公开/公告号CN101516394A
专利类型发明专利
公开/公告日2009-08-26
原文格式PDF
申请/专利权人 皮埃尔法布雷医药公司;
申请/专利号CN200780035523.8
申请日2007-09-27
分类号A61K39/00(20060101);C07K16/00(20060101);C07K16/30(20060101);
代理机构11314 北京戈程知识产权代理有限公司;
代理人程伟
地址 法国布洛尼-比扬古
入库时间 2023-12-17 22:36:00
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2018-09-14
未缴年费专利权终止 IPC(主分类):A61K39/00 授权公告日:20140730 终止日期:20170927 申请日:20070927
专利权的终止
2014-07-30
授权
授权
2009-10-21
实质审查的生效
实质审查的生效
2009-08-26
公开
公开
本发明涉及制备用于治疗和/或诊断目的的特别的单克隆抗体的新 型方法。更特别的是，本发明的目的在于制备针对在原发肿瘤的肿瘤 细胞表面缺失而在这些原发肿瘤的抗肿瘤治疗之后将出现的肿瘤抗 原，以及也可能参与形成肿瘤对于抗肿瘤治疗的耐药性的抗原的抗体。 本发明还包含这些抗体以及这些抗体用作耐药肿瘤的预防性和/或治疗 性治疗的药物的用途。本发明最后包含含有这种可与抗癌制剂联合使 用的抗体的组合物及其预防和/或治疗某些癌症的用途。
抗体的发现和更特别的制备抗体的方法的发展构成在治疗性治疗 或诊断和更特别的在癌症范围内的变革。的确，首次，这种新的工具 因其抗体本身的识别特性提供靶向治疗的可能性。这最后十年的主要 挑战由开发制备抗体的方法构成，在第一阶段是多克隆抗体，单克隆 抗体或甚至是抗体片段或类似结构。
直到今天，为了能够制备用于治疗性和/或诊断性目的的抗体，本 领域技术人员已开发出一些技术。
最早的抗体为多克隆抗体，即免疫的动物血清中包含不同来源的 抗体群体。为了做到这一点，几种动物(小鼠、大鼠、家兔、山羊等) 通过注射给定天然或合成抗原，与一种或多种佐剂，如Freund佐剂和 氢氧化铝而免疫接种，佐剂的目的在于促进和增强免疫反应。然后采 集这些动物的血，并回收既含有能或多或少有效识别抗原的几种表位 的抗体(多克隆抗体)也含有动物的其它抗体的血清或抗血清。例如 通过亲和层析纯化法将获得的抗体进行纯化。
第一个发展存在于根据KOHLER和MIELSTEIN(1975)所述的技 术从杂交瘤中制备单克隆抗体。该技术使预定抗原的特异性单克隆抗 体得以产生，并由B淋巴细胞克隆与骨髓瘤细胞融合以获得称为杂交 瘤的细胞。这种杂交瘤不仅具有永生化的特征而且还可以永久性产生 单克隆的并因此是单一特异性的抗体。
也描述过其它基于同一原理的技术，如三源杂交瘤技术或甚至依 旧是KOZBOR等人(1983)描述的杂交瘤技术。
这些一开始用于制备鼠抗体的技术已进展到可以制备人源化或人 的嵌合抗体。今天所有这些技术已被本领域技术人员所熟知。
通过使用基因修饰的小鼠，所谓“异种小鼠”(专利US 5,814,318 和US 5,939,598所述)的技术可获得人抗体。
还开发出其它新方法用于制备人单克隆抗体和更特别地制备抗体 片段，如使用RIDDER等人(1995)所述的噬菌体库或文库的技术或所 谓的“噬菌体显示”技术，其基于抽提来自外周血的人类细胞的mRNA， 构建包含各种区的序列的cDNA库或文库，并将cDNA插入噬菌体中 以产生各种如片段、优选Fab片段的抗体区。
尽管这些方法不同，但都有相同的特征，即，用已知抗原免疫接 种或在文库或库的范围内用该同一已知和限定的抗原筛选这些库。
本发明区别于上述方法的是，不再用已知和限定抗原而是直接用 全部或部分肿瘤抗原。更特别的是，本发明指向直接使用肿瘤的裂解 物和/或悬浮物和/或磨碎细胞匀浆。在治疗癌症中，数年来已观察到一 些数量的患者在首次接受治疗性治疗之后已经发展出完全的和良好的 反应之后，易于复发。更加特别的是，已知肿瘤能够修饰其基因型和/ 或其表型以抵抗作用于它们的不同治疗。
这种现象存在于放射治疗、化学治疗和用单克隆抗体的治疗。
历史上，治疗癌症的第一个化学治疗化合物是20世纪40年代进 行的临床试验。这些化合物主要是半衰期短的制剂，如皮质激素、抗 叶酸素或者甚至是长春花生物碱。然而，甚至达到完全缓解时，后者 一般不能持续一年以上而出现系统性复发，复发与肿瘤对用于治疗的 化学治疗化合物的耐药有关(Lehnert M.，Eur.J.Cancer，1996， 32A：912-920)。
对该这种现象的反应，通过使用各种抗肿瘤化合物进行所谓的“联 合”治疗受到关注。通过同时或先后使用不同化合物，实际上获得了较 好的结果。事实上，说到使用不同的抗肿瘤化合物，每种具有细胞毒 活性但作用机制不同，对于化合物耐药的肿瘤细胞可依旧对至少一种 所用的其它化合物敏感。
然而，尽管使用不同抗肿瘤化合物或制剂，肿瘤的耐药在化学疗 法治疗领域内仍然是主要问题。联合使用有延迟耐药现象出现的效果， 但不能使其消失。对化学疗法药物的耐药，与最初治疗有关的耐药或 出现在良好的最初反应之后的复发之时的耐药，实际上出现在所有所 谓的“可治疗的”癌症上。
作为例子，要提及专利申请WO 2005/077385，WO 2004/026293或 者甚至是WO 2004/110497，这些专利申请很好地解释了寻找控制耐药 现象的新方法，所有这些申请基于额外注射新型一般化学分子的原理。
已证明其它在最初对治疗敏感的肿瘤获得耐药性的机制。最广泛 认可的假设提示这种耐药现象可能是肿瘤细胞的基因型发生了自发的 和随机进行的体细胞突变的积聚的结果(Cancer Chemotherapy and Biotherapy：Principles and practice，Chabner&Lango editors，1996， chapter 1)。
另一已知的和描述过的耐药现象，称为“MDR”(多重药物耐药)， 基于肿瘤细胞在使用致死量浓度的大量的药理上、化学上、或甚至是 结构上不同的细胞毒性化合物而依旧存活的能力。这些显示出“MDR” 的细胞其胞内细胞毒性化合物的积聚因为通过转运蛋白将所述化合物 排出而减少。这些蛋白质，称为“多重药物转运蛋白”，是能够将多种 毒性分子从细胞排出的膜蛋白。这些“多重药物转运蛋白”属于其活性 利用ATP水解释放的能量的转运蛋白的“ATP结合盒(ABC)超家族”。 已揭示几种解释这种“MDR”的几种机制。参与如与依赖于ATP的排出 机制相关的耐药的最已知和证明最多的基因是MDR1基因。
与化学疗法治疗诱导的这些耐药现象同时发生的，用单克隆抗体 治疗后出现诱导性耐药也被描述。这种耐药可与宿主的本性，与药理 学原因或别的原因相关。它对于实际所患肿瘤是本质性的。
首先，第一次使用鼠抗体相关抗体，结果是抗体抗所述鼠抗体的 应答，所谓的HAMA(人抗小鼠抗体)应答。这种与宿主相关的耐药 形式通过不再使用鼠类而是使用人或人源化抗体而得到部分解决。
使用这种人或人源化抗体的不同试验证明了肿瘤可对免疫治疗耐 药的新现象。这些新机制主要基于肿瘤上诱导性突变，在靶抗原的剪 切(或脱落)或甚至是丧失表达之后受体的组成型激活。
由于在此后的实施例1中这是明显的，例如申请人进行的研究表 明，用抗-IGF-IR、EGFR和Her/2neu三联疗法，可能显著地抑制裸鼠 体内A549细胞肿瘤的生长直至肿瘤完全消失，这种现象出现在90％ 受治动物身上。尽管多重疗法比单一疗法或双重疗法明显有效，但是 似乎是那些被完全抑制的肿瘤尽管继续治疗，仍然逐渐再度出现：这 些肿瘤形成对多重治疗的耐药。
根据以上观察，申请人首次考虑直接使用这种耐药肿瘤制备抗体， 优先是能够识别抗原的治疗性和/或诊断性单克隆抗体，这些抗原在对 抗肿瘤治疗耐药的肿瘤的肿瘤细胞表面的表达可被诱导，并且这些抗 原在原发(未经治疗)肿瘤的肿瘤细胞表面不表达，这些抗原也可参 与肿瘤对抗肿瘤治疗的耐药。
根据第一方面，所以本发明的目标是将对至少一种抗肿瘤化合物 耐药的肿瘤的粉碎的组织匀浆和/或悬浮液和/或细胞裂解液用于免疫 接种并制备在体外直接抗在所述耐药肿瘤的肿瘤细胞表面表达的肿瘤 抗原的抗体或其功能片段之一，该肿瘤抗原优选在耐药肿瘤的原发肿 瘤的肿瘤细胞表面不表达，该肿瘤抗原可能参与所述肿瘤对抗肿瘤化 合物的耐药。
术语“粉碎的组织匀浆”或“细胞匀浆”是指来自肿瘤(接受治疗的出 现肿瘤复发的患者的异种移植物、正位移植物(orthotopic graft)、同 系移植物、手术标本或细胞培养物)的通过机械分离获得的，如通过 例如“Potter”型超声粉碎机，Ultraturax型粉碎机等分离获得的细胞 和/或细胞碎片的混合物。
术语“悬浮液”或“细胞悬浮液”是指在治疗存在或缺失的情况下体 外培养后获得的和通过酶溶液或非酶分离溶液将细胞从支持物上分离 下来的细胞的悬浮液。
术语“裂解液”或“细胞裂解液”是指通过酶分离而获得的细胞和/或 细胞碎片的混合物，该细胞和/或细胞碎片来自肿瘤(接受治疗的出现 肿瘤复发的患者的异种移植物、正位移植物(orthotopic graft)、同系 移植物、手术标本或细胞培养物)。
术语“耐药肿瘤”是指对应用的治疗没有反应或不再发生反应的肿 瘤。如上所述，在化学疗法、放射疗法、激素疗法治疗之后还是甚至 特别是使用抗体之后，可观察到这种耐药性，这些治疗方法可单独应 用或者联合应用。至今为止，关于这种耐药能力的根本原因的各种机 制是已知或未知的。最终，这种耐药性通过初始应用的治疗的有效性 的下降或丧失而表现出来。
当然，已知的和所述的“逃逸”现象是本发明寻求控制的耐药现象 的一部分。
术语原发肿瘤(或原生肿瘤)是指指定的来自耐药肿瘤的肿瘤， 不对原发肿瘤进行任何与耐药肿瘤相反的治疗。
肿瘤抗原是指特别是那些在肿瘤细胞表面表达的抗原，无论它们 是来自于原发肿瘤还是来自于耐药肿瘤，该肿瘤抗原在健康细胞表面 不表达。这些肿瘤抗原一般而言是抗体可特异性结合的天然大分子(可 合成)。特别地，肿瘤抗原可是多肽、多糖、碳水化合物、核酸、脂类、 半抗原或任何其它在肿瘤细胞表面天然存在的化合物。
最终，本文中术语“抗体”或“免疫球蛋白”在最广义范围内可互换使 用并包含单克隆抗体(例如整个或完整单克隆抗体)，多克隆抗体、多 价抗体、多特异性抗体(例如表现出目的生物学活性的双特异性抗体)。 嵌合抗体或人源化抗体也包含在这个指定中。
更加特别的是，这种分子为包含通过二硫键连接在一起的两条重 链(H)和两条轻链(L)的糖蛋白。每条重链由重链可变区(或结构 域)(HCVR或VH)和重链恒定区构成。重链的恒定区包含三个结构 域CH1、CH2和CH3。每条轻链由轻链可变区(或结构域)(LCVR或 VL)和轻链恒定区构成。重链恒定区包含LC结构域。VH和VL区可 细分成称为CDR(互补性决定区)的高变区，称为构架区(FR)的多 个保守区插入其中。每个VH和VL由三个CDR和四个FR构成，从 氨基末端至羧基末端以下列顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、 CDR3、FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。 抗体恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系 统的不同细胞(例如效应细胞)和首次成分(C1q)或标准补体系统。
它们还可能包含某些就免疫球蛋白(IgG、IgE、gM、IgA等)的 类型或来源而言表现出所期望的亲合力和特异性的抗体片段(更加详 细描述的术语)。
作为规则，制备特别是鼠源的单克隆抗体或其功能片段可参照特 别是“抗体”手册所述的技术(Harlow和Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor NY，pp.726， 1988)或参照Kohler et Milstein(Nature，256：495-497，1975)所述的杂交 瘤的制备技术。
根据本发明，在寻求制备的抗体之中，优选上述限定的抗体和所 谓的“活性”抗体，即具有针对抵抗治疗的肿瘤细胞的抗肿瘤活性的抗 体。
根据本发明和发明的特定方面，在寻求制备的抗体之中，优选上 述限定的抗体和那些还能够表现出针对具有攻击表型的肿瘤抗原的抗 肿瘤活性，具有攻击表型的肿瘤天然(治疗前)表达这些抗体针对的 抗原。
在第一具体实施方式中，根据本发明的用途的特征在于所述耐药 肿瘤通过对即将或已经接受治疗性处置的患者进行活检和/或手术的方 式直接获得，该治疗性处置采用所述至少能够诱导耐药的或者对于该 化合物肿瘤对其的耐药性确定的抗肿瘤化合物。
在该具体实施方式中，对每个患者的治疗可这样来考虑：抗体是 根据本发明用来自实际患者的全部或部分耐药肿瘤进行免疫接种所诱 导的免疫应答产生的。可因此而考虑对患者的体外订制性治疗。
在第二具体实施方式中，根据本发明的用途的特征在于所述耐药 肿瘤是通过将肿瘤细胞系和/或全部或部分人体肿瘤移植到动物体内而 后通过给药尤其是通过注射至少一种抗肿瘤化合物(期望该化合物诱 导或确定耐药性)对动物进行治疗而诱导产生。
更特别的是，所述至少一种抗肿瘤化合物选自化学疗法制剂如化 学分子或甚至是治疗性抗体或甚至是放射疗法制剂。
一般地，在本说明书的全部内容中，“抗肿瘤制剂”或“抗癌治疗剂” 是指单独用于对患者的给药时，能够治疗或预防患者癌症进展的物质。
作为这种制剂的非限制性的例子，可提及所谓的“细胞毒”制剂， 如“烷化”剂、抗代谢剂、抗肿瘤的抗生素、有丝分裂抑制剂、染色质 功能抑制剂、抗血管生成剂、抗雌激素剂、抗雄激素剂或免疫调节剂。
这些制剂作为例子在2006版VIDAL中，专指癌症学和血液病学 相关化合物中“细胞毒制剂”栏提及，这些在这份资料中作为参考提及 的细胞毒化合物在本文中提及作为优选的细胞毒制剂。
“烷化剂”是指任何在细胞内可与任何分子共价偶联或使任何分子 烷基化的物质，其中任何分子优选核苷酸(如DNA)。作为这种烷化 剂的例子，可提及氮芥类，如双氯乙基甲胺、苯丁酸氮芥、苯丙氨酸 氮芥、盐酸盐、溴丙哌嗪、松龙苯芥、磷酸氢二钠或磷雌氮芥； oxazaphosphorine类，如环磷酰胺、六甲密胺、氯乙环磷酰胺、磺基磷 酰胺(sulfofosfamide)或异磷酰胺；氮丙啶或氮杂环丙烷类，如三胺 硫磷、三亚乙基二胺或六甲密胺；亚硝基脲类如氯乙亚硝脲、链脲霉 素、福替目丁(fotemustine)或环己亚硝脲；烷基磺酸盐类如二甲磺酸 丁酯(busulfan)、丁四醇磺酯(treosulfan)或英丙舒凡(improsulfan)； 三氮烯类如二甲三氮咪唑酰胺；或甚至铂合成物如顺铂、奥克赛铂或 碳铂。
“抗代谢剂”是指通过干预某些活性，尤其是通过干预DNA合成活 性而阻断生长和/或细胞代谢的物质。作为抗代谢剂的例子，甲氨蝶呤、 5-氟尿嘧啶、氟尿嘧啶脱氧核苷、5-氟脱氧尿嘧啶、卡培他滨 (capecitabine)、阿糖胞苷、氟达拉滨(fludarabine)、胞嘧啶阿糖胞 苷(cytosine arabinoside)、6-巯基嘌呤(6-MP)、6-硫代鸟嘌呤(6-TG)、 2-氯脱氧腺苷、5-氮杂胞苷、2，2-二氟脱氧胞嘧啶核苷、2-氯脱氧腺苷、 脱氧助间型霉素(deoxycoformycine)和喷司他丁(pentostatin)。
“抗肿瘤抗生素”是指可阻止或抑制DNA、RNA和/或蛋白质合成 的化合物。这种抗肿瘤抗生素的例子包含阿霉素、柔红霉素、去甲氧 柔红霉素、戊柔比星(valrubicin)、米托蒽醌、更生霉素、光辉霉素、 丝裂霉素C、博莱霉素和甲基苄肼。
“有丝分裂抑制剂”阻止细胞周期和有丝分裂的正常推进。一般的 微管抑制剂或“taxoids”，如紫杉醇和紫杉萜，能够抑制有丝分裂。长春 药属类生物碱类如长春碱、长春新碱、长春花碱酰胺和长春瑞滨，也 能抑制有丝分裂。
“染色质功能抑制剂”或“拓扑异构酶抑制剂”是指抑制染色质建模 蛋白(the chromatin-modeling protein)，如拓扑异构酶I和II的正常功 能的物质。这种抑制剂的例子包含，拓扑异构酶I的抑制剂有喜树碱及 其衍生物如依立替康(irinotecan)或托泊替康(topotecan)，拓扑异构 酶I的抑制剂有鬼臼乙叉甙(etoposide)、磷酸鬼臼乙叉甙和鬼臼噻吩 甙。
“抗血管生成剂”是指任何抑制血管生长的药物、化合物、物质或 制剂。抗血管生成剂的例子包含，无任何限制，丙亚胺、马马司他、 巴马司他、普啉司他、坦诺司他、伊洛马司他、CGS-27023A、溴氯哌 喹酮、COL-3、新伐司他、BMS-275291、沙立度胺、CDC 501、DMXAA、 L-651582、角鲨胺、内皮他丁、SU5416、SU6668、α-干扰素、EMD121974、 白细胞介素-12、IM862、血管抑素、vitaxin。
“抗雌激素”或“抗雌激素制剂”是指任何减少、拮抗或抑制雌激素的 活性的物质。这类制剂的例子有他莫昔芬、托瑞米芬、雷洛昔芬，屈 洛昔芬、爱多昔芬(iodoxyfene)、阿那托唑、来曲唑和依西美坦。
“抗雄激素”或“抗雄激素制剂”是指任何减少、拮抗或抑制雄激素 活性的物质。抗雄激素剂的例子有缓退瘤、尼鲁米特、比卡鲁胺、螺 内酯、醋酸环丙氯地孕酮、非那司提和甲氰咪胍。
免疫调节剂是刺激免疫系统的物质。这种免疫调节剂的例子包含 下列与5-氟尿嘧啶联合应用的和其它类型免疫调节剂：干扰素、白细 胞介素类如阿地白介素、OCT-43、地尼白介素毒素连接物(denileukin diflitox)或白介素-2、肿瘤坏死因子如他索纳明(tasonermin)或如蘑 菇多糖、西佐喃(sizofiran)、罗喹美克(roquinimex)、匹多莫德 (pidotimod)、甲氧聚乙二醇琥珀酰胺腺甙脱氨酶(pegademase)胸 腺喷丁、多聚肌苷酸:多聚胞苷酸(poly I:C)或左旋咪唑。
对于更多细节，本领域技术人员可参考Associationdes Enseignants de Chimie Thérapeutique编辑的名为“traitéde chimie thé rapeutique，Vol.6，Médicaments antitumoraux et perspectives dans le traitement des cancers，édition TEC&DOC，2003”的手册。
作为抗肿瘤制剂，还可提及放射疗法制剂、激素疗法制剂或以小 分子为靶的治疗剂如酪氨酸激酶抑制剂。最后，根据优选具体实施方 式，抗体属于根据本发明可使用的抗肿瘤制剂的一部分。更特别地， 可提及下列抗体作为非限制性实施例：抗EGFR抗体如西妥昔单抗 (cetuximab)(C225或爱必妥(erbitux))、matuzumab、huR3、 HuMax-EGFR或panitumab；抗VEGF抗体如贝伐单抗(bevacizumab) (Avastin)或2C3；抗IGF-IR抗体，如7C10、h7C10、hEM164、 ABX-IGF-IR、Mab 39、1H7或4G11；抗HER2抗体，如曲妥单抗 (trastuzumab)(Herceptin)或pertuzumab；抗CD20抗体，如 commerituximab、ibritumomab或托西莫单抗(tositumomab)；抗CD33 抗体如吉姆单抗(gemtuzumab)或林妥珠单抗(lintuzumab)；抗CD22 抗体例如依帕珠单抗(epratuzumab)；抗CD52抗体例如alemtuzumab； 抗EpCAM抗体，如依决可单抗(edrecolomab)、Ch 17-1A或IGN-101； 抗-CTP21或16抗体，如Xactin；抗DNA抗原抗体，如131I-Cotara TNT-1； 抗MUC1抗体，如pemtumomab或R1150；抗MUC18抗体，如 ABX-MA1；抗GD3抗体，如米妥莫单抗(mitumomab)；抗CEA抗 体，如CeaVac或labetuzumab；抗CA125抗体，如OvaRex；抗HLA-DR 抗体，如apolizumab；抗-CTLA4抗体，如MDX-010；抗PSMA抗体， 如MDX-070、111In&90Y-J591、177Lu J591、J591-DM1；抗Lewis Y抗 体，如IGN311；抗血管生成抗体，如AS1405和90YmuBC1；抗-Trail-R1 抗体，如TRAIL R1单抗或TRAIL R2单抗；或者甚至除上述抗体外 任何针对酪氨酸激酶受体的抗体，或针对RON、cMET、CXCR 2、 CXCR4，Ephrin类型的受体等，对于使用如酪氨酸激酶抑制剂的小化 学分子的靶向治疗是同样的。
当然，该列表绝不限制仅是提及迄今为止在用的或研究中的抗体 的目的。
根据本发明的特定具体实施方式，应注意所述耐药肿瘤是对几种 治疗方法或抗肿瘤制剂抵抗，其中后者可具有各种特性。
更加特别的是，根据本发明的用途的特征在于所述至少一种抗肿 瘤化合物由至少两种，优选至少三种具有不同特性和/或不同作用机制 和/或靶蛋白不同的化合物构成。
作用机制不同是指例如抗肿瘤制剂能改变细胞的不同生物学功 能，如改变血管生成、DNA合成或甚至是有丝分裂的功能。
靶蛋白不同更加特别是指当抗肿瘤制剂是能够结合具有不同特性 的蛋白或受体时的情况。
相当明显地，可注意仅抗体彼此联合应用，或者仅化学疗法制剂 彼此联合应用或这两种家族的化合物彼此联合应用或与放射疗法、激 素疗法治疗或使用如上所述的小化学分子的靶向治疗联合应用。
尽管优选，全部抗肿瘤化合物都具有不同的作用机制或靶点也还 是不需要的。
根据第二方面，本发明的目标是体外制备抗体或其中一个功能片 段的方法，该抗体或其中一个功能片段针对在对至少一种抗肿瘤化合 物耐药的肿瘤细胞表面表达的肿瘤抗原，所述肿瘤抗原优选在相应原 发肿瘤(未经治疗)的肿瘤细胞表面不表达，并且所述肿瘤抗原可能 参与所述对抗肿瘤治疗耐药的肿瘤的耐药性的形成，该方法包含由直 接用耐药肿瘤的磨碎的组织匀浆和/或悬浮液和/或细胞裂解液免疫接 种动物构成的步骤和由选择识别耐药肿瘤而不识别形成耐药肿瘤的原 发肿瘤的抗体构成的步骤。
根据本发明所述方法的特定方面，描述了体外制备抗体或其中一 个功能片段的方法，该抗体或其中一个功能片段针对在肿瘤细胞表面 表达的可能参与所述肿瘤的耐药性的形成的肿瘤抗原，该方法构成如 下：用来自原发肿瘤(尚未接受任何治疗的肿瘤)的磨碎的组织匀浆 和/或悬浮液和/或细胞裂解液为动物进行免疫接种之后，无论动物耐受 或不耐受，均用来自耐药肿瘤的磨碎的组织匀浆和/或悬浮液和/或细胞 裂解液为动物进行免疫接种，其中所述耐药肿瘤对所述至少一种抗肿 瘤化合物(肿瘤对其的耐药是确定的或期望诱导耐药性的抗肿瘤化合 物)耐药。这种用环磷酰胺类型的免疫抑制剂进行的耐受的目的是在 以诱导耐药性为目的的抗肿瘤治疗应用于动物或人之前或在与人类有 关的治疗范围内去除针对所有出现的表面抗原的免疫应答。因此，给 药后的免疫应答，特别是注射耐药肿瘤的制剂之后的免疫应答，将集 中在治疗诱导的表面结构上并潜在地参与肿瘤耐药性的形成。通过随 后用来自原发肿瘤的肿瘤细胞接种动物后形成的血清滴度的消失评价 耐受的效率。
然后，对根据上述方法接种的小鼠的脾脏取样并根据本领域技术 人员已知的标准方法将脾细胞与骨髓瘤细胞融合。
细胞融合之后，在预先制备好的带有(未治疗的)“原发肿瘤”切 片和耐药肿瘤(用抗肿瘤制剂单处理或多处理)切片的载玻片上通过 “鉴别性免疫组织化学”筛选获得的杂交瘤。仅将产生识别耐药肿瘤而 不识别原发肿瘤的抗体的杂交瘤选择出来，克隆并冷冻以产生抗体并 测试其抗肿瘤活性。该方法的全部内容如下文的图2和3所示。应注 意这种方法也可用于寻找和鉴定细胞内耐药分子。
根据本发明，上文限定的抗体优选是可根据本领域技术人员所熟 知的标准方法获得的特异性，特别是鼠的，嵌合或人源化单克隆抗体。
一般地，制备单克隆抗体或其功能片段，尤其是鼠源抗体可参考 特别是手册“抗体”(Harlow和Lane，Antibodies：A Laboratory Manual， Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor NY，pp.726，1988)中 所描述的技术或参考Kohler和Milstein(Nature，256：495-497，1975)描述 的由杂交瘤制备抗体的技术。
根据本发明的抗体也包括嵌合抗体或人源化抗体。
嵌合抗体是指包含来自特定物种抗体的天然变异(轻链和重链) 区联合所述特定物种(小鼠、马、家兔、犬、牛、雌鸟等)异源的物 种的抗体的恒定轻链和重链区的抗体。
根据本发明的抗体或其嵌合型片段可用基因重组技术制备。例如， 嵌合抗体可通过克隆化包括根据本发明的非人的，尤其是鼠的单克隆 抗体的启动子和可变区的编码序列和人抗体恒定区序列的重组DNA 而制备。例如，这种重组基因编码的本发明的嵌合抗体是小鼠-人构建 体，这种抗体的特异性由来自鼠DNA的可变区决定；其同种型由来自 人DNA的恒定区所决定。嵌合抗体的制备方法可参考例如Verhoeyn 等人的文献(BioEssays，8：74，1988)，Morrison等人(Proc.Natl.Acad.Sci. USA 82：6851-6855，1984)或美国专利4,816,567。
人源化抗体是指包含源自非人起源的CDR区和源自一种或多种人 的抗体的抗体分子的其它部分。此外，构架区(FR)的一些残基可被 置换以保留结合亲合力(Jones等人，Nature，321：522-525，1986； Verhoeyen等人，Science，239：1534-1536，1988；Riechmann等人，Nature， 332：323-327，1988)。
根据本发明的人源化抗体或其片段可通过本领域技术人员所知的 技术制备(如例如文献Singer等人，J.Immun.150：2844-2857，1992； Mountain等人，Biotechnol.Genet.Eng.Rev.，10：1-142，1992；或 Bebbington等人，Bio/Technology，10：169-175，1992中所述的技术)。
其它人源化技术也是本领域技术人员所知的，如例如PDL所述的 “CDR移植”技术，是专利EP 0451261、EP 0682040、EP 0939127、 EP 0566647或者US 5,530,101、US 6,180,370、US 5,585,089和US 5,693,761的主题。专利US 5,639,641或者US 6,054,297、US 5,886,152 和US 5,877,293也提及了该技术。
根据本发明的抗体的功能片段，如Fv、scFv(对于单一链是sc)、 Fab、F(ab′)2、Fab′、scFv-Fc片段或双体，或任何半衰期经过化学修饰 延长的抗体片段，这些化学修饰如增加多(烷基)乙二醇如聚乙烯乙 二醇“PEG化”或通过使其进入溶酶体中。一般地，所述片段至少有一 个来源抗体的特征性CDR，并一般能表现出甚至来源抗体的部分活性。
优选地，所述功能片段构成自或包含其来源抗体的重链或轻链可 变链的部分序列，所述部分序列足以保留与其来源抗体相同的结合特 异性和足够的亲合力，其长度优选至少等于其来源抗体序列长度的 1/100，更优选至少1/10。
这种功能片段最少包括其来源抗体序列的5个氨基酸，优选10、 15、25、50和100个连续氨基酸。
优选地，这些抗体片段是Fv、scFv、Fab、F(ab′)2、F(ab′)、scFv-Fc 型或双体一般具有与其来源抗体相同的结合特异性。根据本发明，本 发明所述的抗体片段可获自如前所述的抗体通过如酶切消化(如胃蛋 白酶或番木瓜蛋白酶)和/或通过化学还原打开二硫键的方法获得的片 段。另一种方式，本发明包含的抗体片段可通过本领域技术人员所熟 知的基因重组技术获得或这通过多肽合成技术，即通过如Applied Biosystems等提供的自动化多肽合成仪的方式获得。
更优选的是，本发明包含抗体，或其根据本发明的功能片段，尤 其是通过基因重组或化学合成获得的嵌合或人源化抗体及其片段。
根据本发明所述的方法的优选具体实施方式，所述免疫接种通过 腹腔和/或皮下和/或静脉和/或脾下注射进行。每种免疫接种的方式可互 换，选择一种方式而不是另一种方式是根据所用的动物和本领域技术 人员的知识和实践。
更特别的是，根据第一具体实施方式，产生的肿瘤是直接通过对 正在接受或已接受用至少一种能诱导耐药性的或对其的耐药性已确定 的抗肿瘤化合物的治疗性处置的患者区活检和/或手术而获得。
根据第二具体实施方式，耐药肿瘤通过将肿瘤细胞系和/或全部或 部分人的肿瘤移植到动物身上，并为该动物注射至少一种期望其诱导 耐药性或确定对其的耐药性明确的抗肿瘤化合物而诱导产生。
无论上述优选的具体实施方式，本发明所述的方法的特征在于所 述活性抗体或其中一个功能片段是单克隆抗体。
更特别的是，所述单克隆抗体或其中一个功能片段是选自IgG、 IgA、IgM、IgD或IgE的免疫球蛋白。
甚至更优选的是，所述单克隆抗体或其中一个功能片段是γ1、γ2 或γ4同种型IgG。
然而，应理解根据本发明，IgG1和IgG2型免疫球蛋白因其诱导效 应细胞功能的特性而是优选的。
一般地，本领域技术人员将意识到效应子功能包含，结合C1q、 CDC(补体依赖的细胞毒活性)，结合Fc受体、ADCC(抗体依赖的细 胞的细胞毒活性)和吞噬作用作为非穷举性例子。
更加特别的是，本发明所述的优选的效应子功能是ADCC和CDC。
一般地，本发明所指的功能片段选自片段Fv、Fab、(Fab′)2、Fab′、 scFv、scFv-Fc和双体，或任何半衰期延长的片段，如PEG化的片段。
以更加特异性但绝不限制性的方式，本发明所述的方法至少包含 下列步骤：
i)用来自耐药肿瘤的磨碎的组织匀浆和/或悬浮液和/或细胞裂解液 直接免疫动物；
ii)将步骤i)中免疫过的动物的脾细胞与骨髓瘤细胞融合以获得 杂交瘤；和
iii)通过鉴别选择方法选出分泌特异性识别耐药肿瘤的肿瘤细胞表 面表达的通过抗肿瘤治疗诱导产生的抗原的抗体的杂交瘤。
“鉴别选择法”是指任何基于可鉴定诱导型抗原的方法的选择方 法，诱导型抗原相对于那些在耐药性产生之前就已存在于细胞上的抗 原而言，是对治疗产生耐药性的抗原。
能够进行这种“鉴别选择法”的技术的非限制性的例子有在冰冻切 片或石蜡包埋切片上进行免疫组织化学的方法或“蛋白质芯片”或“基因 芯片”的方法。
更特别的是，优选使用所谓的“组织芯片”技术。包含“组织芯片” 技术，将冰冻或石蜡包埋的的组织块，新的组织块包含数十至数百这 些组织的核心，以致能在将这些用于“组织芯片”的组织块切片后固定 包含数十至数百组织切片的显微镜玻片。
根据优选具体实施方式，本发明所述的方法在上述步骤i)之前进 一步包含下列步骤：
a)选择肿瘤细胞系和/或全部或部分所谓“原发”肿瘤，并将其移植 到动物体内；
b)用至少一种抗肿瘤化合物治疗部分接受移植的动物；
c)使步骤a)中接受移植的未经治疗的动物的全部或部分“原发”肿 瘤恢复；
d)使步骤b)中接受移植的接受治疗的动物的全部或部分耐药肿瘤 恢复；
e)制备来自分别在步骤c)和d)中完全或部分恢复的肿瘤的抗体的 鉴别选择法的手段；和
f)制备来自步骤d)中完全或部分恢复的耐药肿瘤的磨碎的组织匀 浆和/或细胞裂解液。
在本发明说明书中，应理解术语“原发肿瘤”和“原生肿瘤”是等同 的，并不区别使用。
根据本发明的具体实施方式，所述肿瘤细胞系和/或所谓的“原发” 肿瘤选自来自肺部的，而且以非限制性方式，选自结肠、前列腺、乳 腺、卵巢的肿瘤细胞(A549)，或任何治疗的耐药性明确的肿瘤。
此外，根据本发明所用的抗肿瘤化合物选自化学疗法试剂、放射 疗法试剂、化学分子或抗体，这些不同化合物的全部在本说明说中上 述部分定义。
根据本发明的具体实施方式，所述至少一种抗肿瘤化合物为单克 隆抗体，所述单克隆抗体更优选选自针对生长因子受体、血管生成相 关分子，或细胞迁移现象相关趋化因子和整合素的抗体或其功能片段。
“生长因子受体”是指任何与配基结合或配基构象发生独立性变 化，或与其它膜蛋白发生同源或异源二聚作用后介导增殖反应的跨膜 蛋白。“血管生成相关分子”是指任何与配基结合或配基构象发生独立 性变化，或与其它膜蛋白发生同源或异源二聚作用后导致血管形成的 膜蛋白受体。
“细胞迁移现象相关趋化因子和整合素”是指任何能够具有分解细 胞外基质的活性和/或化学-趋化活性的可溶性分子。
根据本发明的另一具体实施方式，该方法的特征在于所述至少一 种抗肿瘤化合物为至少两种优选至少三种特性不同和/或具有不同的作 用机制和/或靶点蛋白质不同的抗肿瘤化合物的联合使用。
优选地，所述抗肿瘤化合物的联合使用是单克隆抗体或其功能片 段的联合。
更优选地，所述单克隆抗体或其功能片段的联合是选自抗-IGF-IR、 抗-EGFR、抗-Her/2neu、抗-VEGF、抗-VEGFR、抗-CXCR、抗-cMET、 抗-RON、Ephrin、抗体等的抗体的联合。
根据具体实施方式，作为非限制性举例，本发明所述的方法的特 征在于所述联合是抗-IGF-IR抗体、抗-EGFR抗体和抗-Her/2neu抗体 的联合，所述提及的抗体优选分别构成自单克隆抗体7C10、225和 h4D5。
单克隆抗体7C10为专利申请WO 03/059951(于2003年1月20 日提交)中所述的抗体，将这些内容在此引入以供参考。
单克隆抗体225为ATCC保藏的编号为(HB-8508)的杂交瘤产生 的抗体。
单克隆抗体h4D5为可购得的herceptin，例如从ICR(Institut Claudius Regaud)购得。
根据更优选具体实施方式，本发明所述的方法的特征在于通过在 未治疗的所谓“原发”肿瘤组织和耐药肿瘤组织和/或诱导形成耐药的肿 瘤组织之间进行鉴别筛选来进行iii)的选择分泌不识别所谓“原发”肿瘤 细胞抗原的抗体的杂交瘤的步骤。
“鉴别筛选”是指通过相对于在形成治疗耐受之前出现在细胞上的 抗原而言对治疗产生耐受可筛选出诱导抗原。优选地，鉴别筛选通过 实施上述步骤e)的方法而进行。
最后，本发明所述的最后一个具体实施方式包含在步骤i)之前额 外的耐受步骤。
“耐受”是指通过使用如环磷酰胺的免疫抑制性化合物诱导免疫反 应的出现。实际上，所述耐受步骤可构成自：
-用来源于步骤c)的所谓原发肿瘤获得的磨碎的组织匀浆和/或悬 浮液和/或细胞裂解液给药，尤其是通过为动物注射的方式给药；和
-用免疫抑制剂处置这些动物以消除通过上述注射步骤激活的B细 胞并因此抑制任何潜在抗所述所谓原发肿瘤的应答。
当然，任何相似的方法或操作，或可获得相同结果的手段，应视 为与本发明等同或包含在本发明中。“免疫抑制剂”是指任何能够减少 免疫系统细胞数目的物质。作为非限制性实施例，可提及环磷酰胺。
在另一方面，本发明涉及体外制备和选择能够抑制肿瘤对抗肿瘤 化合物产生耐药的抗体或其其中一个功能片段的方法或体外制备和选 择针对在对至少一种抗肿瘤化合物耐药的肿瘤表面表达的肿瘤抗原的 抗体或其其中一个功能片段的方法，所述肿瘤抗原参与所述肿瘤对抗 肿瘤化合物耐药性的形成，该方法的特征包含：
a)体外制备本发明所述的抗体或其其中一个功能片段的方法，所述 抗体针对在耐药肿瘤表面特异性表达的所述肿瘤抗原，所述肿瘤抗原 在形成耐药肿瘤的原发肿瘤表面不表达；
b)将在步骤a)中获得的抗体在体外或体内与对抗肿瘤化合物耐药 的肿瘤接触；和
c)如果证明了所述抗体对肿瘤对抗肿瘤化合物的耐药性的抑制性 效应，选择该抗体。
根据另一具体实施方式，为了明确抗肿瘤治疗诱导抗原的表达是 否参与耐药现象的形成，可进行体外或体内试验。根据优选具体实施 方式，这个步骤可构成自体外或体内试验根据本发明的抗体对耐药性 肿瘤并观察耐药肿瘤的耐药抑制活性是否形成。
在另一方面，本发明涉及体外制备或选择能够表现出抗肿瘤活性， 尤其是抑制表达抗体针对的抗原的肿瘤细胞的增殖的抗体或其其中一 个功能片段的方法，其特征在于该方法包含：
a)体外制备抗体或其其中一个功能片段的方法，根据本发明，所述 抗体针对所述在耐药肿瘤表面特异性表达的肿瘤抗原，所述肿瘤抗原 在产生耐药肿瘤的原发肿瘤表面不表达；
b)使步骤a)中获得的抗体在体外或体内与其细胞表达所述肿瘤抗 原的肿瘤接触，优选与步骤a)中使用的所述耐药肿瘤接触或与具有浸 润表型的肿瘤接触；和
c)如果证实所述抗体在该肿瘤上的抗肿瘤效应，尤其是抑制该肿瘤 细胞增殖增殖的效应，选择该抗体。
在上文中的方法的步骤b)中，应理解其细胞表面表达所述肿瘤抗 原的肿瘤不必是对已用作制备所述抗体的抗肿瘤化合物耐药的肿瘤。 任何肿瘤，尤其是浸润表型的肿瘤，其肿瘤细胞表达所述抗体识别的 肿瘤抗原可用于步骤b)中。
本发明还明显地涉及使用上述方法制备治疗性和/或诊断性单克隆 抗体。本发明还包括本领域技术人员为了符合特定标准或而开发该方 法的部分应用或本发明说明书进行别的相当简单的改动。根据本发明 的第三方面关注通过实施上述本发明所述的方法而获得的单克隆抗体 或其其中一个功能片段。
本发明在至今没有描述过具有这种特性的抗体的意义上是革新性 的，通过这种方法获得的这种抗体更加具有革新性。
优选地，本发明所述的所述功能片段选自Fv、scFv、Fab、(Fab′)2、 Fab′、scFv-Fc片段或双体，或任何半衰期通过化学修饰，尤其是通PEG 化，或通过使其进入溶酶体内而延长的功能片段。当然，绝不限于该 列表，或应将本领域技术人员所知的任何其它类型的片段视为本发明 的一部分。
作为本发明的示例性例子，下文将描述通过实施本发明所述的方 法获得的5种抗体。这些命名为1A6、1A9、2E11、3C11和3G7的抗 体可以是鼠抗体、嵌合抗体或人源化抗体。
根据第一具体实施方式，本发明涉及单克隆抗体或其其中一个功 能片段，其特征在于包含：
-包含序列SEQ ID No.1、2和3，或优化比对后与序列SEQ ID No. 1、2和3至少80％相同的序列的CDR区的轻链；和
-包含序列SEQ ID No.4、5和6，或优化比对后与序列SEQ ID No. 4、5和6至少80％相同的序列的CDR区的重链。
本说明书中，术语“多肽”“多肽序列”跟随抗体化合物或其序列的肽 和蛋白质可互换。
此处应理解本发明与天然形式的抗体无关，即不是从天然环境中 提取这些抗体，但是可能从天然来源通过纯化分离或获得，或其它通 过基因重组获得的抗体，或通过化学合成，并且这些抗体可包括下文 将描述的非天然氨基酸。
CDR区或CDR是指Kabat等人(Kabat等人，Sequences of proteins of immunological interest，5th Ed.，U.S.Department of Health和Human Services，NIH，1991，和后来的版本)定义的免疫球蛋白的重链和轻链的 高度可变区。该抗体有3个重链CDR和3个轻链CDR。本文所用的术 语“CDR”的目的是指取决于具体情况，这些区域中一个或数个，或全 部CDR区包含形成抗体结合其识别的抗原或表型的亲合力的多数氨基 酸残基。
两个核酸序列或氨基酸序列之间的“同一性百分数”在本发明的意 义上讲是指两个在最佳排列(优化比对)后获得的比较序列之间核酸 或相同的氨基酸的百分数，该百分数纯粹通过统计学计算得出，并且 两个序列间的区别是随机分布并且遍布其全长。两条核苷酸序列或蛋 白质序列之间的序列比较一般通过比较以优化方式将其排列后的这些 序列而进行，所述比较可通过比较片段或通过“比较窗口”进行。进行 比较的序列的优化比对可通过Smith和Waterman(1981)[Ad.App.Math. 2：482]的局部同源性算法，通过Neddleman et Wunsch(1970)[J.Mol. Biol.48：443]的局部同源性算法，通过Pearson和Lipman(1988)[Proc. Natl.Acad.Sci.USA 85：2444]的相似性查找法，通过使用这些算法的计 算机软件包(GAP，BESTFIT，FASTA和TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package，Genetics Computer Group，575 Science Dr.， Madison，WI，或用比较软件包BLAST N或BLAST P)进行和人工进行。
确定两条核苷酸或蛋白质序列之间的同一性百分数是通过比较这 两条以比较的核苷酸或蛋白质序列可包含相对于两条序列之间进行优 化比对的参照序列添加或删除了核苷酸或氨基酸的优化方式排列的序 列。通过确定两个序列之间核苷酸或氨基酸残基相同的位置的数目， 将这个数目除以比较窗口中的位置总数目，然后将所得结果乘以100 来获得同一性百分数。
例如，可以使用BLAST程序“BLAST 2序列”((Tatusova等人，″Blast 2 sequences-a new tool for comparing protein和nucleotide sequences″， FEMS Microbiol.Lett.174：247-250)，该程序在 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html站点可以找到，使用设定好的 缺省参数(尤其是参数“开放空位罚分(open gap penalty)”：5，和延 伸空位罚分(extension gap penalty)：2，选择矩阵，例如程序设置的 “BLOSUM 62”矩阵)两条进行比较的序列之间的同一性百分数可直接 通过程序计算出来。还可能使用另一种程序如“ALIGN”或“Megalign” (DNASTAR)软件包。
每一条至少与参照氨基酸序列有80％，优选有85％、90％、95％ 和98％的同一性的氨基酸序列，相对于参照序列而言，这些序列中优 选具有某种修饰的序列，尤其是删除、添加或取代至少一个氨基酸， 平末端或粘末端。就一个或多个连续或不连续氨基酸的取代而言，优 选那些以等价氨基酸替换被取代氨基酸的取代。术语“等价氨基酸”本 文是指能够被其中一个具有基本机构的氨基酸取代而没有使其相应的 抗体的生物学活性发生实质上的变化的任何氨基酸。下面将限定“等价 氨基酸”，尤其是在实施例中限定“等价氨基酸”。
这些等价氨基酸可通过根据其与它们被取代的氨基酸的结构同源 性，或者根据被管理的不同抗体之间生物学活性的比较测试的结果而 确定。
作为非限制性实施例，表1重复了能够进行取代而未导致其相应 修饰抗体的生物学活性发生多余变化的可能性，同一条件下可天然地 关注倒转取代。
表1
优选地，上述抗体被命名为是1A6抗体，并包含重链序列和轻链 序列，其中重链序列包含SEQ ID No.7，轻链序列包含序列SEQ ID No. 8。
更特别的是，本发明还涉及能够分泌上述抗体1A6的鼠杂交瘤 (1A6)。在本说明书中，无论是指鼠杂交瘤还是这一杂交瘤产生的其 它抗体都无区别地使用同一编号。
这种鼠杂交瘤由2006年5月31日保藏在CNCM(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes)，Institut Pasteur，Paris (France)，保藏号为No.I-3612的杂交瘤构成。在六个短CDR序列中， 重链(CDRH3)的第三个CDR的大小变异较大(变异较大主要由于排 列基因的机制造成的)。它可短至2个氨基酸，也可长至26个氨基酸。 功能上，CDRH3在决定抗体的特异性上发挥不同的作用(Segal等人， PNAS，71：4298-4302，1974；Amit等人，Science，233：747-753，1986； Chothia等人，J.Mol.Biol，196：901-917，1987；Chothia等人，Nature， 342：877-883，1989；Caton等人，J.Immunol，144：1965-1968，1990； Sharon等人，PNAS，87：4814-4817，1990；Sharon等人，J.Immunol， 144：4863-4869，1990；Kabat等人，J.Immunol，147：1709-1719，1991)。
已知CDR中仅有小百分数的氨基酸促进抗体结合位点的构建，然 而这些残基应保持非常特异地三维立体构型。
根据第二具体实施方式，本发明针对单克隆抗体或其其中一个功 能片段，该单克隆抗体或其其中一个功能片段的特征在于它包含：
-轻链，其包含的CDR区序列是SEQ ID No.9、10和11序列或是 优化比对后与序列SEQ ID No.9、10和11具有至少80％同一性的序列； 和
-重链，其包含的CDR区序列是SEQ ID No.12、13和14序列或 是优化比对后与序列SEQ ID No.12、13和14具有至少80％同一性的 序列。
根据更一具体实施方式，本发明所述的抗体被命名为1A9，包含 重链序列(该重链序列包含序列SEQ ID No.15)和轻链(该轻链序列 包含序列SEQ ID No.16)。
根据另一方面，要求保护能够分泌上文限定的抗体鼠杂交瘤 (1A9)。
最后，根据本发明的优选具体实施方式，涵盖鼠杂交瘤1A9，其 于2006年5月31日保藏在CNCM(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes)，Institut Pasteur，Paris(France)，保藏号为No.I-3613。
根据第三具体实施方式，本发明针对根据本发明的方法客体获得 的单克隆抗体或其一个功能片段，该单克隆抗体或其一个功能片段包 含：
-包含CDR区的轻链，其具有序列SEQ ID No.17、18和19或优 化比对后与序列SEQ ID No.17、18和19具有至少80％同一性的序列； 和
-包含CDR区的重链，其中包含的CDR区序列是SEQ ID No.20、 21和22序列或是优化比对后与序列SEQ ID No.20、21和22具有至 少80％同一性的序列。
优选地，本发明所述的抗体，命名为2E11，包含序列SEQ ID No. 23的重链和包含序列SEQ ID No.24的轻链。
根据另一方面，本发明还包含能够分泌上述抗体的鼠杂交瘤 2E11。
更加特别的是，所述鼠杂交瘤是于2006年5月31日保藏在CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes)，Institut Pasteur，Paris(France)保藏号为No.I-3615的杂交瘤。
根据第四具体实施方式，本发明针对通过上述方法获得的单克隆 抗体或其一个功能片段，其包含：
-轻链，其包含的CDR区的序列是SEQ ID No.25、26和27的CDR 区或优化比对后与序列SEQ ID No.25、26和27具有至少80％同一性 的序列；和
-重链，其包含的CDR区序列是SEQ ID No.28、29和30序列或 是优化比对后与序列SEQ ID No.28、29和30具有至少80％同一性的 序列。
更加特别的是，根据本发明所述的抗体，命名为3C11，包含包含 序列SEQ ID No.31的重链序列和包含序列SEQ ID No.32的轻链。
根据另一方面，本发明还涉及能够分泌上述抗体的鼠杂交瘤3C11。
所述杂交瘤优选是于2006年5月31日保藏在CNCM(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes)，Institut Pasteur，Paris(France) 保藏号为No.I-3614的杂交瘤。
最后，根据本发明的第五具体实施方式，后者涉及通过实施本发 明所述的方法客体获得的单克隆抗体或其一个功能片段，其包含：
-轻链，其包含的CDR区的序列是SEQ ID No.33、34或35的CDR 区或优化比对后与序列SEQ ID No.33、34或35具有至少80％同一性 的序列；和
-重链，其包含的CDR区序列是SEQ ID No.36、37和38序列或 是优化比对后与序列SEQ ID No.36、37和38具有至少80％同一性的 序列。
优选地，所述抗体(命名为3G7)包含包含SEQ ID No.39的重链 和包含序列SEQ ID No.40的轻链。
根据本发明的另一方面，要求保护能够分泌如上抗体的鼠杂交瘤 3G7。
所述杂交瘤优选是于2006年5月31日保藏在CNCM(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes)，Institut Pasteur，Paris(France) 保藏号为No.I-3616的鼠杂交瘤。为使其清楚，将其列于下表2中， 本发明所述抗体与所述抗体CDR的各个氨基酸序列之间的对应关系。
表2
下表3代表，本发明所述的这些相同抗体与其重链和轻链的各个 氨基酸序列之间的对应关系。
表3
最后，下表4将本发明所述的每种抗体名称和CNCM的保藏号分 组。
当然，将1A6抗体的上述全部修饰特性应用于本发明所述的其它 抗体，并且更特别是应用于1A9、2E11、3C11和3G7抗体。
与上述相似的方式也可应用于根据本发明所述的方法获得的任何 抗体，同样尤其是全部所述特征、特性或修饰应被视为也可应用于本 发明鉴定的抗体。
更特别的是，特异的是，任何功能片段选自Fv、Fab、(Fab′)2、Fab′、 scFv、scFv-Fc片段或双体，或任何半衰期延长的的片段，如PEG化片 段。
优选的是，本发明所述的抗体优选为上述杂交瘤之一，即I-3612、 I-3613、I-3614、I-3615或I-3616杂交瘤分泌的抗体或其一个功能片段。
根据本发明的进一步具体实施方式，所述抗体是嵌合抗体并进一 步包含源自不同于小鼠的其它物种的抗体的恒定轻链和重链区。
优选的是，所述异种物种是人类。
更有优选的是，根据本发明，所述嵌合抗体或其一个功能片段的 特征在于源于人的抗体的轻链和重链恒定区分别是κ和γ1、γ2或γ4。
最后，甚至更优选的是，所述抗体由人源化抗体组成并包含轻链 和/或重链，其中所述轻链和/或重链的骨架片段FR1-FR4分别来源于人 抗体的轻链和/或重链的骨架片段FR1-FR4。
在特定方面，本发明涉及嵌合抗体或其一个功能片段，根据本发 明，该嵌合抗体或其一个功能片段的特征在于所述抗体进一步包含源 于非小鼠的异种抗体的轻链和重链恒定区，非小鼠的异种抗体尤其是 人的抗体，优选源于人的抗体的轻链和重链恒定区分别是κ和γ1、γ2 或γ4。
根据本发明的另一方面，所述分离的核苷酸的特征在于其选自下 列核苷酸：
a)DNA或RNA核酸，编码本发明所述的抗体或其一个功能片段；
b)与上述a)的核酸互补的核酸；
c)能够在强烈严格条件下与至少一个序列是SEQ ID No.41-46、 49-54、57-62、65-70、73-78或是优化比对后与序列SEQ ID No.41-46、 49-54、57-62、65-70、73-78具有至少80％同一性的序列的CDR杂交 的具有至少18个核苷酸的核酸；和
d)能够在强烈严格条件下与至少一个序列是SEQ ID No.48、56、 64、72或80的轻链和/或一个序列是SEQ ID No.47、55、63、71或 79的重链，或与优化比对后与序列SEQ ID No.47、48、55、56、63、 64、71、72、79或80具有至少80％同一性的序列杂交的具有至少18 个核苷酸的核酸。术语“核酸”、核序列、核酸序列、多核苷酸、寡核 苷酸、多核苷酸序列、核苷酸序列，这些在本发明说明书中不加区别 地使用的术语，其目的是指修饰的或未修饰的核苷酸与可限定的核酸 片段或核酸区(包括非天然核苷酸或者不包括非天然核苷酸)、双链 DNA、单链DNA和所述DNA的转录产物的特异性连接。
此处还应理解为本发明不涉及天然环境即天然条件下的核酸序 列。本发明涉及的核酸序列是已被分离和/或纯化的序列，即直接或间 接取样的序列，例如通过拷贝取样的序列，这些序列周围的核苷酸已 至少部分修饰过。本发明还指例如通过宿主细胞方式的基因重组获得 的或通过化学合成获得的分离的核酸。
优化比对后，与优选序列具有至少80％，优选85％、90％、95％ 和98％的同一性百分数的核序列是指相对于参照核序列而言，具有某 些修饰的核序列，这些修饰如特别是缺失、平端、粘端、嵌合融合和/ 或尤其是点式取代(point-like substitution)。优选那些编码与参照序列 编码的氨基酸相同的氨基酸的序列，这些序列涉及能够与优选参照序 列在强烈严格条件(尤其是下文限定的条件)下发生特异性杂交的基 因密码或互补序列的降解。
强烈严格条件下的杂交是指选定的能使杂交在两条互补性DNA 片段间进行的温度和离子强度条件。作为解释，为了限定上述多核苷 酸片段的目的的杂交步骤的强烈严格性条件，优选是下列条件。
DNA-DNA或DNA-RNA杂交以下列两步进行：(1)于42℃，在 含有5x SSC(1x SSC相当于0.15M NaCl+0.015M柠檬酸盐溶液)的 磷酸盐缓冲液(20mM，pH 7.5)、50％甲酰胺、7％十二烷基磺酸钠 (SDS)、10x Denhardt′s、5％硫酸葡聚糖和1％鲑精DNA中预杂交3 小时；(2)实际杂交进行20小时，其杂交温度条件取决于探针大小(即， 对于＞100个核苷酸的探针是42℃)，接着用2x SSC+2％SDS，在20 ℃洗涤20分钟共洗涤两次，再用0.1x SSC+0.1％SDS于20℃洗涤20 分钟。最后，用0.1x SSC+0.1％SDS于60℃洗涤一次30分钟，洗除 ＞100个核苷酸的探针。根据Sambrook等人(1989，Molecular cloning：a laboratory manual.2nd Ed.Cold Spring Harbor)的教程，上述大小确定的 多核苷酸的强烈严格杂交条件对于本领域技术人员来讲也适用于大或 小的寡核甘酸。
为更清楚起见，本发明所述的抗体之间的对应关系，更特别是， 抗体的CDR序列以及可变链与其核苷酸序列之间的对应关系还详见下 表5。
表5
本发明还涉及包含本发明所述的核酸的载体。
本发明尤其针对包含本发明所述的核酸序列的克隆和/或表达载 体。
根据本发明所述的载体优选包括能核酸序列在确定的宿主细胞内 表达和/或分泌的元件。载体应包括启动子(起始和终止翻译的信号) 和适合的转录调节区。它应能以稳定的方式在宿主细胞内保留，并可 可能含有负责翻译后蛋白质的分泌的特定信号。本领域技术人员可根 据所用的宿主细胞选择和优化不同元件。为了实现这一目的，可将本 发明所述的核酸序列插入选定宿主体内的自我复制载体中或是选定宿 主的整合载体。
本领域技术人员可使用当前方法制备这种载体，而且所得克隆可 通过标准方法，如通过脂质体转染法、电穿孔法、热休克法或化学方 法引入合适的宿主体内。
本发明所述的载体，例如是质粒或病毒来源的载体。可将这些载 体转化宿主细胞以克隆和表达本发明所述的核酸序列。
本发明还包含以本发明所述的载体转化的宿主细胞或包含本发明 所述的载体的宿主细胞。
宿主细胞可选自真核或原核系统，例如细菌细胞、酵母细胞或动 物细胞，尤其是哺乳动物细胞。也可使用昆虫细胞或植物细胞。
本发明还涉及除人以外的包含本发明所述的转化细胞的动物。
另一方面，本发明的目标是制备本发明所述的抗体或其一个功能 片段的方法，该方法的特征在于包含下列步骤：
a)在合适的培养条件下在培养基中培养本发明所述的宿主细胞；和
b)回收所述抗体或其一个功能片段，因此从培养基或所述培养细 胞中制备得到。
可在制备本发明所述的重组多肽的方法中使用转化细胞。制备本 发明所述的重组形式的多肽的方法(其特征在于使用的本发明所述的 载体和/或转化了载体的细胞)本身包含在本发明内。优选地，在可允 许表达所述多肽和回收所述重组肽的条件下培养本发明所述的经载体 转化的细胞。
如上所述，宿主细胞可选自原核或真核系统。尤其是那些有可能 使本发明所述的核酸易于分泌和鉴定的原核或真核系统。因此。可将 本发明所述的带有这种序列的载体优选用于制备分泌型重组蛋白。的 确，这些目的重组蛋白由于其存在于细胞培养上清液中而不是存在于 宿主细胞内的事实而使其纯化过程更加容易。
也可通过化学合成制备本发明所述的多肽。这种制备方法也是本 发明的目标，本领域技术人员了解化学合成方法，例如使用固相合成 技术的化学合成方法(尤其见于Steward等人，Solid phase peptides synthesis，Pierce Chem.Company，Rockford，111，2nd ed.，(1984))或使用 在标准溶液中浓缩片段或合成的部分固相合成技术的化学合成方法。 化学合成获得的多肽和可包括相应的非天然氨基酸的多肽也包含在本 发明中。
能够通过本发明所述的方法获得的抗体或其一个功能片段也包含 在本发明中。双特异性或双功能抗体形成第二代单克隆抗体，其中在 同一个分子中组合了两个不同的可变区(Hollinger和Bohlen，1999， Cancer and metastasis rev.18：411-419)。既在诊断又在治疗领域验证了 它们的应用，因为它们募集新效应子功能的能力或靶向肿瘤细胞表面 几个分子的能力。这些抗体可通过化学方法获得(Glennie MJ等人， 1987，J.Immunol.139，2367-2375；Repp R.等人，1995，J.Hemat.377-382) 或体细胞(Staerz U.D.和Bevan M.J.，1986，PNAS 83，1453-1457；Suresh M.R.等人，1986，Method Enzymol.，121：210-228)也可优选通过遗传工 程技术获得，遗传工程中可强制进行异二聚体化，其促进目标抗体的 纯化方法(Merchand等人，1998，Nature Biotech.，16：677-681)。
这些双特异性抗体可构建为完整IgG，作为双特异性Fab’2，作为 Fab’PEG或作为二体或甚至是作为双特异性scFv，但也可作为四价双 特异性抗体或者是存在针对每个靶抗原的结合位点(Park等人，2000， MoI.Immunol.，37(18)：1123-30)或其片段(如上所述)
除了由生产和使用双特异性抗体比制备两条特异性抗体更加低廉 这一事实产生的经济效益外，使用这种双特异性抗体还具有治疗毒性 减轻的益处。的确，使用双特异性抗体，有可能使全球循环抗体用量 和可能因此引起的毒性反应下降。
在本发明优选具体实施方式中，双特异性抗体是二价或四价抗体。
实际中，使用四价双特异性抗体的好处是与二价抗体相比由于针 对每个靶蛋白具有两个结合位点而具有更强的亲合力。
与选择上述抗体的功能片段相似，所述第二种模式选自Fv、Fab、 (Fab′)2、Fab′、Fab′PEG、scFv、scFv-Fc片段和双体或任何半衰期可能 延长的形式。
另一方面，本发明的目标是用作药物的本发明所述的抗体或其功 能片段(优选上文限定的人源化抗体)。“抗体”在本说明书中的下文中， 既指应用本发明上述方法获得的抗体也指选自已鉴定并命名的抗体1 A6、1A9、2E11、3C11或3G7。
本发明还涉及药物组合物，其包含由本发明所述的抗体或其一个 功能片段的化合物作为活性成分和优选加入药学上可接受的赋形剂和/ 或载体。
更加特别的是，本发明涵盖组合物，其包含如上所述的或杂交瘤 I-3612、I-3613、I-3614、I-3615或I-3616产生的抗体或其一个功能片 段的化合物作为活性成分。
根据另一具体实施方式，本发明还涉及上述药物组合物，该药物 组合物进一步包含联合使用化学疗法制剂、放射疗法制剂或抗体的产 物，该产物可使化学疗法制剂、放射疗法制剂或抗体同时使用、分开 使用、或随时间延伸。“同时使用”是指使用两种包含在一个或相同药 物剂型中的本发明所述的组合物的化合物。
“分开使用”是指在同一时间使用两种包含在不同药物剂型中的本 发明所述的组合物的化合物。
“随时间延伸”是指连续使用两种每种包含在不同药物剂型中的本 发明所述的组合物的化合物。化学疗法制剂是指任何出现在本发明说 明书的上文中的定义或列表中列出的化合物。
尤其是在优选的具体实施方式中，所述作为本发明所述的联合产 物的组合物的特征在于所述细胞毒性制剂与所述抗体形成化学偶联以 用于同时给药。
尤其在是优选的具体实施方式中，所述根据本发明的组合物的特 征在于所述细胞毒性/细胞生长抑制性制剂选自抑制或稳定纺锤体的制 剂，优选长春瑞滨(vinorelbine)和/或长春氟宁(vinflunine)。
为了易化所述细胞毒性制剂与所述本发明所述抗体之间的偶联， 尤其可在两个偶联的化合物之间引入间隔分子，如多烯基乙二醇如聚 乙烯乙二醇或甚至是氨基酸，或者在另一具体实施方式中，可使用所 述细胞毒性制剂的活性衍生物，其中可引入能够与根据本发明所述的 抗体反应的功能。这些偶联技术对本领域技术人员是熟知的，而且本 发明说明书并未将其发展。
本发明的另一方面还涉及特征在于至少一种所述抗体或其一个功 能片段与细胞毒性和/或放射性元素结合的组合物。
优选地，所述毒性是来自肠道细菌的毒素，尤其是来自假单胞菌 属(Pseudomonas)的外毒素A。
与本发明所述的至少一种抗体或其一种功能片段结合的毒素或放 射性元素是指任何手段所述毒素或所述放射性元素可结合至所述至少 一种抗体，尤其通过化合物与共价偶联，引入或没有引入结合分子。 另一种偶联形式可以是使用离子螯合剂以产生非共价性络合作用，如 例如EDTA、DOTA或者甚至是99mTc型化合物。
同样优选的是，所述至少一种形成根据本发明所述的结合的抗体 选自其功能片段，尤其是从其元件Fc如scFv片段上分离下来的片段。
本发明进一步包含本发明所述的组合物用于制备药物的用途。
本发明的目标还是上述抗体或甚至是通过本发明所述的和上述方 法获得的抗体在用于制备旨在预防或治疗癌症的药物中的用途。
本发明的目标还是上述抗体或甚至是通过本发明所述的和上述方 法获得的抗体在用于制备旨在抑制肿瘤对患有在本专利预防和治疗的 癌症范围内的癌症的患者接受抗肿瘤治疗后产生的耐药性的药物中的 用途。
优选地，所述癌症是耐药类型的癌症，其选自结肠、前列腺、乳 腺、肺、卵巢或胰腺癌。
根据本发明的另一具体实施方式，本发明还要求保护本发明所述 的抗体或其一个功能片段在制备旨在将生物学活性化合物对耐药肿瘤 和/或晚期肿瘤进行特异性靶向治疗的药物中的用途。例如，标定的本 发明所述的抗体或其一个功能片段包括所谓的免疫交联抗体，后者可 例如与如过氧化物酶、碱性磷酸酶、α-D-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、 葡萄糖淀粉酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶、溶菌酶、苹果酸脱氢酶、 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的酶交联，或与如生物素、异羟洋地黄毒苷配基 (digoxigenin)或5-溴脱氧尿嘧啶核苷的分子交联。荧光标记物也可与 本发明所述的抗体或其一个功能片段偶联，而且这些荧光标记物尤其 包括荧光素及其衍生物、荧光铬(fluorochromium)、若丹明(rhodamine) 及其衍生物、GFP(绿色荧光蛋白)、丹酰、伞形酮(umbelliferone) 等。在这种结合物内，可通过本领域技术人员所知方法制备本发明所 述的抗体或其一个功能片段。后者可直接或经间隔基团或结合基团如 多聚醛如戊二醛、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DPTA) 或者在如高碘酸(periodate)等偶联剂存在条件下与酶或荧光标记物偶 联。包括荧光素型标记物的结合分子可通过与异硫氰酸盐 (isothiocyanate)反应而制备。
其它结合分子还包括化学发光标记物，如鲁米诺(luminol)和二 环氧丙烷(dioxetane)，生物发光标记物，如荧光素酶、荧光素或甚 至放射活性标记物。
生物活性化合物本文是指任何能够调节，尤其是能够抑制细胞活 性，特别是抑制细胞的生长、增殖、基因转录或翻译的化合物。
在本说明书中，药学上可接受的载体是指进入组合物的化合物或 化合物的组合，其不引起二级反应而且使用它可使活性化合物的给药 例如更容易、在机体中的半衰期更长和/或更有效，在溶液中的溶解性 增加或者甚至更易于保存。这些药学上可接受的载体是熟知的且可根 据所选化合物的本性和施用方法由本领域技术人员来进行改变。
优选地，这些化合物可系统给药，特别是经静脉途径、经肌肉、 真皮、腹膜内或皮下途径、或口服系统给药。更加优选的是，包含本 发明所述的抗体的组合物将重复给药，使药物长期逐步分布。
它们的给药、剂型和优化的盖仑学派形式(galenic form)可根据 制定适合患者的治疗方案时通常考虑的条件而确定，这些条件如例如 适合患者年龄或体重、她/他的疾病的严重程度、对治疗的耐受性和报 导的二级反应。
本发明的其它特征和优势将出现在发明内容后的实施例和包括标 题的附图和附图说明中。
最后，根据本发明的最后一方面，本发明涉及本发明所述的方法 的用于鉴定新的参与形成耐药现象的治疗性和/或诊断性的细胞内或细 胞外靶点的用途。
最后，所述鉴定新的参与形成耐药现象的治疗性和/或诊断性的细 胞内或细胞外靶点的方法的特征在于其由应用根据本发明的上述方法 以获得单克隆抗体，和然后鉴定化合物，尤其是所述单克隆抗体识别 的蛋白质组成。
这种化合物，尤其是鉴定蛋白质的鉴定可通过本领域技术人员所 知的任何技术进行，如例如通过细胞裂解液的免疫沉淀作用和/或免疫 纯化作用，和通过与标准蛋白质组技术偶联的Western-blot技术的蛋白 质鉴定技术。
附图标题和其后的实施例旨在解释本发明而绝不限制其范围。
附图说明
图1：图1说明了了h4D5、225和7C10三联疗法之后的肿瘤体积 的时程，并表明对该治疗的耐药性的出现。
图2：图2以第一示例性形式说明了了本发明的具体实施方式的解 释性线图。
1：取样对照肿瘤、分成两部分。
2：小鼠耐受性。制备免疫接种细胞：裂解、细胞悬浮液等。通过 腹腔注射(i.p.)环磷酰胺或其它至耐受剂产生免疫耐受。
3：筛选IHC玻片：将肿瘤冰冻或包埋。制备标记为“阴性对照玻 片“的玻片。
4：耐药肿瘤取样并分成两部分。
5：制备免疫接种细胞：裂解、细胞悬浮液等。
6：将肿瘤冰冻或包埋：制备标记为“试验玻片”的玻片。
7：对照肿瘤取样。
8：免疫接种小鼠：细胞的制备来自对照肿瘤。
9：对照IHC玻片。
10：通过注射免疫抑制剂产生免疫耐受。
11：血清取样以核实缺乏抗原发细胞的免疫应答。
12：取样耐药肿瘤。
13：免疫接种耐受小鼠：细胞的制备来自耐药肿瘤。
14：试验IHC玻片。
15：取样标记为IHC肿瘤对耐药肿瘤的血清。
16：杂交瘤的分泌：在对照肿瘤的玻片上不标记、在耐药肿瘤上 阳性标记(在间质细胞玻片上不标记，在肿瘤细胞上标记)。
图3：图3也说明了但以简图形式解释本发明所述方法的具体实施 方式。
图4：图4说明了以用于耐受和免疫接种的肿瘤制备的“组织芯片” 类型的载玻片上本发明所述抗体的表达图谱。
图5：图5说明了在结肠异种移植物模型HT29中抗体1A6和2E11 的抗肿瘤活性的数值。
图6：图6分别表明抗体1A6、1A9、2E11、3C11和3G7的重链 和轻链序列。各个CDR有下划线，并字体加粗。
图7：图7说明了在胰腺异种移植物模型BxPC3中抗体2E11的抗 肿瘤活性的数值。
实施例1：证明肿瘤细胞A549对抗-IGF-IR、抗EGFR和抗 Her/2neu三联疗法产生耐药
将A549细胞移植至小鼠体内。肿瘤植入后，一周两次，以含有每 种下列抗体，即h4D5(赫塞汀(herceptin)由ICR(Institut Claude Regaud、service pharmacie、20-24、rue du Pont Saint-Pierre、31052 Toulouse提供)、225(ATCC No.HB-8508)和7C10，各300μg的混合物 处理小鼠。
处理一星期后，在某些小鼠体内可观察到肿瘤生长减慢直至肿瘤 完全消失。尽管全部肿瘤或部分肿瘤生长减慢，仍持续处理。
接着，尽管持续进行治疗，仍观察到肿瘤复发，这表明肿瘤对三 联疗法已经产生耐药。
图1中显示了一个例子，其表明肿瘤在第15天前生长减慢，但 从第15天起肿瘤复发，这提示了耐药性的产生。
实施例2：制备针对参与对抗-IGF-IR、EGFR和Her/2neu联合疗 法耐药的耐药性形成的抗原的活性单克隆抗体
将A549细胞移植入两批10只小鼠体内。第一批两周一次接受PBS 注射。第二批分别联合使用直接抗IGF-IR、EGFR和Her/2neu受体的 抗体(7C10、225和h4D5)处理。这种抗体的联合使用使肿瘤退化， 导致60％的被处理动物的肿瘤消失。尽管效果明显，但所有动物均出 现肿瘤复发。
当以PBS处理的动物体内的A549肿瘤长至100-200mm3时，将 其切除。
将这些肿瘤，每个分成两部分：一部分冰冻以制备“组织芯片”类 型的免疫组织化学玻片，另一部分用于使BALB/c小鼠产生耐受。耐 受通过腹腔注射磨碎的肿瘤细胞匀浆，接着使用环磷酰胺而进行，并 为了完全消除直接抗未处理的“原生”A549肿瘤的免疫应答。在肿瘤复 发过程中，也在肿瘤达到100至200mm3的体积时取样，然后将其分成 两等份。一份冰冻用于制备PBS对照肿瘤的上述“组织芯片”类型的免 疫组织化学玻片。将第二份制成磨碎的匀浆并将用于为之前以未处理 的A549肿瘤使其耐受的小鼠进行免疫接种。所有这些小鼠均接受3次 腹腔注射三联疗法耐药肿瘤的磨碎的匀浆，佐剂注射首次使用以完全 弗氏(Freund′s)佐剂注射，接着用不完全弗氏佐剂注射。
然后进行细胞融合并用用免疫组织化学的方法在之前制备的“组 织芯片”型玻片上筛选从此融合产生的杂交瘤。
将分泌识别耐药组织的，既不识别来自对照批PBS组织中的肿瘤 组织，也不识别用于体内形成肿瘤组织的原发A549细胞的抗体的杂交 瘤克隆和冰冻。抗体于是在腹水中产生，经纯化、并在体内在表达抗 体识别的表面结构或抗原的细胞(这些细胞在经FACSCAN进行非排 除性的分泌每种抗体的肿瘤细胞系组的分析之前进行选择)上进行检 测之前进行免疫组织学再检测。
图4表明固定抗体的图谱。
下表6将这些抗体(以FACSCAN仪器进行组织学选择的抗体识 别不同细胞系)识别的细胞分组。
表6
实施例3：以结肠异种移植物模型制备的本分泌所述抗体(更特别 是1A6和2E11)抗肿瘤活性的评价
将5.106HT29细胞移植入“瑞士裸鼠”体内。移植5天后，测定肿 瘤并根据同质肿瘤大小将鼠分成3批，每批6只。以PBS(阴性对照) 或0.5mg1A6或2E11抗体一周3次处理小鼠(初次注射剂量：1mg/ 只)。
两周一次跟踪肿瘤体积，已知肿瘤体积根据下列公式：(π/6) ×(l)×(L)×(e)进行常规计算，其中l＝测定宽度，L＝测定长度，e＝测定厚 度。
结果如图5所示。
可将HT29细胞视为易于转移的表型的细胞。获得的结果证明，可 能将直接抗肿瘤细胞抗原的抗体(该肿瘤细胞抗原来自以抗肿瘤组合 物(见实施例2)处理并对其产生耐药的肿瘤)用作治疗具有易于转移 表型的肿瘤的抗肿瘤化合物。
该实验获得的结果证实制备抗体的原始方法和自耐药诱导小鼠制 备治疗用途的抗体的概念。该方法可与任何其它药物联合使用，后者 包括化学疗法药物，单独或联合使用或与抗体或与酪氨酸激酶抑制剂 或与蛋白水解酶抑制剂，以同样的方式接续使用。
实施例4：抗体2E11自胰腺异种移植物模型BxPC3制备的本发 明所述的抗体2E11的抗治疗活性的评价。
将10.106BxPC3细胞移植入无胸腺“裸”鼠体内。移植5天后，测 定肿瘤，并将小鼠根据同质肿瘤的大小分成两批，每批6只。分别以 PBS(阴性对照)或抗体2E11(1mg/次)一周两次处理小鼠。一周两次 跟踪肿瘤体积。
结果如图7所示。
该实验获得的结果证实抗体2E11的功能活性，还证实了自耐药诱 导小鼠制备治疗用途的抗体的概念。
序列表
<110>皮埃尔法布雷医药公司
L·哥彻
A·茹阿诺
<120>制备抗耐药性抗原的活性抗体的方法、所述方法获得的抗体及其用途
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<150>FR 06/08514
<151>2006-09-28
<160>80
<170>PatentIn version 3.3
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<400>24
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1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Tyr Asn Leu Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210>25
<211>11
<212>PRT
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>25
Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala
1 5 10
<210>26
<211>7
<212>PRT
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>26
Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr
1 5
<210>27
<211>9
<212>PRT
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>27
Gln Gln His Tyr Ser Asn Pro Arg Thr
1 5
<210>28
<211>6
<212>PRT
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>28
Ser Ser Tyr Gly Val His
1 5
<210>29
<211>16
<212>PRT
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>29
Val Ile Trp Val Gly Gly Thr Thr Asn Phe Lys Ser Ala Leu Met Ser
1 5 10 15
<210>30
<211>10
<212>PRT
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>30
Glu Arg Pro Tyr Gly Asn Pro Leu Val Asp
1 5 10
<210>31
<211>118
<212>PRT
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>31
Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Val Gly Gly Thr Thr Asn Phe Lys Ser Ala Leu Met
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Glu Arg Pro Tyr Gly Asn Pro Leu Val Asp Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210>32
<211>107
<212>PRT
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>32
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Asn Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210>33
<211>16
<212>PRT
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>33
Arg Ser Ser Gln Thr Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu
1 5 10 15
<210>34
<211>7
<212>PRT
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>34
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210>35
<211>9
<212>PRT
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>35
Phe Gln Ser Ser Arg Val Pro Tyr Thr
1 5
<210>36
<211>6
<212>PRT
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>36
Thr Asn Tyr Trp Leu Gly
1 5
<210>37
<211>17
<212>PRT
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>37
Asp Ile Phe Pro Gly Gly Ile Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Ile Lys
1 5 10 15
Gly
<210>38
<211>10
<212>PRT
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>38
Phe Asp Asp Phe Asp Pro Phe Phe Ala Ser
1 5 10
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<211>119
<212>PRT
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>39
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Leu Gly Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Phe Pro Gly Gly Ile Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Ile
50 55 60
Lys Gly Glu Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Phe Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Phe Asp Asp Phe Asp Pro Phe Phe Ala Ser Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210>40
<211>112
<212>PRT
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>40
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Thr Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Phe Gln Ser
85 90 95
Ser Arg Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210>41
<211>33
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>41
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<210>42
<211>21
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>42
tacacctcaa gattacactc a 21
<210>43
<211>27
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>43
caacagggta atacgcttcc attcacg 27
<210>44
<211>18
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>44
actgaataca ccttgcac 18
<210>45
<211>51
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>45
ggtattgatc ctaacaatgg tggtactagc tataaccaga agttcaaggg c 51
<210>46
<211>24
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>46
tcgaacagtt actactttga ctac 24
<210>47
<211>351
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>47
gaggtccagc tgcaacagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata 60
tcctgcaaga cttctggata cacattcact gaatacacct tgcactgggt gaagcagagc 120
catggaaaga gccttgagtg gattggaggt attgatccta acaatggtgg tactagctat 180
aaccagaagt tcaagggcaa ggccacattg actgtagaca agtcctccag cacagcctac 240
atggagctcc gcagcctgac atctgaggat tctgcagtct atctctgtgc aagatcgaac 300
agttactact ttgactactg gggccaaggc accactctca cagtctcctc a 351
<210>48
<211>321
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>48
gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagcgtcacc 60
atcagttgca gggcaaggca ggacattcgc aattttttaa actggtatca gcagagacca 120
gatggaactg ttaaactcct gatctactac acctcaagat tacactcagg agtcccatca 180
aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggaccaa 240
gaagatgttg ccacttattt ttgccaacag ggtaatacgc ttccattcac gttcggctcg 300
gggacaaagt tggaaataaa a 321
<210>49
<211>33
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>49
cgagcaagtg ggaatattca caattattta gca 33
<210>50
<211>21
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>50
aatgcaaaaa ccttagcaga t 21
<210>51
<211>27
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>51
caacattttt ggactactcc gtacaca 27
<210>52
<211>18
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>52
acaaactatg gaatgaac 18
<210>53
<211>48
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>53
tggataaaca cctacactgg agagccaaca tatgctgatg acttcaag 48
<210>54
<211>27
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>54
gggggctact ataggtacgc ggcttac 27
<210>55
<211>354
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>55
cagatccagt tggtgcagtc tggacctgag ctgaagaagc ctggagagac agtcaagatc 60
tcctgcaagg cttctgggca gaccttcaca aactatggaa tgaactgggt gaagcaggct 120
ccaggaaagg gtttaaagtg gatgggctgg ataaacacct acactggaga gccaacatat 180
gctgatgact tcaagggacg gtttgccttc tctttggaaa cctctgccag cactgcctat 240
ttgcagatca acaacctcaa aaatgaggac acggctacat atttctgtgc aagagggggc 300
tactataggt acgcggctta ctggggccaa gggactctgg tcactgtctc tgca 354
<210>56
<211>321
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>56
gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgcat ctgtgggaga aactgtcacc 60
atcacatgtc gagcaagtgg gaatattcac aattatttag catggtatca gcagaaacag 120
ggaaaatctc ctcagctcct ggtctataat gcaaaaacct tagcagatgg tgtgccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc aggaacacaa tattctctca agatcaacag cctgcagcct 240
gaagattttg ggtgttattt ctgtcaacat ttttggacta ctccgtacac attcggaggg 300
gggaccaaac tggaactaat a 321
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<211>51
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>57
aaagccagtc agagtctgct caacagtaga acccgaaaga actacttggc t 51
<210>58
<211>21
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>58
tgggcatcca ctagggaatc t 21
<210>59
<211>24
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>59
aagcaatctt ataatctgta cacg 24
<210>60
<211>15
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>60
gacacctata tgcac 15
<210>61
<211>51
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>61
aggattgatc ctgcgaatgg aaatactaaa tctgacccga agttccaggg c 51
<210>62
<211>30
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>62
ggatatacta actacgtttg gtttacttac 30
<210>63
<211>357
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>63
gaggttcagc tgcagcagtc tggggcagag gttgtgaagc caggggcctc agtcaagttg 60
tcctgcacag cttctggctt caacattaaa gacacctata tgcactgggt gaaacagagg 120
cctgaacagg gcctggagtg gattggaagg attgatcctg cgaatggaaa tactaaatct 180
gacccgaagt tccagggcaa ggccattaaa acagcagaca catcctccaa cacagcctac 240
cttcagctca gtagcctgac atctgaggac actgccgtct attactgtac tagcggatat 300
actaactacg tttggtttac ttactggggc caagggactc tggtcactgt ctctgca 357
<210>64
<211>336
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>64
gacattgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctggctgtgg cagcaggaga gaaggtcact 60
atgagctgca aagccagtca gagtctgctc aacagtagaa cccgaaagaa ctacttggct 120
tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tctactgggc atccactagg 180
gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cagtctcacc 240
atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gcaagcaatc ttataatctg 300
tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaa 336
<210>65
<211>33
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>65
aaggccagtc aggatgtgag tactgctgtc gcc 33
<210>66
<211>21
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>66
tcggcatcct accgttacac t 21
<210>67
<211>30
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>67
cagcaacatt atagtaatcc tcggacgttc 30
<210>68
<211>18
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>68
tccagctatg gtgtacac 18
<210>69
<211>48
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>69
gtaatatggg ttggtggaac cacaaatttt aaatcggctc tcatgtcc 48
<210>70
<211>30
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>70
gagagaccct atggtaaccc tttggttgac 30
<210>71
<211>354
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>71
caggtgcagc tgaaggagtc aggacctggc ctggtggcgc cctcacagag cctgtccatc 60
acttgcactg tctctgggtt ttcattatcc agctatggtg tacactgggt tcgccagcct 120
ccaggaaagg gtctggagtg gctgggagta atatgggttg gtggaaccac aaattttaaa 180
tcggctctca tgtccagact gagcatcagc aaagacaact ccaagagcca agttttctta 240
aaaatgaaca gtctgcaaac tgatgacaca gccatgtact actgtgccag agagagaccc 300
tatggtaacc ctttggttga ctggggccaa gggactctgg tcactgtctc tgca 354
<210>72
<211>321
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>72
gacattgtga tgacccagtc tcacaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc 60
atcacctgca aggccagtca ggatgtgagt actgctgtcg cctggtatca acagaaacca 120
ggacaatctc ctaaactact gatttactcg gcatcctacc gttacactgg agtccctgat 180
cgcttcactg gcagtggatc tgggacggat ttcactttca ccatcagcag tgtgcaggct 240
gaagacctgg cagtttatta ctgtcagcaa cattatagta atcctcggac gttcggtgga 300
ggcaccaagc tggaaatcaa a 321
<210>73
<211>48
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>73
agatctagtc agaccattgt acatagtaat ggaaacacct atttagaa 48
<210>74
<211>21
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>74
aaagtttcca accgattttc t 21
<210>75
<211>27
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>75
tttcaaagtt cacgtgttcc gtacacg 27
<210>76
<211>27
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>76
tttcaaagtt cacgtgttcc gtacacg 27
<210>77
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<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>77
gatattttcc ctggaggtat ttatactaac tacaatgaga agatcaaggg c 51
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<211>30
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>78
tttgatgatt tcgacccctt ttttgcttcc 30
<210>79
<211>357
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>79
caggtccagt tgcagcagtc tggacccgag ctggtaaggc ctgggacttc agtgaagata 60
tcctgcaagg cctctggcta caccttcact aactactggc taggttgggt aaagcagagg 120
cctggacatg gacttgagtg gattggagat attttccctg gaggtattta tactaactac 180
aatgagaaga tcaagggcga ggccacactg actgccgaca catcctccag cactgcctac 240
ttgcagctca gtagcctgac atctgaggac tcttttgtct atttctgtgc aaggtttgat 300
gatttcgacc ccttttttgc ttcctggggc caagggactc tggtcactgt ctctgca 357
<210>80
<211>336
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>80
gatgttttga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60
atctcttgca gatctagtca gaccattgta catagtaatg gaaacaccta tttagaatgg 120
tacctgcaga aaccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180
tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaatatc 240
agcagagtgg aggctgagga tctgggaatt tattactgct ttcaaagttc acgtgttccg 300
tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaa 336
机译： 抗体或其抗原结合片段，分离的多肽，分离的核酸，表达载体，宿主细胞，组合物，用于生产抗体或抗原结合片段的方法，所述抗体或抗原结合片段用于治疗癌症以及检测tigit肽或片段的感染或感染性疾病其，并用于增强免疫细胞的活性和抗tigit抗体，疫苗的抗肿瘤活性，以及抗体或抗原结合片段的用途
机译： 抗Aβ球聚体抗体，其抗原结合部分，相应的杂交瘤，核酸，载体，宿主细胞，制备所述抗体的方法，包含所述抗体的组合物，所述抗体的用途和使用所述抗体的方法。
机译： 抗球蛋白-β抗体，其抗原结合部分，相应的杂交瘤，核酸，载体，宿主细胞，制备所述抗体的方法，包含所述抗体的组合物，所述抗体的用途和使用所述抗体的方法
