一种高效液相色谱检测血液中吡啶硫胺素的方法

摘要

本发明提供了一种高效液相色谱检测血液中吡啶硫胺素含量的方法，其特征在于，具体步骤为：取全血除去蛋白质后采用高效液相色谱检测，其中，色谱条件为：使用C18色谱柱，以第一步所得磷酸氢二钠溶液和磷酸二氢钠溶液分别为第一流动相和第二流动相，以流速1.0mL/min梯度洗脱，荧光检测激发波长为385nm、发射波长为460nm。本发明的优点在于：能够通过简单的方法检测出血液中吡啶硫胺素的含量。

说明书

技术领域

本发明涉及一种高效液相色谱检测血液中吡啶硫胺素的方法，属于生物医疗技术领域。

背景技术

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)已经成为最常见的神经变性性疾病，给个人、家庭和社会产生严重的危害。迄今为止，晚发性(散发性)AD的发病机理仍然没有得到完全解析，大量的研究形成了很多假说，也发现了一些被认为与AD发病相关的生物靶标，这些生物靶标虽然大多与β-淀粉样蛋白(β-amyloid，Aβ)和tau蛋白代谢有关，但并未能发展成特异性的诊断标志和有效的治疗措施。目前临床使用脑内胆碱酯酶抑制剂(如石杉碱甲和多奈哌齐等)和非竞争性NMDA受体拮抗剂(美金刚)并不能阻止AD病情的进展。被认为最有前景的β-淀粉样蛋白疫苗治疗尽管确实有清除脑内β-淀粉样蛋白斑的作用，但不能抑制痴呆症状的发展。所以不得不从更为广泛的视角重新思考晚发性AD发病的可能病理机制及其防治策略。

研究发现，AD患者和动物模型脑细胞糖与能量代谢显著降低、而且明显早于临床症候和特征性病理损害的形成，糖代谢障碍已被认为是AD的独立危险因素，部分学者甚至建议将AD归类为III型糖尿病。

进一步研究发现，在AD患者，与脑细胞糖和能量代谢障碍有关的酶活性异常中，仅以硫胺素(维生素B1)作为辅酶的α-酮戊二酸脱氢酶(α-ketoglutarate dehydrogenase，KGDH)、丙酮酸脱氢酶(pyruvate dehydrogenase，PDH)和转酮醇酶(transketolase，TK)等活性下降最为明显。由于KGDH、PDH和TK分别为机体葡萄糖代谢仅有的两条通路——葡萄糖氧化脱羧—三羧酸循环和磷酸戊糖代谢旁路的关键酶，其活性下降将严重损害细胞糖和能量代谢、神经递质和细胞代谢必备物质合成功能(如乙酰胆碱、乙酰辅酶A、NDAH、NADPH、5—磷酸核糖等)等，并导致氧化应激等病理生理学变化。因此，引起以硫胺素为辅酶的蛋白酶机能性抑制导致细胞糖代谢组学异常和能量代谢障碍与AD的发生发展可能密切相关。

AD患者体内PDH、KGDH和TK酶活性下降显然难以用这三个蛋白酶相关的基因同时变异等分子生物学机制来解释。由于硫胺素是这三个酶的辅酶，而慢性硫胺素缺乏(如慢性酗酒)导致的病理学损害特征与AD惊人地相似：如脑区选择性神经元丢失、海马及其邻近脑区tau蛋白异常磷酸化、Aβ分泌增多和异常沉积等，硫胺素缺乏加重APP/PS1转基因小鼠易损脑区氧化应激的同时，也显著增加Aβ沉积。因而，硫胺素缺乏或机能抑制才可能是AD患者PDH、KGDH和TK活性下降的真正原因。

硫胺素缺乏在AD人群中是一个非常普遍的现象，而且几乎所有硫胺素代谢环节均出现异常：不仅血和脑组织中游离硫胺素含量下降25％、单磷酸硫胺素下降33—45％、焦磷酸硫胺素下降28—40％，而且硫胺素单磷酸酶(下降31—64％)和硫胺素焦磷酸酶(下降28—62％)等活性也显著下降。Gold等人的研究发现，血硫胺素水平降低与晚发性AD发病有关，而与帕金森病无关。这提示机体硫胺素缺乏与AD的关联具有一定的特异性。但问题是：(1)在并无饮食缺乏或限制的情况下，为什么这些患者体内硫胺素会显著缺乏？(2)除上述三个硫胺素作为辅酶的活性下降以外，为什么AD患者体内几乎所有硫胺素代谢环节均出现异常？(3)补充水溶性硫胺素为什么并不能阻止AD的发生和发展呢？上述问题显然难以用单纯的饮食缺乏硫胺素来解释。

发明内容

本发明的目的是确定一种用于阿尔茨海默病诊断和治疗的有效靶标，提供一种检测其在血液中含量的方法。

为了实现上述目的，本发明设定AD患者体内可能存在硫胺素拮抗性物质抑制了机体硫胺素吸收和代谢功能。硫胺素拮抗性物质竞争性地抑制了机体硫胺素吸收和代谢功能。由于硫胺素在体内依靠硫胺素转运蛋白主动转运，竞争结合力强的拮抗性物质存在可能抑制机体对硫胺素的吸收和代谢，导致并无饮食缺乏或限制硫胺素的AD患者机体内硫胺素代谢全面异常，即使补充超大剂量(如2克/日)结合力较弱的硫胺素也无法改变AD患者硫胺素缺乏的状态。

基于上述假设，本发明进行了探索性的预实验研究并在AD患者血中发现了作用超强的硫胺素拮抗性物质并确定其为吡啶硫胺素，其分子式：C₁₄H₂₀N₄O；分子量约为260，分子结构如下：

随后，本发明又建立了重复性、灵敏性、精确性和特异性良好的高效液相色谱(HPLC)方法，在AD患者、帕金森病患者和健康对照人群中研究了此种硫胺素拮抗性物质对于AD患者的特异性，结果表明约2/3AD患者血中存在高浓度的硫胺素拮抗性物质，而帕金森病患者和健康对照人群并未发现。此种硫胺素拮抗物的发现为重新认识AD体内硫胺素机能低下导致细胞糖代谢和能量代谢障碍奠定了基础，为AD的早期诊断、病理损害机制和防治研究指出了新的方向。

本发明的技术方案是提供一种高效液相色谱检测血液中吡啶硫胺素的方法，其特征在于，具体步骤为：

第一步：将血液在-80℃保存；将铁氰化钾加入到150g/L氢氧化钠溶液中配制0.25g/L铁氰化钾溶液；将吡啶硫胺素加入到0.1M盐酸溶液中配制0.1mM吡啶硫胺素溶液，4℃避光冷藏，测定当日用重量浓度为20％的甲醇溶液稀释配制吡啶硫胺素标准溶液，其浓度为Cs；将磷酸氢二钠加入到重量浓度为10％的甲醇溶液中配制25mmol/L磷酸氢二钠溶液；将磷酸二氢钠加入到重量浓度为70％的甲醇溶液中配制25mmol/L磷酸二氢钠溶液；

第二步：将第一步所得吡啶硫胺素溶液与铁氰化钾溶液以体积比25∶3混合，以0.2um孔径过滤膜过滤得到标准溶液，高效液相色谱检测得到吡啶硫胺素的流出时间及其对应的峰面积As，色谱条件为：使用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，分别以第一步所得磷酸氢二钠溶液和磷酸二氢钠溶液为第一流动相和第二流动相，以流速1.0mL/min梯度洗脱，荧光检测激发波长为385nm、发射波长为460nm；

第三步：将血液样本避光解冻后，预处理除去蛋白质，以体积比25∶3与第一步所得铁氰化钾溶液混合，以0.2um孔径过滤膜过滤得到样品溶液，采用与第二步相同的色谱条件检测样品溶液，得到与吡啶硫胺素的流出时间对应的峰面积Ai，按下式计算血液中吡啶硫胺素的浓度Ci：

Ci＝Cs·(Ai/As)。

所述第二步中梯度洗脱流程为：流出时间为0min时全部为第一流动相，逐渐增加第二流动相的比例，流出时间为1.5min时第一流动相和第二流动相的体积比为7：1，流出时间为4min时第一流动相和第二流动相的体积比为1：1，流出时间为6min时全部为第二流动相。

所述第三步中将血液预处理除去蛋白质的具体步骤为：在血液样本中加入等体积的乙腈，振荡15s，以转速15000rpm离心15min，取上清液以转速15000rpm再次离心15min，取上清液常温旋转蒸干，用重量浓度为20％的甲醇溶液滴定至血液样本相同体积。

所述第三步中将血液预处理除去蛋白质的具体步骤为：在血液样本中加入等体积的重量浓度为10％的三氯乙酸溶液，振荡15s，以转速13000rpm离心5min，取上清液以转速13000rpm再次离心5min，取上清液加入水饱和甲基叔丁基醚洗涤，取下层溶液，重复洗涤一次，取下层溶液。

本发明的优点在于：能够通过简单的方法检测出血液中的吡啶硫胺素的含量。

具体实施方式

下面结合实施例来具体说明本发明。

实施例1

一种高效液相色谱检测血中吡啶硫胺素含量的方法：

第一步：将血液在-80℃保存；将铁氰化钾加入到150g/L氢氧化钠溶液中配制0.25g/L铁氰化钾溶液；将吡啶硫胺素加入到0.1M盐酸溶液中配制0.1mM吡啶硫胺素溶液，4℃避光冷藏，测定当日用重量浓度为20％的甲醇溶液稀释配制100nM吡啶硫胺素溶液，设其浓度为Cs；将磷酸氢二钠加入到重量浓度为10％的甲醇溶液中配制25mmol/L磷酸氢二钠溶液；将磷酸二氢钠加入到重量浓度为70％的甲醇溶液中配制25mmol/L磷酸二氢钠溶液；

第二步：将第一步所得吡啶硫胺素溶液与铁氰化钾溶液以体积比25：3混合，以0.2um孔径过滤膜过滤得到标准溶液，采用高效液相色谱检测得到吡啶硫胺素的流出时间为5.3min和峰面积As为59.979，其中，色谱条件为：使用Kromasil C₁₈色谱柱(φ4.6×150mm，5μm，Dikma Technologies)，进样量20uL，以第一步所得磷酸氢二钠溶液和磷酸二氢钠溶液分别为第一流动相和第二流动相，荧光检测激发波长为385nm、发射波长为460nm，以流速1.0mL/min梯度洗脱，所述梯度洗脱流程为：

 

时间流动相组成(体积百分数)0min100％第一流动相1.5min87.5％第一流动相和12.5％第二流动相4min50％第一流动相和50％第二流动相6min100％第二流动相

第三步：将血液样本避光解冻后，在血液样本中加入等体积的乙腈，振荡15s，以转速15000rpm离心15min，取上清液以转速15000rpm再次离心15min，取上清液常温旋转蒸干，用重量浓度为20％的甲醇溶液滴定至血液样本相同体积。以体积比25：3与第一步所得铁氰化钾溶液混合，以0.2um孔径过滤膜过滤得到样品溶液，采用与第二步相同的色谱条件检测样品溶液，得到与吡啶硫胺素的流出时间对应的峰面积Ai为23.648，按下式计算血液中吡啶硫胺素的浓度Ci：

Ci＝Cs·(Ai/As)＝39.42nM

实施例2

另一种高效液相色谱检测血液中吡啶硫胺素含量的方法：

第一步：将血液在-80℃保存；将铁氰化钾加入到150g/L氢氧化钠溶液中配制0.25g/L铁氰化钾溶液；将吡啶硫胺素加入到0.1M盐酸溶液中配制0.1mM吡啶硫胺素溶液，4℃避光冷藏，测定当日用重量浓度为20％的甲醇溶液稀释配制100nM吡啶硫胺素溶液，设其浓度为Cs；将磷酸氢二钠加入到重量浓度为10％的甲醇溶液中配制25mmol/L磷酸氢二钠溶液；将磷酸二氢钠加入到重量浓度为70％的甲醇溶液中配制25mmol/L磷酸二氢钠溶液；

第二步：将第一步所得吡啶硫胺素溶液与铁氰化钾溶液以体积比25：3混合，以0.2um孔径过滤膜过滤得到标准溶液，采用高效液相色谱检测得到吡啶硫胺素的流出时间和峰面积As为24.778，其中，色谱条件为：使用Kromasil C₁₈色谱柱(φ4.6×150mm，5μm，DikmaTechnologies)，进样量20uL，以第一步所得磷酸氢二钠溶液和磷酸二氢钠溶液分别为第一流动相和第二流动相，荧光检测激发波长为385nm、发射波长为460nm，以流速1.0mL/min梯度洗脱，所述梯度洗脱流程为：

 

时间流动相组成(体积百分数)0min100％第一流动相1.5min87.5％第一流动相和12.5％第二流动相4min50％第一流动相和50％第二流动相6min100％第二流动相

第三步：将血液样本避光解冻后，在血液样本中加入等体积的重量浓度为10％的三氯乙酸溶液，振荡15s，以转速13000rpm离心5min，取上清液以转速13000rpm再次离心5min，取上清液加入水饱和甲基叔丁基醚洗涤，取下层溶液，重复洗涤一次，取下层溶液以体积比25：3与第一步所得铁氰化钾溶液混合，以0.2um孔径过滤膜过滤得到样品溶液，采用与第二步相同的色谱条件检测样品溶液，得到与吡啶硫胺素的流出时间对应的峰面积Ai为9.347，按下式计算血液中吡啶硫胺素的浓度Ci：

Ci＝Cs·(Ai/As)＝37.72nM