测品溶液的制备

称取生何首乌或者制何首乌粉末0.2g，置于100ml锥形瓶中，加入50％乙醇25ml，称定质量，加热回流30min，放冷，再称定质量，用50％乙醇补足减失的质量，摇匀，上清液用0.45μm微孔滤膜滤过，即得生何首乌或制何首乌的待测品溶液；

B3、待测品含量的测定

精密量取相同体积的对照品溶液和待测品溶液，采用高效液相色谱法测出待测品溶液中2，3，4’，5-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的含量，并换算出待测生何首乌或者制何首乌中的2，3，4’，5-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-吡喃葡萄糖苷成分占整个待测药材干物质的百分含量；

C、大黄素指标成分的含量测定

C1、对照品溶液的制备

精密称取大黄素2.8-3.2mg，置100ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至100ml，摇匀；

C2、待测品溶液的制备

精密称取生何首乌或者制何首乌粉末各0.15g，置100ml锥形瓶中，精密加甲醇25ml，称定质量，加热回流1h，冷却，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过；精密量取滤液5ml，置100ml锥形瓶中，挥去甲醇，加8％盐酸10ml，超声处理2min，再加氯仿10ml，加热回流1h，冷却；回流液移置分液漏斗中，用少量氯仿洗涤100ml锥形瓶，并入分液漏斗中，分取下层的氯仿液；上层的盐酸液再用氯仿提取及分取3次，每次氯仿用量8-12ml，合并氯仿液，移至100ml锥形瓶中，挥去氯仿至干；残渣加甲醇溶解，在10ml容量瓶中定容，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得待测生何首乌或者制何首乌粉末的待测品溶液；

C3、待测品含量的测定

精密量取相同体积的对照品溶液和待测品溶液，采用高效液相色谱法测出待测品溶液中大黄素的含量，并换算出待测生何首乌或者制何首乌中的大黄素成分占整个待测药材干物质的百分含量；

D、判定指标成含量

若待测的生何首乌药材中2，3，4’，5-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的百分含量≥3.00％且大黄素的百分含量≥0.050％，则判定待测的生何首乌药材合格，否则不合格：

若待测的制何首乌药材中2，3，4’，5-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-吡喃葡萄糖苷含量≥1.93％且大黄素的含量≥0.067％，则判定待测的制何首乌药材合格，否则不合格。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

一、指纹图谱比较：采用室温超声提取法，提取何首乌的有效成分，避免了何首乌的主要有效成分-二苯乙烯苷(SG)类化合物在热溶剂中的分解，并且采用丙酮为溶剂，其提取效果最好：

1、何首乌主要的活性成分二苯乙烯苷类(SG)、蒽醌类等化合物均能被有效地提取出来；

2、蛋白质、多糖等污染色谱柱的大分子杂质不进入待测品溶液，从而不对色谱柱造成污染，延长色谱柱的使用寿命。指纹图谱的各成分峰的光学纯度均高达98％以上。如生首乌的2，3，4’，5-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(THSG)主峰的纯度高达99％；而用甲醇和50％的甲醇提取时则仅为70％左右。

3、使何首乌的主要疗效成分在指纹图谱中均有对应的特征峰，而何首乌的蛋白质、多糖等非特征成分则在指纹图谱的特征峰中不出现。在标准指纹图谱中有6个峰值高的特征峰，经鉴定分别为：二苯乙烯苷、大黄素吡喃葡萄糖苷、大黄酚吡喃葡萄糖苷、大黄素甲醚吡喃葡萄糖苷、大黄素、大黄素甲醚。

因此本发明实现了对生、制何首乌六个主要化学成分的定性检测，并且使其六个主要成分，成为已知化合物；其检测结果更可靠、准确。

二、指标成分的含量测定：由于指纹图谱相似度差异的程度与药材中的化合物含量差异不成比例关系，不能体现指纹图谱的指标成分的化学性质和具体含量。而昆明种小鼠的肝脏毒性基因表达谱、药效改变与化学成分的变化关系实验所获得的结果表明，2，3，4’，5-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-吡喃葡萄糖苷和大黄素这两种物质是确定生、制何首乌药效和毒性的根本原因。

因此，本发明在进行指纹图谱对药材进行定性检测的基础上，还对两种最主要的指标成分2，3，4’，5-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-吡喃葡萄糖苷和大黄素的含量进行测定，确保其含量符合要求。从而本发明的质量控制方法，既重视指纹图谱在整体轮廓上的相似性，又能体现指标成分的具体含量，克服了指纹图谱的局限性，增加了对何首乌中药质量的控制途径和手段，降低了为质量达标而人为处理的可能性，使本发明的质量控制方法的中药信息表达能力强，对何首乌的质量控制更加有效、稳定和可控。

上述生何首乌标准药材为直接采自四川峨眉山的川产生何首乌；制何首乌标准药材为川产生何首乌采用清蒸法或黑豆制法炮制而得。

这样可使制得的标准指纹图谱的峰值高，具有很好的代表性；且测试出的指标成分的含量高；从而建立起高质量的何首乌指纹图谱，确定较高的指标成分含量，从而提高中药何首乌的质量。

上述的A1和A2步中用高效液相色谱仪对标准药材溶液以及待测药材溶液进行测试时，均选用290nm波长作为高效液相色谱仪的指纹图谱的检测波长。

290nm波长作为高效液相色谱仪的指纹图谱的检测波长，可以充分发挥高效液相色谱仪的功能。在290nm处较小的色谱峰有强的吸收，能充分体现生、制首乌中的主要指标的化合物。即二苯乙烯苷类、蒽醌类化合物化合物均以290nm为最大吸收波长，从而在290nm波长下，各色谱峰分离良好，主要成分达到了基线分离；响应高，形成的指纹图谱效果好。

通过比较各定量成分在210nm-500nm范围内的色谱图及UV扫描最大吸收波长，发现320nm是二苯乙烯苷类化合物的最大吸收波长，290nm是蒽醌类化合物的最大吸收波长。由于二本乙烯苷类含量较高，且在320nm与290nm吸收无明显差异，因此选择290nm能体现生、制首乌的主要成分，而且主要成分基线分离。据上，似应选择290nm。为进一步细化上述结果，我们按前述色谱条件分别考察了200nm、254nm、268nm、296nm、320nm、290nm六个检测波长下的分离谱图，发现：在290nm波长下，各色谱峰分离良好，主要成分达到了基线分离；在此波长下响应亦较高。根据以上的实验结果，最终选定290nm作为指纹图谱的检测波长。

下面结合附图和具体的实施方式，对本发明作进一步详细的说明；

附图说明

图1为本发明实施例一的生何首乌的标准指纹图谱。

图2为本发明实施例一的待测的生何首乌的指纹图。

图3为本发明实施例二的制何首乌的标准指纹图谱。

图4为本发明实施例二的待测制何首乌的指纹图谱。

各图中，横轴为时间，单位为分钟(minutes)；纵轴为吸收度，单位为：毫吸收单位(mAU)。图1、3中特征峰旁边的数字，是该特征峰的编号。

具体实施方式

实施例一

本发明的一种具体实施方式为：一种生何首乌和制何首乌的质量控制方法，由以下步骤构成：

A、指纹图谱比较

A1、建立生何首乌的标准指纹图谱

本例中的生何首乌标准药材为直接采自四川峨眉山的川产生何首乌。

取生何首乌的标准药材的粉末0.2克，溶于8ml的丙酮中，超声处理0.5小时后过滤，取滤液，重复三次(含本次)，合并滤液，添加丙酮，定容至25ml，得标准药材的丙酮溶液，精密量取5ml丙酮溶液，待丙酮挥干后，得干粉，取干粉溶于2ml甲醇得甲醇溶液，甲醇溶液用孔径为0.45微米的微孔滤膜过滤后，得生何首乌的标准药材溶液；吸取生何首乌的标准药材溶液，注入高效液相色谱仪，建立起60分钟的生何首乌标准药材的标准指纹图谱。图1即为本例方法制得的生首乌的标准指纹图谱。

A2、制作待测生何首乌的指纹图谱

本例的待测生首乌购于广东德庆。

将A1步中的标准生何首乌药材的粉末替换为待测的生何首乌药材的粉末，然后采用A1步完全相同的操作，制得生何首乌待测药材的指纹图谱；图3是本例测得的购于广东德庆的待测药材的指纹图谱。

A3、图谱比较

计算出A2步的待测指纹图谱与A1步的标准指纹图谱的相似度；若待测指纹图谱与标准指纹图谱相似度≥0.900，将对应的待测药材进行以下步骤的操作；否则为不合格，结束操作。本例中计算相似度时，直接采用中国国家药监局指定的“中药色谱图分析和数据处理系统”软件进行计算。

本例中，将图1所示的标准指纹图谱与图2所示的待测指纹图谱的相似度经计算为0.988，大于规定值0.900。判定该待测药材为初步合格产品，再进行以下步骤的测试。

在本例的指纹图谱检测中，色谱柱为，hypersilC18(5μm，4.6mm×250mm)；检测波长，290nm；流动相流速，1mL/min，流动相由乙腈和水组成；进样量为10μL；梯度洗脱；流动相的组成与梯度设置如下表：

  时间(分)  乙腈  (重量百分比)  水  (重量百分比)  0  10  90  35  40  60  55  100  0  60  100  0

图1的用本例方法制作的生首乌的标准指纹图谱中有6个峰值高的特征峰。经鉴定：4号峰为二苯乙烯苷、5号峰为大黄素吡喃葡萄糖苷、6号峰为大黄酚吡喃葡萄糖苷、7号峰为大黄素甲醚吡喃葡萄糖苷、10号峰为大黄素、11号峰为大黄素甲醚。这些峰中，4号峰二苯乙烯苷和10号峰大黄素既是产生活性的主要成分，也是产生药性和毒性的主要成分，6个表征何首乌药材的主要成分特征峰，成为已知化合物。

B、2，3，4’，5-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-吡喃葡萄糖苷指标成分的含量测定

B1、对照品溶液的制备

精密称取3.3mg的2，3，4’，5-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-吡喃葡萄糖苷对照品，置于10ml容量瓶中，加50％乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，配得浓度为0.33g/L的对照品溶液；

B2、待测品溶液的制备

称取广东德庆的生何首乌粉末0.2g，置于100ml锥形瓶中，加入50％乙醇25ml，称定质量，加热回流30min，放冷，再称定质量，用50％乙醇补足减失的质量，摇匀，上清液用微孔滤膜(0.45μm)滤过，即得生何首乌的待测品溶液；

B3、待测品含量的测定

精密量取相同体积的对照品溶液和待测品溶液，采用高效液相色谱法测出待测品溶液中2，3，4’，5-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的含量，并换算出待测生何首乌中的2，3，4’，5-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-吡喃葡萄糖苷成分占整个待测药材干物质的百分含量；具体换算关系为：0.2g生何首乌粉末中2，3，4’，5-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(THSG)的含量(b)＝(待测品溶液的液相色谱峰高度/对照品溶液的液相色谱峰高度)×步骤B中THSG的称取量×2.5；待测药材中THSG的重量百分含量为：b×1000/0.2×100％。

C、大黄素指标成分的含量测定

C1、对照品溶液的制备

精密称取大黄素3.0mg，置100ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至100ml，摇匀；

C2、待测品溶液的制备

精密称取产于广东德庆的待测生何首乌粉末0.15g，置100ml锥形瓶中，精密加甲醇25ml，称定质量，加热回流1h，冷却，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过；精密量取滤液5ml，置100ml锥形瓶中，挥去甲醇，加8％盐酸10ml，超声处理2min，再加氯仿10ml，加热回流1h，冷却；回流液移置分液漏斗中，用少量氯仿洗涤100ml锥形瓶，并入分液漏斗中，分取下层的氯仿液；上层的盐酸液再用氯仿提取及分取3次，每次氯仿用量8-12ml，合并氯仿液，移至100ml锥形瓶中，挥去氯仿至干；残渣加甲醇溶解，在10ml容量瓶中定容，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得生何首乌粉末的供试品溶液；

C3、待测品含量的测定

精密量取相同体积的对照品溶液和待测品溶液，采用高效液相色谱法测出待测品溶液中大黄素的含量，并换算出待测生何首乌中的大黄素成分占整个待测药材干物质的百分含量；具体换算关系为：0.15g生何首乌粉末中大黄素的含量(c)＝(待测品溶液的液相色谱峰高度/对照品溶液的液相色谱峰高度)/步骤C中大黄素的称取量×10；待测药材中大黄素的重量百分含量为：c×1000/0.15×100％。

D、判定指标成分含量

若待测的生何首乌药材中2，3，4’，5-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的百分含量≥3.00％且大黄素的百分含量≥0.050％，则判定待测的生何首乌药材合格，否则不合格。

本例中进行指标成分含量测定时的色谱条件为：色谱柱：Hypersil C18柱(4.6mm×200mm，5μm)；检测波长254nm；流速0.8ml/min；柱温：30℃；流动相为甲醇和0.1％磷酸，二者的质量比为85∶15；理论塔板数按大黄素峰计算不低于6000。

用以上本例方法对上述购于广东德庆的待测药材进行的两种指标成分2，3，4’，5-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(THSG)和大黄素指标成分含量检测结果如下表：

  药材名称  THSG(重量百分比％)  大黄素(重量百分比％)  生何首乌  5.512  0.094

与判定指标成含量的标准相比，要求待测的生何首乌药材中2，3，4’，5-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的百分含量≥3.00％且大黄素的百分含量≥0.050％。因此，采用本例方法对购于广东德庆的生首乌药材的检测结果为合格。

本发明在具体实施时，高效液相色谱仪可选用岛津LC-10A高效液相色谱仪。

实施例二

本例与实施例一基本相同，不同的仅仅是：将生首乌的标准药材替换为制何首乌的标准药材，待测的生何首乌药材替换为待测的制何首乌药材。其中的制何首乌标准药材采用四川峨眉山的川产生何首乌用清蒸法或黑豆制法进行炮制而得；本例中实测的一具体待测药材为购买于广东德庆的制何首乌药材。

图3为用本例方法测得的制何首乌的标准指纹图谱。图3可见，制何首乌的标准指纹图谱中有6个峰值高的特征峰，经鉴定：4号峰为二苯乙烯苷、5号峰为大黄素吡喃葡萄糖苷、6号峰为大黄酚吡喃葡萄糖苷、7号峰为大黄素甲醚吡喃葡萄糖苷、10号峰为大黄素、11号峰为大黄素甲醚。这些峰中，4号峰二苯乙烯苷和10号峰大黄素既是产生活性的主要成分，也是产生产生药性和毒性的主要成分，6个表征何首乌药材的主要成分特征峰，成为已知化合物。

图4是本法测得的制何首乌待测药材指纹图谱。采用中国国家药监局指定的“中药色谱图分析和数据处理系统”软件进行相似度计算，相似度为0.965，待测指纹图谱与标准指纹图谱相似度≥0.900。

采用本例方法测出的购于广东德庆的一具体待测制首乌的两种指标成分2，3，4’，5-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(THSG)和大黄素的含量如下表所示：

  药材名称  THSG(重量百分比％)  大黄素(重量百分比％)  清蒸制何首乌  3.811  0.119  豆制何首乌  3.538  0.126

与判定指标成含量的标准相比，该待测的制何首乌药材中2，3，4’，5-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的百分含量≥1.93％且大黄素的百分含量≥0.067％。由上表可见，本例所具体测试的待测制何首乌药材为合格产品。

实施例三

本例与实施例一基本相同，不同的仅仅是：在步骤A的指纹图谱比较中，称取的生何首乌的标准药材的粉末为0.1克，每次超声处理的时间为1小时；步骤B中精密称取的2，3，4’，5-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-吡喃葡萄糖苷对照品为3.2mg，步骤C中精密称取的大黄素为2.8mg。

实施例四

本例与实施例一基本相同，不同的仅仅是：在步骤A的指纹图谱比较中，称取的生何首乌的标准药材的粉末为0.3克，每次超声处理的时间为0.75小时；步骤B中精密称取的2，3，4’，5-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-吡喃葡萄糖苷对照品为3.4mg，步骤C中精密称取的大黄素为3.2mg。

实施例五

本例与实施例二基本相同，不同的仅仅是：在步骤A的指纹图谱比较中，称取的制何首乌的标准药材的粉末为0.1克，每次超声处理的时间为1小时；步骤B中精密称取的2，3，4’，5-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-吡喃葡萄糖苷对照品为3.2mg，步骤C中精密称取的大黄素为3.2mg。

实施例六

本例与实施例二基本相同，不同的仅仅是：在步骤A的指纹图谱比较中，称取的制何首乌的标准药材的粉末为0.3克，每次超声处理的时间为0.75小时；步骤B中精密称取的2，3，4’，5-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-吡喃葡萄糖苷对照品为3.4mg，步骤C中精密称取的大黄素为2.8mg。