人类免疫缺陷病毒系列蛋白抗体测定方法

摘要

本发明涉及检测生物样品中人类免疫缺陷病毒(HIV)存在情况的方法。更具体的，本发明涉及通过将多种人类免疫缺陷病毒蛋白抗原相组合检测生物样品中人类免疫缺陷病毒蛋白抗体的存在情况、藉此确定HIV感染存在与否的方法。本发明还涉及用于此方法中的试剂盒。

说明书

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人类免疫缺陷病毒系列蛋白抗体测定方法 技术领域>

本发明涉及检测生物样品中人类免疫缺陷病毒（HIV )存在 情况的方法。 更具体的， 本发明涉及通过将多种人类免疫缺陷病 毒蛋白抗原相组合检测生物样品中人类免疫缺陷病毒蛋白抗体的 存在情况、 藉此确定 HIV感染存在与否的方法。 本发明还涉及用 于此方法中的试剂盒。 背景技术>

艾滋病 ( Human immunodeficiency virus, HIV )是人类健康 所面临的最凶恶的敌人之一， 自 1981年首次被发现以来， 以难以 遏制的速度在全球持续蔓延。 据世界卫生组织 (WHO)估计， 截止 2001年 12月底， 全球仍存活的 HIV感染者 /AIDS病例数约 4000 万人， 在 20年期间已有约 2200万人死于艾滋病。 成为排名前四 位的生命杀手， 加之感染和死亡者中青壮年比例很大， 所以艾滋 病给人类造成的灾难已经不亚于世界大战。>

上世纪九十年代以来， 艾滋病感染者增长最快的地区已从非 洲转移到亚洲。 我国 1985年首次发现传入病例， 1991年在云南 出现第一个 HIV感染流行区， 至今 HIV感染已在所有省市自治 区流行。 自 1994年我国 HIV流行进入快速增长期以来， 估计的 HIV感染人数已累计超过 64万并将继续上升。 如不采取有效措 施加以控制， 至 2010年我国 HIV感染者有可能突破 1000万人， 成为全球 HIV感染者绝对数最高的国家之一，从而严重影响我国 人民的健康、 社会的安定和国家的改革开放。>

HIV病毒主要有 I型和 Π型， I型 HIV病毒 （ HIV-1 )是主 要的感染流行型。我国目前发现的 HIV感染者绝大多数为 HIV-1 病毒携带者， 而 HIV-2病毒携带者较少。 其他 HIV病毒类型也 有不断发现。 HIV 可经血液、 性接触及母婴途径传播。 目前对 HIV感染及 AIDS尚无有效的治疗药物与疫苗，控制传染的方法 主要是预防感染，而切断传播途径是最好的预防控制策略，因此， 可靠的低成本高效的 HIV检测方法就显得尤为重要。>

HIV-1感染后， 所有感染者血液中均会出现针对 HIV-1各结 构蛋白抗原， 即由包膜基因（ENV )编码的 gp41、 gpl20、 gpl60; 由核壳基因（ GAG )编码的 pl7、 p24、 p55及由多聚酶基因（ POL ) 编码的 P34、P51、P66等全部或大部分的特异性持续性 IgG抗体。>

血清中 HIV抗体是判断 HIV感染的间接指标。 HIV感染机 体后， 机体将对 HIV产生抗体， 抗体可持续存在于整个病程中。 因此体内抗体的检出通常意味着病毒的存在。>

对抗体的检测是目前最常用、 最筒便有效的方法。 为了使检 测结果达到尽可能高的准确性， HIV检测使用特殊的策略， 即先 用敏感性高的方法进行初筛， 初筛阳性的标本再用特异性强的方 法进行确认。 故抗体检测方法按其目的通常分两种： 初筛检测和 确认实臉。>

1. 抗体初筛检测>

初筛检测的目的是剔除抗体阴性的样品， 并缩小确认范围。 初筛阴性可认为抗体阴性， 即无抗 HIV抗体存在， 可证明在三周 至三个月前无感染发生。 初筛阳性不证明必然感染， 需用确认试 剂方可确认是否感染。 目前世界上主要的筛检方法有： ①酶联免 疫吸附实验 (ELISA); ②明胶颗粒凝集实验 (PA); ③乳胶凝集实 验 (LA); ④各种快速检测法 (如： HIV金标快速试紙条)等等。 但 以 ELISA最为常用， ELISA有很高的灵敏度和特异性， 且操作 简便， 适合于大规模筛检。 自 1985年第一代 ELISA产品问世以 来， 国际上已有数十家较知名的公司近 100个品种在使用中， 国 内也有十多家企业生产 HIV ELISA检测试剂盒， 但品种较单一， 基本上是 HIV-1/2型混合抗体的检测试剂盒， 只能检测血清 /血浆 标本。 ELISA试剂发展， 至今根据抗原或抗体的来源不同及检测 试剂的类型基本上可划分为四代产品。>

第一代和第二代试剂盒均采用 ELISA间接法，即先以混合抗 原 （gp41、 gp36、 gpl20和 p24 ) 包被酶标板， 再加入待检血清， 最后加入酶标记的抗人 IgG抗体。 因此只能检测 IgG抗体。 由 于方法学和原料等方面的限制， 难以保证其检测灵敏度和特异性 同时保持在较好水平上。 第三代试剂则采用双抗原夹心法， 即先 以抗原包被酶标板， 再加入待检血清， 最后加入酶标记的抗原， 可同时检测 I_gG和>

为进一步缩短窗口期， 1998年推出了可同时检测 HIV抗原 ( P24 ) 和抗体（包括 " O"亚型抗体） 的第四代 ELISA产品。 该产品是将抗原和抗体同时包被聚苯乙烯酶标板， 再加入待检血 清， 最后加入酶标记的抗原和单克隆抗体， 从而能同时检测出血 清中的 P24抗原、 HIV-1+2型抗体及 HIV - 1的 'Ό"亚型抗体。>

初筛实验是检测样本中 HIV抗体的综合结果，其缺点是特异 性较差， 因此初筛中很多阳性样本为假阳性。>

2. 抗体确认实验>

在初筛的基础上需要确认， 目前可用于确认的方法有： ①免 疫印迹法 （ WB - Western Blot ) ； ②条带免疫实验法 (Line Immunoassay LIA);③免疫荧光实验法 (IFA); ④放射免疫沉淀实 验 (RIPA); ⑤病毒分离法等， 在临床上应用较多的是前两种， 即 WB法和 LIA法。>

在国际市场上常用的 HIV抗体确认试剂有 HIV-1型、 HIV - 2型和 HIV - 1 / 2混合型， 检测方法有 WB的， 也有 LIA, 在 临床上应用较多的也是 WB法和 LIA法，目前所有这些方法均为 将 HIV病毒各结构蛋白抗原 （天然或人工表达）制备在膜条上， 使用时将条膜浸入人血清样本中过夜反应， 最终用显色法来看相 关蛋白是否出现可见条带来检测抗体， 并最终按各抗原抗体出现 的情况来综合判断是否感染 HIV, 判断标准参见例如本发明的实 施例 3中所述。>

它们的共同的缺点是灵敏度远低于初筛检测的 ELISA方法。 本发明通过将至少五种 HIV-1结构蛋白抗原和一种 HIV-2结构蛋 白抗原相组合用于生物样品中相应抗体的检测， 实现了 HIV感染 的快速、 灵敏检测， 从而克服了现有技术中的缺陷。 发明内容>

本发明提供了一种检测生物样品中抗 HIV抗体存在情况的方 法， 包括将至少五种 HIV-1结构蛋白抗原和一种 HIV-2结构蛋白 相组合并分别与所述样品接触，然后检测结合复合物的存在情况。>

本发明还提供了用于对生物学样品进行 HI V检测的试剂盒。 具体实施方式>

在一个实施方案中， 本发明提供了一种检测生物样品中抗 HIV抗体存在情况的方法， 其中包括将至少五种 HIV-1结构蛋白 抗原和一种 HIV-2结构蛋白相组合并分别与所述样品接触， 然后 检测结合复合物的存在情况， 所述至少五种 HIV-1结构蛋白抗原 包括 (i) P24或其片段或类似物； (ii) pl7或 p55或其片段或类似物； (iii) P31, P34、 P39、 P51、 P66五种中的至少一种或其片段或类 似物； （iv) GP41或其片段或类似物； 和 (V) GP120或其片段或类 似物。>

在本发明中， 术语 "抗原" 包括全长 HIV蛋白、 全长 HIV 蛋白的衍生物， 例如、 但不仅限于含有对应于全长 HIV蛋白一或 多个部分的氨基酸序列的蛋白质片段或合成肽， 包括连接了配基 的任何经修饰片段或合成肽。 术语 "抗原"还包括全长 HIV蛋白 的类似物， 或者片段或肽的类似物， 包括、 但不仅限于与相应的 亲本蛋白结合相同抗体的非肽分子， 以及所述抗原的变体或融合 多肽或免疫原性片段。>

在本发明的上下文中， HIV蛋白抗原的 "免疫原性部分" 是 指在接种到个体体内后能够引起免疫应答、 并且同样能够与针对 相应蛋白抗原产生的特异抗体结合的部分。 因此， 此处所述的蛋 白质免疫原性部分可用抗体结合试验鉴定。 这些试验通常可用本 领域普通技术人员已知的多种方法中的任何一种进行， 例如， 在 Harlow和 Lane, 《抗体： 实验室手册》 （冷泉港实验室， 冷泉 港， 纽约， 1988 ) 中所述的方法。>

此处所用的多肽 "变体" 是与所述多肽区别仅在于一或多个 羲基酸的取代、 缺失和 /或插入、 而仍保留了多肽的免疫原性的 多肽。 优选地， 所述取代是保守性替代。 多肽变体与已鉴定的多 肽优选有至少约 80 %、 更优选至少约 90 %、 最优选至少约 95 % 同一性。有免疫活性的 HIV蛋白抗原变体可通过例如修饰上述多 肽之一的氨基酸序列并评估此修饰多肽的免疫活性而得以鉴定。>

此处所用的 "保守性替代" 是指某一氨基酸被另一具相似特 性的氨基酸所替代， 肽化学领域内的技术人员可预知此多肽的二 级结构和亲水特性并未实廣性改变。 通常说来， 下述氨基酸组代 表了保守性改变： （1)丙氨酸、 脯氨酸、 甘氨酸、 谷氨酸、 天冬氨 酸、 谷氨酰胺、 天冬酰胺、 丝氨酸、 苏氨酸； （2)半胱氨酸、 丝氨 酸、 酪氨酸、 苏氨酸； （3)缬氨酸、 异亮氨酸、 亮氨酸、 甲硫氨酸、 丙氨酸、 苯丙氨酸； （4)赖氨酸、精氨酸、 组氨酸； 和 (5)苯丙氨酸、 酪氨酸、 色氨酸、 组氨酸。>

变体可同时或只包含其它的修饰， 包括删除或添加对该多肽 抗原性、 二级结构和亲水特性影响微小的氨基酸。 例如， 可将信 号 （或前导）序列在蛋白质的氨基末端与多肽缀合， 该序列可以 与蛋白质一起翻译， 并在翻译后指导蛋白质的转移。 多肽也可与 接头或其它序列缀合， 以易于多肽合成、 纯化或鉴定（如多聚组 氨酸） 、 或者增强多肽与固相支持物的结合。 例如， 可以将多肽 与免疫球蛋白的 F_c区缀合。>

此处所用的 "抗原蛋白" 还包括組合或融合多肽。 "组合多 肽" 是含有至少一个上述免疫原性部分及一种或多种额外的免疫 原性的 HIV抗原蛋白， 它们通过肽键连接成一条氨基酸羊链。 这 些序列可直接连接在一起（即无插入的氨基酸） ， 或可通过不会 明显削弱多肽组分免疫原性的连接序列 （如 Gly-Cys-Gly )连接 在一起。>

可用本领域熟知的多种方法中的任一种获得本发明的 HIV 抗原蛋白和编码此类蛋白质的 DN A分子。相当于编码本发明 HI V 蛋白抗原之一的基因 （或其一部分） 的 DNA序列可通过对野生 型株进行测序并与已知的 HIV病毒核酸序列进行比对后得到。这 样得到的部分 DNA序列可用于设计寡核苷酸引物，以在 RT-PCR 中扩增全长 DNA序列， 所用技术在本领域是众所周知的 （可见 如 Mullis等人, Cold Spring Harber Symp. Quant. Biol. , 51:263, 1987; Erlich编， PCR技术， Stockton Press, 纽约， 1989 )。 一旦获 得了编码 HIV蛋白抗原的 DNA序列 , 即可用标准的诱变技术， 如 Adelman等（DNA, 2:183, 1983 )中所教导的寡核苷酸介导的 定点诱变， 轻易地引入上述任何一种修饰。 本发明的序列也可以 直接合成。>

还可用合成或重组方式产生本文公开的 HIV 蛋白或其免疫 原性部分。少于约 100个氨基酸及通常少于约 50个氨基酸的合成 多肽可用本领域普通技术人员熟知的技术制备。 例如， 这类多肽 可用任何可供利用的固相技术合成，如 Merrifield固相合成方法， 其中氨基酸被依次加到正在延长的氨基酸链上 （可见于如， Merrifield,美国化学学会杂志（J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2146, 1963 ) 。 多肽自动合成仪可购自如 Perkin Elmer /应用生物系统 分部 （Foster城， CA ) 等厂家， 并可按制造商的指示进行操作。>

任何上述多肽均可重组产生， 即将编码多肽的 DNA序列插 入表达载体中， 并在适当的宿主中表达蛋白质。 本领域普通技术 人员所知的种种表达载体中的任一种均可用来表达本发明的重组 多肽。 在转化或转染了含有重组多肽编码 DNA分子之表达载体 的任何适当宿主细胞中均可进行表达。 合适的宿主细胞包括原核 细胞、 酵母和高等真核细胞。 优选所用的宿主细胞是大肠杆菌、 酵母或哺乳类细胞系， 如 CHO细胞。 以此方式表达的 DNA序列 可编码天然存在的多肽、 天然存在多肽的部分， 或它们的其它变 体。>

在本发明中， 可以采用多种方式联合应用至少五种 HIV-1结 构蛋白抗原和一种 HIV-2结构蛋白对生物样品进行 HIV检测。 这 样的技术是本领域中熟知的，包括、但不限于酶免疫测定法（ EIA )， 例如酶联免疫吸附测定法（ELISA )、 蛋白质印迹和其它免疫印迹 法、 放射免疫测定法（RIA ) 、 放射免疫沉淀测定法（RIPA ) 、 颗 粒凝集测定法和免疫荧光测定法 （IFA ) 。>

优选的， 所述至少五种 HIV-1结构蛋白抗原和一种 HIV-2结 构蛋白是通过酶免疫测定法或免疫荧光测定法对生物样品进行 HIV检测的。在一个实施方案中， 所述 HIV结构蛋白抗原被单独 地固定在固体支持物上。所述固体支持物可以是本领域中已知的， 例如聚苯乙烯珠、 塑料微孔板等。 本领域常规技术人员已知多种 使用抗原检测样品中的相应抗体的测定方式。 见例如， Harlow和 Lane, 《抗体： 实验室手册》 , 冷泉港实验室， 1988。 在一优选 实施方案中， 测定包括使用固定在固相支持物上的抗原来结合生 物样品中的相应抗体并将其与样品的其余部分分开。 结合的 HIV 蛋白抗原 -抗体复合物随后可通过常规方法检测， 包括例如采用 含报告基团的第二抗体， 或者含报告基团的相关抗原 （即双抗原 夹心法） 。>

固相支持物可以是本领域普通技术人员所已知的、 蛋白质可 附着于其上的任何物质。 例如， 固相支持物可以是微量滴定板上 的检猃孔或硝酸纤维素膜或其它合适的膜。 或者， 支持物可以是 珠子或盘， 诸如玻璃、 纤维玻璃、 乳胶、 胶体金或塑料材料， 如 聚苯乙烯或聚氯乙烯。 支持物也可以是磁性颗粒或纤维光学传感 器， 例如公开于美国专利号 5,359,681 中的那些材料。 HIV抗原 蛋白可用本领域技术人员已知的多种技术固定在固相支持物上， 这些技术在专利和科学文献中有充分的描述。 在本发明的上下文 中， "固定化" 一词指非共价结合 （如吸附） ， 及共价结合（可 为抗原与支持物上官能团间的直接连接， 或通过交联试剂的连 接） 。 通过吸附到微量滴定板的孔上或膜上而固定化的方法是优 选的。 在这类情形中， 可通过在适合的緩冲液中， 使 HIV蛋白抗 原与固相支持物接触一段合适的时间而完成吸附。 接触时间随温 度而变化， 但通常是在约 1小时到 1天之间。 一般说来， 将塑料 微量滴定板（如聚苯乙烯或聚氯乙烯） 小孔与约 10n_g-10>g、 优 选约 100ng-l g的抗原接触， 足以固定适当量的结合剂。>

一般可通过将欢功能试剂与支持物首先反应来完成蛋白抗 原与固相支持物的共价附着， 所述双功能剂可与支持物及结合剂 上的官能团 （如羟基或氨基）二者反应。 例如， 利用苯醌， 或通 过在固相支持物上的醛基与抗原上的胺基和活性氢之间发生缩 合， 可以将抗原与具有适当聚合物包被的支持物共价连接起来。>

[参阅 Pierce Immunotechndogy Catalog and Handbook, 1991, 于 A12-A13>

在某些实施方案中， 可通过酶联免疫吸附测定法对样品中的 HIV感染情况进行测定。 首先将固定在固相支持物 （常为微量滴 定板的孔）上的 HIV蛋白抗原与样品接触， 以使样品中的抗体特 异性地结合到固定化的抗原上， 从而完成这一分析。 随后将未结 合的样品从固定化蛋白抗原 -抗体复合体中去除， 并加入抗人 IgG 抗体 （被称为二抗） 或相关抗原 （二抗或相关抗原上綴合了合适 的报道基团， 包括例如辣根过氧化物酶、 链霉亲和素等） 。 然后 用适于检测特定报告基团的方法测定依然结合于固相支持物上的 第二抗体或相关抗原的量。>

更具体地说， 一旦抗原如上所述被固定于支持物上， 通常封 闭支持物上残余的蛋白质结合位点。 许多适合的封闭剂对本领域 普通技术人负是已知的， 如小牛血清白蛋白或吐温 20^TM(Si_gma 化学公司， 圣路易斯， MO)。 然后将固定化抗原与样品共同保温， 使抗原与抗体结合。 温育前可用合适的稀释液稀释样品， 如磷酸 盐緩沖液（PBS ) 。 一般说来， 合适的接触时间 （即保温时间） 是足以确定样品中针对 HIV蛋白抗原的抗体存在情况的时间。优 合水平的至少 95 %的时间。 本领域普通技术人员会认识到， 通过 一段时间内的结合水平， 可以很方便地测定达到平衡所必需的时 间。 室温时， 大约 30分钟的保温时间通常就足够了。>

然后， 可用适合的緩冲液（如含 0.1 %吐温 20™的 PBS ) 清 洗固相支持物而去除未结合样品， 并采用合适的方法对包被抗原 与抗体之间的结合进行检测。 优选地， 采用二抗或相关抗原检测 包被抗原与生物样品中抗体之间的结合。 更优选地， 所述第二抗 体或相关抗原是被标记的形式， 其中含有报告基团。 优选的报告 基团包括酶（如辣根过氧化物酶） 、 底物、 辅助因子、 抑制剂、 染料、 放射性核素、 发光基团、 荧光基团和生物素。 抗体或相关 抗原与报告基团的附着或缀合可用本领域普通技术人员所知的标 准方法完成。>

然后将第二抗体或相关抗原与固定化的抗体-多肽复合体温 育足够长时间， 以检测相关多肽。 通常根据试验一段时间后的结 合水平来确定适当的温育时间。 接着除去未结合的笫二抗体或相 关抗原， 并通过报告基团检测结合的笫二抗体或相关抗原。 检测 报告基团的方法取决于报告基团的性质。 对于放射性基团， 闪烁 计数法或放射自显影方法通常是可行的。光谱法可用来检测染料、 发光基团和荧光基团。 生物素可用偶联了其它报告基团 （通常是 放射性或荧光基团或酶） 的抗生物素蛋白来检测。 通常通过加入 底物 （一般持续特定时间） 、 再用光谱法或其它方法分析反应产 物而对酶报告基团进行检测。 结果的判断可通过肉眼来观察。 为 排除实验人员的主观经验带来的影响， 还可以采用曝光胶片来观 察。 当然， 这种方式也要通过实验人员的肉眼来判断。 因此更为 优选的是， 在化学发光法的情况下， 可采用单光子分析法进行检 测， 如此可以极大地提高检测的灵敏度。>

为了确定样品中针对 HIV 蛋白抗原的抗体的存在情况或者 含量， 通常将测得的仍结合于固相支持物的报告基团的信号与标 准曲线进行比较。 在一个优选的实例中， 标准曲线是通过将固定 化的 HIV蛋白抗原与系列稀释的 HIV阳性样品一起温育， 并将 检测到的信号与样品稀释倍数进行作图而得到的。 在一个相关实例中， 可以流通形式进行该分析。 其中抗原被 固定在微珠上，如直径为 4.5mm的聚苯乙烯微珠。在试验过程中， 当样品接触微珠时， 样品中的抗体即与固定化的抗原相结合。 然 后， 当含有第二抗体或相关抗原的溶液接触微珠时时， 标记的第 二抗体或相关抗原即与抗原 -抗体复合体相结合。结合的笫二抗体 或相关抗原的检测可依上述方法进行。>

在一个实施方案中， 将 HIV-1各结构蛋白抗原， 即由包膜基 因 （ENV ) 编码的 gp41、 gpl20、 gpl60; 由核壳基因 （GAG ) 编码的 pl7、 p24、 p55及由多聚酶基因（POL )编码的 P34、 P51、 P66 等全部的特异性抗原分别包被在微孔板中， 每个样本进行复 合检测， 并最终按各抗原抗体出现的情况来综合判断是否感染 HIV。>

酶免疫测定法包括下述步骤。 首先， 由病毒裂解物纯化 HIV 抗原， 借助重组 DNA技术或肽合成方法制备， 并包被到微孔板 的孔内， 形成测定法的 "固相，，。 将待检生物学样品例如血清加入 到孔中。 如果样品中存在 HIV特异性抗体， 则它将与固相上固定 的抗原发生反应， 然后将孔内的其它内容物通过洗涤除去。 向孔 中添加含有与酶或其它检测体系结合的抗人抗体或相关抗原。 如 果样品中含有 HIV特异性抗体， 它们将保持附着在固相抗原上， 缀合了酶的抗人抗体或相关抗原将结合到这些抗体上， 因而间接 连接在固相上。 接着进行另一洗涤步骤。 如果个体的血清含有抗 HIV抗体， 酶将通过抗体保持附着到固相上， 因而在将适当的底 物添加到孔中后将催化生色反应。 借助分光计可以测定颜色的变 化。 吸光度高于由对照样品计算的临界值意味着该样品是有反应 性。>

在本发明中， 抗人抗体（在本领域中统称为 "二抗"）或相关 抗原是缀合了标记的形式。所述标记可以是例如辣根过氧化物酶、 链霉亲和素等。 可用于本发明中的二抗包括完整分子及其片段， 包括例如 Fab、 F(ab')2以及蛋白 A和蛋白 G等等， 它们能够结 合表位决定簇。 制备这些片段的方法是本领域中已知的， 参阅例 如 Harlow 和 Lane，《抗体： 实验室手册》，冷泉港实验室出版社， 組约（ 1988 )。 将此文献在此引入作为参考。 可用于本发明的相关 抗原是指与包被（固定在固相支持物上） 抗原相一致的抗原或其 片段或类似物。>

在本发明中， HIV蛋白抗原是以合适的用量（浓度） 固定在 固相支持物上的。 这一用量（浓度）优选地是 0.05-2.0μ_§/πι1， 尤 其是 0.5 g/ml。 通常， 蛋白抗原是以处于 0.02mol/l， pH9.6的碳 酸盐緩冲液中的溶液形式施加到固相支持物上的， 一般以 ΙΟΟ μ Ι 体积进行固定。 当然， 普通技术人员知晓可以采用的緩冲液， 蛋 白抗原的浓度和所应用的蛋白抗原溶液的体积， 并可通过常规实 验确定。>

在本发明的一个实施方案中， 采用五种 HIV-1结构蛋白抗原 和一种 HIV-2结构蛋白抗原进行检测。 优选的， 所述 HIV-1结构 蛋白抗原是 p24，p55, P66, gp41和 gpl20， 所述 HIV-2结构蛋白 抗原是 GP36。 在另一个实施方案中， 采用至少六种 HIV-1结构 蛋白和一种 HIV-2结构蛋白抗原进行检测， 其中所述 HIV-1结构 蛋白抗原包括 P31、 P34、 P39、 P51、 P66五种中的至少两种。 优 选地， 所述至少六种 HIV-1结构蛋白抗原是 p24，p55，p31， P66, gp41, gpl20。 所述 HIV-2结构蛋白是 GP36。 在本发明中， 这些 结构蛋白抗原可通过上文所述方法固定在固相支持物上， 并按照 前述方法进行检测。>

在进一步的实施方案中， 在本发明的方法中还可以包含其它 HIV结构蛋白抗原。>

此处所述 "患者，， 是指任何温血动物， 优选是人， 患者可以 是患病的， 或不患有可察觉的疾病。>

在本发明的上下文中， "样品 "可以是任何可能含有针对 HIV 蛋白抗原的抗体的样品， 包括例如血清、 全血、 尿液、 胸腹腔积 液、 脑脊液和组织标本。>

本发明还提供了用于对生物学样品进行 HIV检测的试剂盒。 本发明的试剂盒可以包含预先包装的以预定量存在的试剂， 包括 HIV蛋白抗原和标记形式的抗人 IgG抗体或相关抗原等， 以及用 于实施本发明方法的说明书。 优选的标记基团包括酶（如辣根过 氧化物酶） 、 底物、 辅助因子、 抑制剂、 染料、 放射性核素、 发 光基团、 荧光基团和生物素。 抗体或相关抗原与标记基团 （也可 称作报告基团） 的连接可用本领域普通技术人员所知的标准方法 完成。 在一个实施方案中， 该试剂盒中可选地包含适于检测所述 标记的试剂。 例如， 如果标记是酶， 则试剂盒中可包含底物以及 该酶所需的辅因子（例如可提供生色团或荧光团的底物前体）。此 外， 还可以包括其它添加剂， 例如稳定剂、 缓冲液等。 各种试剂 的相对量可以广泛变化 , 以便可以使该测定法的灵敏度最优化。 试剂可以干粉形式提供， 通常是冻干粉， 包含在溶解时将使试剂 溶液具有适当浓度的赋形剂。 可以从本领域中已知的多种来源获 得用于本发明试剂盒中的 HIV抗原。 例如， 所述 HIV抗原可以 通过重组方法、 例如本文中所述的那些方法制备。 或者， HIV蛋 白抗原可以从商品供应商处购得， 例如可以从 Biodesign International (Maine, USA)获得。 在本发明中， HIV蛋白抗原可 以是固定在微孔板或微珠或微球或其它异形塑料及玻璃材料的、 能够同时并联测定的样式或形状的支持物中的形式。 这些微孔板 可以是可组装形式，从而按照需要将不同 HIV蛋白抗原孔相组合 用于 HIV感染情况的测定。>

本发明综合了原有初筛和确认方法的优点， 以其卓越的灵敏 度和完美的特异性提高了艾滋病诊断的准确性和时间。 以下是该发明的一个实施例， 该实施例仅用于说明本发明， 但本发明的内容不限于此。 实施例>

实施例 1 HIV-1蛋白抗原和 HIV-2蛋白抗原的制备 根据现有技术中已知的关于 HIV-1蛋白抗原 gp41、 gpl20、 p66, p31、 p55、 p24和 HIV-2蛋白抗原 gp36的序列信息， 通过 基因工程方法生产 6种 HIV-1抗原（ENV区： gp41 , gpl20; POL 区： p66, p31; GAG区： p55, p24; )和 1种 HIV-2抗原 ( ENV 区： gp36 )。 抗原蛋白序列信息和制备方法参考文献见表 1。>

实施例 2 HIV蛋白抗原包被板的制备>

将按照实施例 1制备的 HIV蛋白抗原分别用 pH9.6， 0.02M 的碳酸盐緩沖液配制为 0.1 μ g/mL的包被液，按每孔 100 μ 1包被 微孔板， 2 ~ 8°C过夜后，弃包被液。按每孔 200 μ 1加入含 1% BSA 的 PBS封闭液， 37°C封闭 2h; 干燥后放入密封袋内真空保存。 实施例 3 采用 HIV蛋白抗原包被板酶对生物样品进行检测 本例测定的样本来自四川省疾病预防控制中心， 其中样本 1、 样本 2、 样本 3为确认的 HIV抗体阳性样本； 样本 4和样本 5为 确认的 HIV抗体阴性样本； 样本 6、样本 7和样本 8为 HIV抗体 不确定样本。>

向按照实施例 2制备的 HIV蛋白抗原的微孔板的微孔中加入按 1: 1000稀释于含 1% BSA的 PBS中的待检生物样品 ΙΟΟμΙ, 在 37 °C温度下温育 2小时。 然后， 用 PBS洗涤液清洗各孔， 以去除未 结合的組分。向孔中加入 ΙΟΟμΙ以 1% BSA的 PBS为緩冲液且含 约 10ng/ml的缀合了辣根过氧化物酶的抗人 IgG, 抗人 IgG可以 从商品供应商处购得，例如可以从 Biodesign International (Maine. USA)获得。缀合了辣根过氧化物酶的抗人 I_gG是采用常规的过碘>20₂与>3 混合液， 按照中国专利 91110621.9 中公开的配方制备）， 测定相 对发光强度， 并与临界值比较， 从而确定某种 HIV抗原的抗体阳 性还是阴性， 最后综合标本对各种 HIV抗原的反应性， 根据如下 所述的本领域公认判别标准，得出 HIV抗体阳性、 HIV抗体阴性 或 HIV抗体不确定的结论：>

分析结果 蛋白抗体阳性 （S/CO大于 1.0 ) 情况>

阴性 没有特异性蛋白抗体阳性>

至少检测出 2个 ENV蛋白 （gp41， gpl20 ) 抗体阳性， 或

HIV-1阳性 检测出 1 个 ENV蛋白 （gp41 , gpl20 ) 抗体阳性及 1 个>

GAG ( p55, p24 ) 或 POL ( p66, p31 ) 蛋白抗体阳性

HIV-1 P日性， 且提示>

出现 HIV-1抗体阳性结果， 且检测出 gp36蛋白抗体阳性 HIV-2阳性感染>

不确定 出现特异性蛋白抗体阳性， 但不足以判为阳性>

不确定， 提示 HIV-2 出现特异性蛋白抗体阳性， 但不足以判为阳性， 且检测出 阳性感染 gp36蛋白抗体阳性 在实验中， 还包括了一个鼠抗人 I_gG单抗包被孔作为系统质>gG，样品中的>gG结合， 显示阳性反应， 提示生物样品和试 剂是否已加入及试剂是否有效。 同时， 以 BSA封闭蛋白对照孔做 为本底对照。>

实验结果如下：>

表 2>

从中可看出， 样本 1、 样本 2、 样本 3、 样本 6、 样本 7和样 本 8均为阳性样本， 样本 4和样本 5为阴性样本。 本发明的方法 在对生物样品进行检测时， 对于已确认阳性的生物样品的检测结 果均为阳性，而对于已确认阴性的生物样品的检测结果均为阴性， 这说明本发明的方法完全可靠， 其最大的特点在于快速简便。>

针对感染状况纯属未知的生物样品 6 - 8， 为确认本发明检测 结果的正确性， 还采用了 PCR方法对该样品中 DNA形式的 HIV 核酸进行检测。 该 DNA形式可以是整合到感染细胞染色体内的 原病毒， 或者是在活跃表达病毒的感染细胞内合成的 RNA, 或者 处于无细胞血浆内的病毒颗粒内。 对生物样品中的细胞进行去污 剂裂解， 按照 bioM rieux China Limited (法国） 的试剂盒 Comparison of NucliSens EasyQ HIV-1中的操作说明书对裂解物 进行 HIV DNA的 PCR扩增。>

结果表明， PCR方法对样本 6、 样本 7和样本 8的检测结果 均为阳性 （ /代表没有检测）， 说明样本中确实存在 HIV病毒。 这与按照本发明方法进行检测的结果完全一致， 进一步证明了本 发明方法完全可靠， 但相比于 PCR方法， 它是非常快速筒便的。 申请人还采用现有技术中已知的蛋白印迹方法对生物样品 1 - 8 进行了检测， 以便与本发明就灵敏度进行比较。 蛋白质印迹 的结果参见下表 2， 其中 ±表示结果不确定。 样本的 WB带型及结果>

实施例 4 大量生物样品的检测>

利用同实施例 3 相同的方法测定了已经蛋白印迹方法确认的样 本 1009例， 检测结果为灵敏度 （真阳性率） 为 99.66%， 特异 性 （真阴性率） 为 100.00%, 假阳性率 （误诊率） 为 0.00%， 假 阴性率 （漏诊率） 为 0.34%。>

上述结果说明， 借助本发明的方法， 通过将至少五种 HIV-1 结构蛋白抗原与 HIV-2结构蛋白抗原 GP36相组合， 可以高准确 度简便地确定生物样品中 HIV感染情况。其检测的灵敏度高于常 规 HIV检测中的蛋白印迹确认法， 甚至与 PCR检测的灵敏度相 当。 上面以例示的方式对本发明进行了举例说明， 但本发明绝不 限于此。本领域普通技术人员在阅读了整篇说明书之后，完全清楚 可对本发明作各种改动，而仍不偏离本发明的精神和范围。>