一种用凝结芽孢杆菌CGMCC No.2602生产L－乳酸的方法

摘要

一种用凝结芽孢杆菌CGMCC No.2602生产L－乳酸的方法，属于微生物技术领域。本发明采用凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CGMCC No.2602在不供氧的环境下，通过半连续间歇发酵方式或中间补糖发酵方式发酵淀粉质水解糖或葡萄糖生成高光学纯度的L－乳酸。本发明方法的优点在于此种凝结芽孢杆菌的芽孢性质稳定，接种发酵淀粉质水解糖，获得的L－乳酸光学纯度高，糖酸转化率高，发酵周期短；半连续间歇发酵方式通过连续倒罐移种的方法节省制备种子的时间，缩短发酵周期，增强发酵强度，获得糖酸转化率及纯度都相当高的L－乳酸。

说明书

技术领域

一种用凝结芽孢杆菌CGMCC No.2602生产L-乳酸的方法，属于微生物技术领域。

背景技术

乳酸(Lactic Acid)学名为2-羟基丙酸，它是一种手性分子，具有旋光性，左旋性乳酸称为L-乳酸，右旋性乳酸称为D-乳酸，外消旋乳酸称为DL-乳酸。由于人和动物体内只有代谢L-乳酸的酶，若过量摄入D-乳酸或DL-乳酸，会导致血液中富含D-乳酸，易引起疲劳、代谢紊乱甚至酸中毒。在食品和医药工业中高光学纯度的L-乳酸将逐步取代DL-乳酸。

L-乳酸在食品、医药、农业、化工等领域有广泛的应用，已涵盖大量的产品。其中最具前景的是聚L-乳酸，例如在医药行业中，L-乳酸经过聚合可生成直链或环状的聚L-乳酸，聚L-乳酸系无毒的高分子化合物，具有生物相容性，在体内能被分解成L-乳酸而被人体代谢，不引起反应。因此可用于制造缓释胶囊制剂、生物降解纤维、生物植片等。同时聚L-乳酸在自然条件下能够缓慢分解生成CO₂和H₂O，不象聚氯乙稀(PVC)、聚丙烯(PP)塑料那样造成白色污染，并且它可以代替PVC、PP类塑料用于容器薄膜、纤维等制品的生产，进而形成一个可再生资源的良性循环。现在L-乳酸引起了世界的广泛关注，应用前景非常广阔，随着它的用途越来越广泛，市场的需求量也将会越来越大。

乳酸的生产方法主要有化学合成法、酶法和发酵法三种。化学合成法由于所用的原料是乙醛和剧毒物质氢氰酸，因而合成法生产乳酸大大受到限制，其生产成本也较高。酶法生产乳酸虽然可以专一性得到旋光乳酸，但工艺比较复杂，应用到工业上还有待于进一步研究。发酵法是通过微生物的发酵作用通过菌种和培养条件的选择而得到具有专一性的L-乳酸、D-乳酸或是DL-乳酸，原料来源广泛、生产成本低、产品光学纯度高，因此成为目前生产L-乳酸的重要方法。

根据所采用的微生物菌种的不同，目前L-乳酸的微生物发酵分为根霉发酵和细菌发酵。根霉发酵属于好氧发酵，需要较高水平的空气及搅拌系统，对电、蒸汽等能源的消耗较大，而且在发酵乳酸的同时还进行其他途径的代谢，产生较多杂酸，降低了葡萄糖的转化率，生产成本较高。而细菌发酵一般为同型发酵，发酵过程中杂质生成少，葡萄糖转化率高，且厌氧发酵，无需搅拌供氧，能耗低，因此发酵生产成本较低。但目前所用的菌种多以乳杆菌和链球菌为主，一般在不超过40℃的温度条件下发酵乳酸，不耐高温、易变异、易染杂菌等是它们的不足之处。

凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)是一种新的可用于L-乳酸发酵生产的耐高温微生物，能在不供氧的情况下同型发酵生产较高光学纯度的L-乳酸，L-乳酸转化率高，一般在90％以上。在发酵过程中，由于无需供氧，减少了无菌空气供给所需的能耗及发酵罐的搅拌能耗，节约了生产成本。40-60℃较高的发酵温度不仅使杂菌污染的机会大大减少而且减少了冷凝水用量。因此，用凝结芽孢杆菌发酵生产L-乳酸具有良好的工业化生产前景。

专利USP 7183088 B2和CN 1498265 A中提到利用一株凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans SIM-7 DSM 14043)进行L-乳酸生产，但产酸速率较低，发酵98小时，产酸12.3％，转化率为95.5％。中国专利申请号：96121927.0公开了凝结芽孢杆菌生产L-乳酸的方法，其特点为营养缺陷型，生产成本较高。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CGMCCNo.2602生产L-乳酸的方法。

凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CGMCC No.2602革兰氏阳性，短杆状细胞，芽孢膨大。它可利用葡萄糖、L-阿拉伯糖，不可利用木糖、甘露醇。产酸不产气，能水解淀粉，在15℃-65℃条件下能生长。

凝结芽孢杆菌CGMCC No.2602的芽孢具有一般产乳酸的乳杆菌或链球菌菌所不具备的环境抗逆性强、耐高温、易保藏，遗传稳定的生物特性，在不供氧的环境下能萌发生长，发酵糖类或淀粉质物质生成高光学纯度的L-乳酸。

本发明的技术方案：一种用凝结芽孢杆菌CGMCC No.2602生产L-乳酸的方法，采用凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CGMCC No.2602在不供氧的环境下，通过半连续间歇发酵方式或中间补糖发酵方式发酵糖类或淀粉质物质生成高光学纯度的L-乳酸。

半连续间歇发酵方式：在相同发酵条件下厌氧发酵18-24小时，葡萄糖残留<0.5g/L，最高产酸可达100g/L，糖酸转化率>98.5％，光学纯度达98％-99％；将此发酵液重量的10％-30％作为种子转接于新鲜的发酵培养基进行下一批次的发酵，其余发酵液放罐至提取工序；

或中间补糖发酵方式：在相同发酵条件下厌氧发酵12-24小时，进行补加淀粉质水解糖或葡萄糖，使发酵液的总糖浓度达140-160g/L，发酵60-70小时，L-乳酸含量最高达149.4g/L，糖酸转化率≥93％，光学纯度≥96％；

所述相同发酵条件为：采用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖、阿拉伯糖，玉米、大米、红薯、木薯或玉米淀粉、木薯淀粉、小麦淀粉、红薯淀粉、马铃薯淀粉的一种或多种淀粉质物质经液化、糖化制备水解糖，以50-100g/L淀粉质水解糖为碳源；以蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、麦根、麸皮、米糠、玉米浆、大豆肽、棉籽蛋白中的一种或多种为氮源，氮源浓度为1-10g/L；添加无机盐0.5-5g/L，配制成培养基；按10％的量接种凝结芽孢杆菌CGMCC No.2602的芽孢，40-60℃高温厌氧发酵，采用氨水、CaO、CaCO₃、NaOH中的一种或多种为中和剂，使pH维持在4.5-6.5。

本发明的有益效果：

1、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CGMCC No.2602是耐高温的L-乳酸生产菌，其芽孢具有一般产乳酸的乳杆菌或链球菌菌所不具备的环境抗逆性强、耐高温、易保藏，遗传稳定的生物特性，能在不供氧的环境下萌发生长，在糖类或淀粉质物质生成高光学纯度的L-乳酸，40-60℃高温发酵能降低杂菌污染风险。

2、凝结芽孢杆菌CGMCC No.2602可利用的碳源、氮源广泛，可以利用玉米、大米、红薯、木薯等多种淀粉质农产品，营养要求简单，发酵生产L-乳酸所需的氮源浓度较低且能以价格较低廉的麦根、麸皮、米糠、玉米浆等农副产品为氮源，使L-乳酸的发酵成本降低。

3、凝结芽孢杆菌CGMCC No.2602通过半连续间歇发酵方式或中间补糖发酵方式生成高光学纯度的L-乳酸。

在淀粉质水解糖浓度在70g/L-100g/L，使用半连续间歇发酵技术，接种凝结芽孢杆菌GMCC No.2602的芽孢，以CaCO₃等中和剂，厌氧发酵18h-24h，葡萄糖残留<0.5g/L，最高产酸可达100g/L，糖酸转化率>98.5％，光学纯度达98％-99％，将此发酵液的10％-30％作为种子转接新鲜的发酵培养基进行下一批次的发酵，其余放罐至提取工序。此种方法的优点在于此种凝结芽孢杆菌的芽孢性质稳定，能够在较短发酵周期内通过不断的倒罐的方法得到糖酸转化率及纯度都相当高的L-乳酸，发酵周期短，发酵强度大，淀粉质水解糖的糖酸转化率高，L-乳酸光学纯度高，通过倒罐移种的方法能节省制备种子的时间。

4、凝结芽孢杆菌CGMCC No.2602还可以采用中间补糖发酵方式获得高浓度的单罐L-乳酸产量。初始淀粉质水解糖浓度在70-100g/L，接种凝结芽孢杆菌CGMCC No.2602的芽孢，厌氧发酵至12-24小时时，补加水解糖或葡萄糖，使总糖浓度达140g/L-160g/L，发酵60-70小时后，L-乳酸含量最高达149.4g/L，糖酸转化率≥93％，光学纯度≥96％。

生物材料样品保藏

一株凝结芽孢杆菌菌株，其分类命名为：凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)JSSW-LA-07，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏日期2008年7月28日，保藏号为CGMCC No.2602。

具体实施方式

实施例1.半连续间歇发酵方式生产L-乳酸的工艺

1.菌体活化

无菌开启凝结芽孢杆菌的冻干菌种，划线接种于试管麸皮营养琼脂斜面，40-50℃培养18-24小时，然后划线转接于麸皮营养琼脂茄子瓶斜面，40-60℃培养20-24小时，镜检，当90％以上菌体形成芽孢时，即为成熟，可准备移种。

斜面培养基(麸皮营养琼脂培养基)：蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，NaCl5g/L，麸皮10g/L，琼脂15-20g/L，蒸馏水1L，pH7.0-7.2。

2.种子培养

2.1斜面培养

用接种环从菌种斜面上沾取少量菌泥，划线接种于斜面培养基，40-60℃培养24～48小时，镜检芽孢率>90％即为成熟。

斜面培养基：蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，NaCl5g/L，麸皮10g/L，琼脂15-20g/L，蒸馏水1L，pH7.0-7.2。

2.2摇瓶及种子罐培养

将成熟的种子用无菌水从斜面上刮洗下来，放入内装无菌玻璃珠的灭菌三角瓶，振荡，制成均匀的菌悬液，80℃水浴10分钟，以体积比5％-10％的接种量接入孢子悬液，三角瓶装量体积比30％-50％，瓶口用胶塞盖住，在培养过程中无氧气进入，摇瓶转速80-150r/min；或接入种子罐培养，可根据需要选用0.01m³、0.02m³、0.05m³、0.1m³、0.3m³或更大体积的种子罐，厌氧培养，搅拌转速100-150r/min，种子罐的装量系数为体积比70％-80％。培养温度为40-60℃，适宜温度为40-55℃，培养时间为18-24小时。

培养基组成：碳源可以采用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖、阿拉伯糖或玉米、大米、红薯、木薯或玉米淀粉、木薯淀粉、小麦淀粉、红薯淀粉、马铃薯淀粉等淀粉类物质的一种或多种，淀粉类物质经酶法液化、糖化制备成水解糖，其用量在每升培养基中为50-100g。氮源可以采用蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、麦根、麸皮、米糠、玉米浆、大豆肽、棉籽蛋白等中的一种或多种，其用量在每升培养基中为1-10g。(NH₄)₂SO₄1.0g/L，MnSO₄·H₂O0.1g/L，碳酸钙30-60g/L，pH5.0-6.0。

3.发酵罐培养

种子培养液以体积比10％-30％的接种量接入发酵罐，发酵罐可根据实际生产需要选用1m³、2m³、3m³或更大体积的发酵罐，发酵罐装量系数体积比为70％-80％。温度控制在30-60℃，适宜温度为40-55℃，厌氧发酵18h-24h，不通气搅拌，搅拌转速为100r/min，当发酵液中葡萄糖残留<0.5g/L时发酵结束，将此发酵液的10％-30％作为种子转接新鲜的发酵培养基进行下一批次的发酵，其余放罐至提取工序。

发酵培养基：发酵培养基由碳源、氮源和无机盐组成，碳源可以采用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖、阿拉伯糖或玉米、大米、红薯、木薯或玉米淀粉、木薯淀粉、小麦淀粉、红薯淀粉、马铃薯淀粉等淀粉质物质的一种或多种，淀粉质物质经酶法液化、糖化制备成水解糖，其用量在每升培养基中为50-100g。氮源可以用蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、麦根、麸皮、玉米浆、大豆肽、棉籽蛋白等中的一种或多种，其用量在每升培养基中为1-10g。另外每升发酵培养基中还含有：无机盐0.5-5.0g，余量为水，发酵过程中按体积重量比添加轻质CaCO₃40-60g/L，控制发酵pH维持在4.5-6.5。

4.L-乳酸样品处理及检测

发酵终了时，取发酵液样品，先将其加热至80-100℃，接着4000rpm/min离心5分钟，取上清液进行测定。分析方法如下：

斐林法测定总糖浓度、EDTA测定L-乳酸钙含量；

葡萄糖残留测定：SBA生物传感分析仪；

HPLC测定L-乳酸纯度，使用SBA生物传感分析仪测定发酵过程中L-乳酸含量；

糖酸转化率定义为：L-乳酸产量(克/升)/葡萄糖的消耗量(克/升)×100％；

实施例2.采用中间补糖发酵方式生产L-乳酸

1.菌体活化

无菌开启凝结芽孢杆菌的冻干菌种，划线接种于试管麸皮营养琼脂斜面，40-50℃培养18-24小时，然后划线转接于麸皮营养琼脂茄子瓶斜面，40-60℃培养20-24小时，镜检，当90％以上菌体形成芽孢时，即为成熟，可准备移种。

斜面培养基：蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，NaCl 5g/L，麸皮10g/L，琼脂15-20g/L，蒸馏水1L，pH7.0-7.2。

2.种子培养

2.1斜面培养

用接种环从菌种斜面上沾取少量菌泥，划线接种于斜面培养基，40-60℃培养24～48小时，镜检以芽孢>90％即为成熟。

斜面培养基：蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，NaCl 5g/L，麸皮10g/L，琼脂15-20g/L，蒸馏水1L，pH7.0-7.2。

2.2摇瓶及种子罐培养

将成熟的种子用无菌水从斜面上刮洗下来，放入内装无菌玻璃珠的灭菌三角瓶，振荡，制成均匀的菌悬液，80℃水浴10分钟，以5％-10％(v/v)的接种量接入孢子悬液，三角瓶装量30％-50％(v/v)，瓶口用胶塞盖住，在培养过程中无氧气进入，摇瓶转速80-150r/min；或接入种子罐培养，可根据需要选用0.01m³、0.02m³、0.05m³、0.1m³、0.3m³或更大体积的种子罐，厌氧培养，搅拌转速100-150r/min，种子罐的装量系数为体积比70％-80％。培养温度为40-60℃，适宜温度为40-55℃，培养时间为18h-24h。

培养基组成：碳源可以采用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖、阿拉伯糖或玉米、大米、红薯、木薯或玉米淀粉、木薯淀粉、小麦淀粉、红薯淀粉、马铃薯淀粉等淀粉类物质的一种或多种，淀粉类物经质酶法液化、糖化制备成水解糖，其用量在每升培养基中为50g-100g。氮源可以采用蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、麦根、麸皮、米糠、玉米浆、大豆肽、棉籽蛋白等中的一种或多种，其用量在每升培养基中为1-10g。(NH₄)₂SO₄1.0g/L，MnSO₄·H₂O 0.1g/L，碳酸钙30-60g/L，pH5.0-6.0。

3.发酵培养

种子培养液以体积比5％-10％的接种量接入发酵罐，发酵罐可根据实际生产需要选用1m³、2m³、3m³或更大体积的发酵罐，发酵罐装量系数为70％-80％(v/v)不通气搅拌，搅拌转速为100r/min。

发酵培养基由碳源、氮源和无机盐组成，凝结芽孢杆菌液体发酵液的C源和N源的选择十分广泛，碳源可以采用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖、阿拉伯糖或玉米、大米、红薯、木薯或玉米淀粉、木薯淀粉、小麦淀粉、红薯淀粉、马铃薯淀粉等淀粉类物质的一种或多种，淀粉类物质经酶法液化、糖化制备成水解糖，发酵初始用量在每升培养基中为50-100g。氮源可以用蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、麦根、麸皮、米糠、玉米浆、大豆肽、棉籽蛋白等中的一种或多种，其用量在每升培养基中为1-10g。另外每升发酵培养基中还含有：无机盐0.5-5.0g，余量为水，发酵至12-24小时，补加淀粉质水解糖或葡萄糖，使总糖浓度达140-159g/L，发酵过程中按体积重量比添加轻质CaCO₃ 60-80g/L，控制发酵pH维持在4.5-6.0。发酵温度为40℃-60℃，60-70小时后发酵L-乳酸含量最高达149.4g/L，糖酸转化率≥94％，光学纯度≥97％。

实施例3：玉米淀粉水解液为碳源的凝结芽孢杆菌产L-乳酸

斜面培养基：蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，NaCl 5g/L，麸皮10g/L，琼脂15-20g/L，蒸馏水1L，pH7.0-7.2。

种子培养基：玉米淀粉用高温α-淀粉酶液化、糖化酶糖化制备水解糖，滤液用斐林法测水解糖，以浓度为50g/L水解糖为碳源，蛋白胨5g/L，酵母膏5g/L，(NH₄)₂SO₄ 1.0g/L，MnSO₄·H₂O 0.1g/L，碳酸钙30g/L，pH5.0-6.0。

发酵培养基：玉米淀粉用高温α-淀粉酶液化、糖化酶糖化制备水解糖，取滤液用斐林法测水解糖，以浓度为75-80g/L水解糖为碳源，蛋白胨1.0g/L，麦根3.0g/L，(NH₄)₂SO₄ 1.0g/L，MnSO₄·H₂O 0.1g/L，pH5.0-5.5。

发酵生产L-乳酸的步骤：

(1)斜面培养：将凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CGMCC No.2602接种于斜面培养基上，45℃静置培养24小时，镜检芽孢>90％即成熟。

(2)摇瓶及种子罐培养：在无菌条件下，将成熟的种子用无菌水从斜面上刮洗下来，放入内装无菌玻璃珠的灭菌三角瓶，瓶口用胶塞盖住，保证在培养过程中无氧气进入，振荡，制成均匀的菌悬液，80℃水浴10分钟，以体积比10％的接种量接入300L种子罐，装量系数为80％(v/v)，即0.3m³发酵罐装0.24m³培养基，不通气搅拌，搅拌转速为100-150r/min，50±1℃培养12-18小时后，接入3m³发酵罐。

(3)半连续间歇发酵培养：在3m³罐中加入约2.4m³的发酵培养基，以体积比10％的接种量接入0.3m³发酵罐的凝结芽孢杆菌发酵液作为种子，不通气搅拌，搅拌转速为100r/min，发酵温度控制在50±1℃，发酵过程中按体积重量比添加轻质CaCO₃ 6％，控制发酵pH在5.0-5.5。厌氧发酵18-24h后，将此发酵液的10％-30％作为种子转接新鲜的发酵培养基进行下一批次的发酵，其余放罐至提取工序。连续5批3T罐实验结果如表1：

表1

实施例4：木薯淀粉水解液为碳源的凝结芽孢杆菌产L-乳酸

发酵培养基的组成为：木薯淀粉经高温α-淀粉酶液化及糖化酶糖化制得水解糖，以83g/L水解糖为碳源，麦根3g/L，玉米浆3g/L，硫酸铵3g/L。发酵过程中按体积重量比添加轻质CaCO₃60g/L使培养基pH维持在5.0-5.5。发酵时间24h，温度为50±1℃。其他方法均与实施例1相同。

发酵结束，经检测，L-乳酸的含量为80g/L，糖酸转化率为98.8％，L-乳酸纯度为99.5％。

实施例5：玉米粉为碳源的凝结芽孢杆菌产L-乳酸

发酵培养基的组成为：玉米粉经高温α-淀粉酶液化及糖化酶糖化制得水解糖，以78g/L水解糖为碳源，玉米浆5g/L，发酵过程中按体积重量比添加轻质CaCO₃60g/L，使培养基pH维持在5.0-5.5。发酵时间22小时，温度为50±1℃。其他方法均与实施例1相同。

发酵结束，经检测，L-乳酸的含量为77.3g/L，糖酸转化率为99.1％，L-乳酸纯度为98.3％。

实施例6：大米为碳源的凝结芽孢杆菌产L-乳酸

发酵培养基：碎大米用高温α-淀粉酶液化、糖化酶糖化制备水解糖，取滤液用斐林法测水解糖，以浓度为95g/L水解糖为碳源，麸皮3g/L，硫酸铵0.5％，发酵过程中加无菌CaCO₃，使培养基pH维持在5.0-5.5。发酵时间24小时，温度为50±1℃。其他方法均与实施例1相同。

发酵结束，经检测，L-乳酸的含量为94g/L，糖酸转化率为99.0％，L-乳酸纯度为98.6％。

实施例7：利用高浓度淀粉水解液为碳源的凝结芽孢杆菌产L-乳酸

该实施例中所用的培养基的组成如下：

斜面培养基(麸皮营养琼脂培养基)：蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，NaCl5g/L，麸皮10g/L，琼脂15-20g/L，蒸馏水1L，pH7.0-7.2。

种子培养基：大米水解糖50g/L，酵母膏7.5g/L，(NH₄)₂SO₄1.0g/L，MnSO₄·H₂O0.1g/L，碳酸钙30g/L，pH5.0-6.0。

发酵培养基：大米水解糖80-90g/L，酵母膏2.0g/L，麸皮3g/L，(NH₄)₂SO₄1.0g/L，pH5.0-6.0。

发酵生产L-乳酸的步骤：

(1)斜面培养与实施例1相同。

(3)种子培养

在无菌条件下，将成熟的种子用无菌水从斜面上刮洗下来，放入内装无菌玻璃珠的灭菌三角瓶，瓶口用胶塞盖住，保证在培养过程中无氧气进入，振荡，制成均匀的菌悬液，80℃水浴10分钟，以10％(v/v)的接种量接入0.3m³发酵罐，装量系数为80％(v/v)，即0.3m³发酵罐装0.24m³培养基，不通气搅拌，搅拌转速为100-150r/min，经18-24小时厌氧发酵后，作为种子接入3m³发酵罐发酵。(4)发酵培养：在3m³罐中加入约2.4m³的发酵培养基，以体积比10％的接种量接入0.3m³发酵罐的凝结芽孢杆菌发酵液作为种子，温度控制在52±1℃，流加CaCO₃维持pH在5.0-5.5，不通气搅拌，搅拌转速为100r/min。在发酵至18h时，测定发酵液中葡萄糖的浓度为10g/L。按照每升补加70g糖的量补加葡萄糖，厌氧发酵60h-70h时，发酵反应终了。连续3批发酵结果如表2。

表2