黄酮和异黄酮衍生物作为抗生物污损物质的应用以及防止海洋生物污损的方法和涂料

摘要

本发明涉及黄酮和异黄酮衍生物作为抗生物污损物质的应用以及防止海洋生物污损的方法和涂料。具体地说，本发明涉及用海洋微生物生产4’，5，7－三羟基异黄酮的方法，还涉及利用4’，5，7－三羟基异黄酮、4’，5－二羟基－3，6，7，8－四甲氧基黄酮、3’，5－二羟基－3，4’，6，7－四甲氧基黄酮、4’，5－二羟基－3，6，7－三甲氧基黄酮、4’，5，7－三羟基黄酮、3’，4’，5，7－四羟基黄酮和5－羟基黄酮用于防止水下结构表面的生物污损。

说明书

技术领域

本发明涉及使用海洋微生物发酵生产作为抗生物污损物质的4’，5，7三羟基异黄酮，并涉及黄酮或异黄酮衍生物的抗生物污损方面的用途。本发明所涉及生产抗生物污损化合物微生物为杀真菌链霉菌(Streptomyces fungicidicus)。

背景技术

在海水浸泡中的无特殊保护的船底、码头、浮标和各类水下人工设施上常常会发现大量的海洋生物聚集，这种现象被称为海洋生物污损，这些栖息或附着于该表面的生物被称为海洋污损生物。全世界有记录的污损生物多达4000余种，主要包括一些大型藻类、双壳类软体动物及藤壶。大多数污损生物的幼虫是浮游生活，成体是附着或固着生活的。海洋生物污损会增加船舶的阻力，改变浮标的重量，增大近海建筑物(如石油平台)的静力载荷和动力载荷，堵塞海中的管道设施，影响养殖网箱的水交换，并与养殖贝类争夺附着基和饵料，影响养殖品种的生长发育，加速金属的腐蚀过程，导致海中仪表及转动部件失灵，还会对声学仪器产生不良影响。

全世界每年因生物污损所造成的损失极其巨大。以船舶为例，海洋生物污损会提高船舶航行阻力、降低航行速度而延长相同航线的货物中转周期；缩短船舶维修周期、提高船底除污费用、延长船舶占坞时间以及缩短有效航行时间；提高燃料消耗以及对应的污染排放；降低船舶有效载重；加速船体腐蚀、缩短船舶使用寿命等等。

因此，寻找一个经济有效的防污措施显得尤为重要。为了防止海洋生物的附着，17世纪之前，铅是最常用的防污材料，随后铜取而代，到目前为止，全世界应用最为广泛的、使用最有效的海洋防污产品是有机锡化合物涂料，其中以三丁基锡(TBT)为代表。它自20世纪60年代投入市场以来，因良好的防污效果而倍受市场的青睐。自20世纪中期以来，仅美国海军就因使用TBT而每年节约1.5亿美元以上。

但有机锡在发挥良好防污效果的同时，也带来了严重的环境问题。它不仅对目标生物有极大的毒性，对海洋环境中的非目标生物也产生了不良的影响，从而对水产养殖、捕捞以及人类的健康都构成了巨大威胁。有关研究表明，海水中有机锡的存在会干扰牡蛎的钙代谢，使其贝壳畸形加厚，含肉量下降，降低或丧失牡蛎的市场价值；引起海产腹足类的性畸变，即雌性个体产生雄性个体的特征，甚至导致雌性个体生殖失败；还会影响到鱼类血液内氧气的运输，使其处于缺氧状态，阻碍鱼类的生长。此外，有机锡毒物可以通过蓄积在鱼类、贝类、海洋鸟类、海洋哺乳动物体内，进而进入人类的食物链，对人体性激素分泌及淋巴细胞产生不利影响。今天，在世界各地主要航线及港口的海水、底泥和生物体中都发现了高浓度的TBT，并已造成水产减产，部分物种绝迹、不育和性畸变等现象。有机锡化合物属于内分泌搅乱物质，其高毒性在于它在海洋环境中的富集作用。研究表明，TBT在水中与悬浮颗粒结合，很难降解。TBT也是被认为是迄今为止引入海洋环境中毒性和危害最大的化学物质之一。

自法国1982年第一个限制TBT使用后，北美、欧洲等国家都制定了相应的法规，限制TBT在海洋中的使用。2001年，国际海事组织(IMO)通过决议，要求从2003年1月1日起在全球范围内禁止在船舶上涂用含有TBT等有机锡类化合物的油漆；从2008年1月1日起，所有运营船舶均不得再涂有此类油漆。而替代TBT的化学产品如Diuron和Irgarol1051等也显示出应用的局限性和对牡蛎、藻类及各种水生生物的毒害作用。于是，开展借助化学生态学实现污损生物防治的研究成为一个重要的课题，迫切需要寻找新的对环境无害的高活性抗生物污损化合物。

海洋微生物是可持续性利用的生物资源，为解决目前存在的问题提供了新的途径。另外，由于发酵过程中人力消耗少，应用微生物发酵更为经济。从海洋微生物分离鉴定出抗生物污损活性化合物，也将来可能通过更经济的工业规模的化学合成。另外，从这些被证明的活性化合物出发，推导、和筛选更高活性的分子结构，以获得更经济的高活性抗生物污损化合物。最为重要的是，本发明所涉及的化合物都是无毒化合物，不含有毒重金属，且均为天然化合物，在海洋环境中可以迅速降解。本发明所提供的无毒化合物有抑制幼虫附着活性，因此具有显著的抗生物污损活性。

发明内容

本发明涉及从海洋微生物代谢物中分离鉴定出一种无毒且具有显著抗污损活性的化合物：

化合物1

4’，5，7-三羟基异黄酮(染料木素，genistein)

此化合物也可以通过其他一些技术或途径制备，获得满意的抗污损活性。

本发明涉及通过筛选上述化合物的结构类似物，从植物天然产物中筛选出6个无毒且具有抗污损活性的化合物。

化合物2：

4’，5-二羟基-3，6，7，8-四甲氧基黄酮(calycopterin)

化合物3

3’，5-二羟基-3，4’，6，8-四甲氧基黄酮(紫花牡荆素，casticin)

化合物4

4’，5-二羟基-3，6，7-三甲氧基黄酮

化合物5

4’，5，7-三羟基黄酮(芹菜素，apigenin)

化合物6

3’，4’，6，7-四羟基黄酮(木犀草素，luteolin)

化合物7

5-羟基黄酮(报春花素，primuletin)

本发明涉及的黄酮和异黄酮衍生物在化学结构上具有两个重要特征：均含有5-OH，且C3上没有OH和大体积基团(如单糖或双糖)。本发明要求保护有以上特征的黄酮和异黄酮衍生物作为抗生物污损化合物。

本发明提供的抗生物污损物质，是通过生物测试指导的化学分离方法，从海洋微生物二级代谢物中分离鉴定出来的，或者是利用构效关系分析结果从其它来源的化合物中筛选而来，实验证明本发明所涉及的化合物是天然无毒的抗生物污损化合物。利用所述无毒化合物所制成的抗生物污损涂料对环境是无害的。

具体地说，本发明涉及一种防止海洋生物污损的方法，其包括添加黄酮衍生物或异黄酮衍生物。优选地，所述黄酮衍生物或异黄酮衍生物是4’，5，7-三羟基异黄酮和/或其衍生物。更优选地，所述4’，5，7-三羟基异黄酮的衍生物选自4’，5-二羟基-3，6，7，8-四甲氧基黄酮、3’，5-二羟基-3，4’，6，7-四甲氧基黄酮、4’，5-二羟基-3，6，7-三甲氧基黄酮、4’，5，7-三羟基黄酮、3’，4’，5，7-四羟基黄酮和5-羟基黄酮。所述黄酮衍生物或异黄酮衍生物优选抑制幼虫附着。

本发明还涉及黄酮衍生物或异黄酮衍生物在制备用于防止海洋生物污损的涂料中的用途。优选地，其中所述黄酮衍生物或异黄酮衍生物是4’，5，7-三羟基异黄酮和/或其衍生物。更优选地，其中所述4’，5，7-三羟基异黄酮的衍生物选自4’，5-二羟基-3，6，7，8-四甲氧基黄酮、3’，5-二羟基-3，4’，6，7-四甲氧基黄酮、4’，5-二羟基-3，6，7-三甲氧基黄酮、4’，5，7-三羟基黄酮、3’，4’，5，7-四羟基黄酮和5-羟基黄酮。所述涂料优选抑制幼虫附着。

本发明还制备4’，5，7-三羟基异黄酮的方法，所述方法包括发酵杀真菌链霉菌(Streptomyces fungicidicus)。

本发明进一步涉及防止海洋生物污损的涂料，其包含黄酮衍生物或异黄酮衍生物。优选地，所述黄酮衍生物或异黄酮衍生物是4’，5，7-三羟基异黄酮和/或其衍生物。更优选地，所述4’，5，7-三羟基异黄酮的衍生物选自4’，5-二羟基-3，6，7，8-四甲氧基黄酮、3’，5-二羟基-3，4’，6，7-四甲氧基黄酮、4’，5-二羟基-3，6，7-三甲氧基黄酮、4’，5，7-三羟基黄酮、3’，4’，5，7-四羟基黄酮和5-羟基黄酮。所述涂料优选是一种油漆。

附图说明

图1：杀真菌链霉菌发酵液中抗生物污损活性物质4’，5，7-三羟基异黄酮(染料木素)活性追踪分离流程图

图2：化合物4’，5，7-三羟基异黄酮(染料木素)对纹藤壶(Balanusamphitrite)幼虫附着的抑制作用。图中所示为至少3个重复样平均值和标准方差。

图3：化合物4’，5，7-三羟基异黄酮(染料木素)在不同水溶液中的通过水解反应而降解。图中空白柱为起始浓度，灰色柱为在50℃无菌溶液中密封存放4天后的浓度，黑色柱为存放7天后的浓度。测试溶液包括pH5，7，9的20mM的醋酸缓冲液、人工海水(ASW)和过滤天然海水(FSW，0.45μm)。所示数据为至少3个重复样平均值和标准方差。

图4：4’，5，7-三羟基异黄酮(染料木素)及其16种的结构类似物的分子结构。其中结构式上方文字注释以F-1为例：a为样品标号；b为化合物来源；c为化合物俗名。

图5：浓度为50μg ml^-1的化合物4’，5，7-三羟基异黄酮(染料木素)及其16种的结构类似物对纹藤壶幼虫附着的抑制作用。图中所示为至少3个重复样平均值和标准方差。所用统计分析方法为Student′s paired t-test(n＝3)，差异显著水平：*＝p＜0.05，**＝p＜0.01。

具体实施方式

A.本发明涉及的制备抗生物污损活性化合物的菌株

杀真菌链霉菌菌株是从西太平洋(N10°50′35″；W154°05′28″)5000m深处的沉积物样品中分离到的。保存在0℃的样品运输到实验室后，在处理之前于4℃保存。

杀真菌链霉菌菌株采用连续稀释法分离获得。将约1g深海沉积物重悬在10ml人工海水中，混合均匀，取200μg将其涂布在2216E培养基上；于10℃恒温培养箱下培养至菌落可见，挑取形态颜色不同的菌落转移到新的2216E平板，继续纯化分离。获得单一菌株后，采用分子生物学方法鉴定该株细菌。16S rRNA基因通过引物8F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)，26F(5′-AGAGTTTGATC CTGGCTCA-3′)，355F(5′-A CTCCTACGGGAGGCAGC-3′)和反相引物1055R(5′-CACGAGCTGACGACAGCCAT-3′)，1492R(5′-GGYTACCTTGTTACGACTT-3′)和1525R(5′-AAGGAGGTGWTCCARCC-3′)(SEQ ID NO：2-7)。最后用BLAST程序(NationalCenter for Biotechnology Information(NCBI，www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/))进行序列比对。

测得的杀真菌链霉菌菌株的16S rRNA序列代码为SEQ ID No：1。通过该16S rRNA序列与GenBank对比，结果表明该菌株为杀真菌链霉菌YH04菌株(GenBank Accession no.AY636155)，相似度为99％。

B.从海洋微生物分离鉴定抗生物污损活性化合物

杀真菌链霉菌(放线细菌)接种于3L锥形培养瓶中。培养基组成为：麦芽提取物20g，酵母提取物8g，葡萄糖8g，过滤海水1.5L。在灭菌前将培养基的pH调到7.8。室温下，置于转速110rpm的摇床上培养10天。获得大约60L细菌发酵液，通过离心分离细菌体和发酵液。细菌体和发酵液用乙酸乙酯萃分别取三次，然后合并萃取液并减压浓缩，得到8g黑褐色的油。测定粗提物的抗生物污损活性，并按照图1的流程分离鉴定获得活性单体化合物。

本发明的化合物的化学结构用核磁共振(¹H NMR，¹³C NMR，DEPT和COSY)确定，并用电喷雾离子化质谱(Waters Micromass ZQESI-MS，以下同)采用负离子模式测定分子量。质谱条件：探针电压：2.5kV；锥孔电压：18V；碎片电压：2V；探针温度：100℃；干燥气N₂温度为300℃；干燥气流速：200立升/小时。将4’，5，7-三羟基异黄酮(染料木素)溶于MeOH-H₂O-甲酸(90∶9.5∶0.5)，用Hamilton 250μm进样器以5微升/分钟导入质谱。化合物的核磁共振氢谱、核磁共振碳谱和质谱数据：

ESI-MS[M-H]^-m/z 269.¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)，δ8.33(1H，s，H-2)，6.38(1H，d，J＝2.0，H-8)，6.85(1H，d，J＝8.6，H-3’，H-5’)，12.98(brs，5-OH).

¹³C NMR(100MHz，DMSO)δ153.6(d，C-2)，122.1(s，C-3)，179.9(s，C-4)，161.8(d，C-5)，99.2(d，C-6)，165.1(s，C-7)，93.8(d，C-8)，157.3(s，C-9)，104.1(s，C-10，121(s，C-1’)，130.1(d，C-2’，C-6’)，115.0(d，C-3’，C-5’)，157.5(s，C-4’)。

根据以上数据，经分析得到该化合物为4’，5，7-三羟基异黄酮(染料木素)。

C.测定化合物的抗幼虫附着活性

采用24孔聚苯乙烯板测定该化合物的抗幼虫附着活性。纹藤壶成虫(Darwin)采自香港(22°19’N，114°16’E)潮间带。以角毛硅藻(Chaetoceros gracilis Schutt)为食物，在0.22-μm过滤海水中将藤壶的无节幼体培养到金星幼体阶段，每毫升2个幼虫，培养温度28℃。用产生的金星阶段幼体进行活性试验。纯化合物溶于二甲亚砜DMSO，然后用无菌过滤海水稀释成不同的浓度。每个孔中加入1ml测试液和15±2个成熟的纹藤壶幼虫，每个浓度5个重复样，无菌过滤海水做空白对照。将24孔细胞培养板置于30℃培养箱中24小时。在解剖镜下统计附着的幼虫数。用SPSS Version 11数据统计软件进行统计分析。

结果如图2所示，表明本发明的化合物在0.5μg/ml已显示抗幼虫附着活性。在浓度为8μg/ml时，幼虫附着率只有大约10％，空白对照的幼虫附着率为大约90％，明显地抑制了藤壶幼虫的附着。按Rittschof等(1994)的方法分析抗幼虫附着活性。半数抑制有效浓度(EC₅₀)为3.0μg/ml，半数致死浓度(LC₅₀)大于50μg/ml。化合物的毒效比LC₅₀/EC₅₀大于16.7，表明该化合物为无毒。有毒化合物如重金属的毒效比接近1(Rittschof等，1992)，而无毒抗生物污损化合物的毒效比为10以上(Avelin等，1993)。

D.测定化合物的可水解性

按照ASTM 1993的方法测定化合物的可水解性能。将化合物先溶解在DMSO溶液中成1000μg ml^-1溶液，然后加入到5种不同溶液中，最终每种溶液体积均为900ml，浓度均约为4μg ml^-1。这五种溶液包括pH为5、7、9的20mM的醋酸-醋酸钠缓冲液、人工海水(ASW，van’t Hoff配方，460mM NaCl，10.1mM KCl，9.2mM CaCl₂，35.9mMMgCl₂，17.5mM MgSO₄，10mM Tris-HCl，pH 8.2)、过滤天然海水(FSW，0.45μm，pH为7.8)。每种溶液被平分到9只带盖试管。其中3支试管在配制完成后马上测定化合物浓度，其余6支放入50黑暗保温箱存储。在第四日和第七日分别测定剩余化合物浓度。化合物浓度测定方法如下：

100ml溶液通过预先以甲醇-水活化后的Sep-Pak tC18 ENVcolumn(Waters，USA)，以2.5ml DMSO洗脱(即40倍浓缩)，洗脱液用HPLC(The HPLC系统：600，Waters，USA；光电二极管阵列检测器：996，Waters，USA；柱：Phenomenex Luna 5λ C18 100A，250×4.60mm，5微米；自动上样器：717plus，Waters，USA)；溶剂：(A)5％ 乙腈，以及(B)95％乙腈；流速：固定流速为(A)0.53ml min^-1和(B)0.47ml min^-1)测定260nm吸收峰面积。然后将测得峰面积代入标准曲线回归方程计算溶液中的化合物浓度，结果如图3所示。

化合物在不同水溶液中均有显著降解，浓度在4天后已经有明显下降，7天后下降幅度均达25％以上，表明本发明的化合物在水环境中是可水解化合物。在正常海水pH范围内(7-9)，本发明的化合物仅通过水解反应降解，已经能达到可观降解速度。表明本发明的化合物不会在海洋环境中富集。

E.将本发明的化合物掺入油漆并进行实地测试

将本发明的化合物按照10和20％(干重)的比例加入已添有15％(体积比)二甲苯的树脂油漆(Permoglaze，Akzo Nobel DecorativeCoatings，Lancashire，UK)，密封研磨8小时以上后涂到PVC板上(10cm×10cm×0.5cm).在使用Cu₂O为参照添加物时，Cu₂O的添加比例也为10％干重。覆盖有完全干燥的涂层厚度为100-150μm油漆的PVC板绑到PVC材质的框架，此框架被放置到离水表面1-1.5m深的香港科技大学码头的天然海水中。在不同浸泡时间后，取出该试板，在解剖镜下观察附着生长的藤壶数量，并根据油漆面积，计算藤壶附着密度。结果如表1所示。

表1：含有化合物4’，5，7-三羟基异黄酮(染料木素)的油漆对纹藤壶附着生长的抑制作用。表中样品油漆中的化合物含量＝100％×(化合物质量/油漆总干重)，对照油漆中不含化合物。表中数据为附着生长在油漆表面的成体藤壶的密度(单位：个/cm²)，为至少4个重复样平均值和标准方差。所用统计分析方法为Student′s paired t-test(n＝4)，差异显著水平：*＝p＜0.05，**＝p＜0.01。

表1结果表明，和对照相比，藤壶附着密度在含有本发明的化合物的表面显著性地低于对照(*，Student′s paired t-test：p＜0.05)，表明本发明的化合物能有效减少藤壶在油漆表面的污损。在三个月的测试中，现在普遍使用的Cu₂O和本发明的化合物获得相近的抗污损效果，而它们混合物的抗污损效果显著地高于任一单一化合物(**，Student′spaired t-test：p＜0.01)，表明本发明的化合物有和其它抗污损物质混合使用的兼容性。

F.活性化合物的结构类似物活性筛选：

选择了其它来源的本发明涉及的化合物以及本发明涉及的化合物的结构类似物17种(如图4)，进行抗污损活性测试。采用24孔聚苯乙烯板测定50μg ml^-1的此17种化合物的抗幼虫附着活性。纹藤壶成虫(Darwin)采自香港(22°19’N，114°16’E)潮间带。以角毛硅藻(Chaetoceros gracilis Schutt)为食物，在0.22μm过滤海水中将藤壶的无节幼体培养到金星幼体阶段，每毫升2个幼虫，培养温度28℃。用产生的金星阶段幼体进行活性试验。纯化合物溶于二甲亚砜DMSO，然后用无菌过滤海水稀释成不同的浓度。每个孔中加入1ml测试液和10±2个成熟的纹藤壶幼虫，每个浓度5个重复样，无菌过滤海水做空白对照。将24孔细胞培养板置于30℃培养箱中24小时。在解剖镜下统计附着的幼虫数。用SPSS Version 11数据统计软件进行统计分析。结果如图5所示。

结果表明上述浓度下，17种化合物中12种化合物有显著抑制幼虫附着的能力(**，Student′s paired t-test：p＜0.01)。

按Rittschof等(1994)的方法，使用从50μg ml^-1逐减的浓度梯度，进一步测定上述12种有活性化合物的抗幼虫附着活性。结果如表2所示。

表2：4’，5，7-三羟基异黄酮(染料木素)及其结构类似物的半数有效浓度和毒效比。经图5中的筛选结果，未列入本表的其它5种结构类似物的的EC₅₀大于50μg ml^-1，其毒效比不可计算。图中所示为至少3个重复样平均值和标准方差。

结果表明，来源于染料木(Genista tinctoria)的化合物4’，5，7-三羟基异黄酮的半数抑制有效浓度(EC₅₀)也是3.0μg/ml，毒效比LC₅₀/EC₅₀也大于16.7，根据Avelin等，1993指出，无毒抗生物污损化合物的毒效比为10以上，表明该化合物的无毒性和抗污损活性与来源于海洋微生物杀真菌链霉菌相同。

另外此12中结构类似物中，六个化合物获得的抗污损活性和无毒性与本发明的化合物相近，均为无毒的抗污损活性化合物。它们是4’，5-二羟基-3，6，7，8-四甲氧基黄酮(F-1，calycopterin)、3’，5-二羟基-3，4’，6，7-四甲氧基黄酮(F-3，紫花牡荆素)、4’，5-二羟基-3，6，7-三甲氧基黄酮(F-4)、4’，5，7-三羟基黄酮(F-9，芹菜素)、3’，4’，5，7-四羟基黄酮(F-10，木犀草素)和5-羟基黄酮(F-17，报春花素)。

本发明中所述“有活性的染料木素结构类似物”是指但不限于4’，5-二羟基-3，6，7，8-四甲氧黄酮(calycopterin)、3’，5-二羟基-3，4’，6，7-四甲氧基黄酮(紫花牡荆素)、4’，5-二羟基-3，6，7-三甲氧基黄酮、4’，5，7-三羟基黄酮(芹菜素)、3’，4’，5，7-四羟基黄酮(木犀草素)和5-羟基酮(报春花素)。

G.活性衍生物的制备

本发明涉及的7个抗生物污损活性化合物都对动物无毒，可作为对环境无害的抗污损活性物质的范例，以天然化合物为前体，经化学修饰可以提高活性，降低成本以及其他优点。所可能的化学修饰包括增加和减少相应的功能团或基团。但本发明所提供的黄酮或异黄酮衍生物具有以下3个特征：1)均含有5-OH；2)均无3-OH；3)在C-3上均无较大基团(如单糖和双糖)。所以，本发明要求保护具有以上3个特征的黄酮或异黄酮衍生物的抗生物污损的功能。

另外，上述本发明涉及的化合物可以制备成各种旋光异构体、对映异构体或非对映异构体等形式，也可合成一些衍生物如药物前体和生物等排体。药物前体即化合物的无活性形式，即无活性化合物在体内代谢过程中，从母体分子消去一个或几个保护基团而转化为活性化合物。生物等排性是化合物的一个原子或一组原子可以用类似的一个或一组原子替代，而活性不改变。生物等排体是合成具有与母体化合物生物活性性质相同的新化合物。立体化学或拓扑结构不同也可产生生物等排体。本发明的技术权利范围还包括制备药物前体、生物等排体或化合物的各种异构体。因此本发明还包括上述化合物的所有各异构形式和衍生物。

本发明涉及的术语“功能衍生物”为上述化合物的药物前体、生物等排体、以及各种异构体，与母体化合物相比在某些方面有优势。可以通过各种高通量化学合成方法如通过组合化学制备功能衍生物，与高效生物活性筛选技术结合，扩大抗生物污损活性化合物库。

本发明制备抗污涂料首选活性成分嵌入基质的方法，但是本发明并不局限于上述实例描述的嵌入方法，其他掺入基质的方法也属本发明的权利要求范围。

序列表

<110>香港科技大学

<120>黄酮和异黄酮衍生物的制备方法及其用途

<210>1

<211>1425

<212>DNA

<213>杀真菌链霉菌(16S rRNA序列)

<400>1

GTCGAACGATGAACCGCTTTCGGGCGGGGATTAGTGGCGAACG

GGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTGCACTCTGGGACAAG

CCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATATGACCGTCTGCCGCAT

GGTGGATGGTGTAAAGCTCCGGCGGTGCAGGATGAGCCCGCGG

CCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAGTGGCTCACCAAGGCGACGAC

GGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAG

ACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTG

CACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGAT

GACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCG

AAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGC

CAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAAT

TATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCACGTCGGTTGT

GAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCAGTCGATACGGGCA

GGCTAGAGTTCGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGG

TGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGG

ATCTCTGGGCCGATACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGA

GCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGT

GGGCACTAGGTGTGGGCAACATTCCACGTTGTCCGTGCCGCAGC

TAACGCATTAAGTGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCT

AAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAG

CATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGC

TTGACATACACCGGAAACGTCTGGAGACAGGCGCCCCCTTGTG

GTCGGTGTACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTG

AGATGGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCCG

TGTTGCCAGCAGGCCCTTGTGGTGCTGGGGACTCACGGGAGAC

CGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCA

TCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCCG

GTACAATGAGCTGCGATACCGTGAGGTGGAGCGAATCTCAAAA

AGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGA

AGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGA

ATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAA

GTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCCAACCCCTTGTGGGAGG

GAGCTTGTCGAAGGTGGGACTGGCGATTGGGACGAAGTCGT

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>引物

<400>2

AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG

<210>3

<211>19

<212>DNA

<213>引物

<400>3

AGAGTTTGAT CCTGGCTCA

<210>4

<211>18

<212>DNA

<213>引物

<400>4

ACTCCTACGG GAGGCAGC

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>反向引物

<400>5

CACGAGCTGA CGACAGCCAT

<210>6

<211>19

<212>DNA

<213>反向引物

<400>6

GGYTACCTTG TTACGACTT

<210>7

<211>17

<212>DNA

<213>反向引物

<400>7

AAGGAGGTGW TCCARCC