一种用添加山梨醇提高发酵生产碱性果胶酶产量的方法

摘要

一种用添加山梨醇提高发酵生产碱性果胶酶产量的方法，涉及碳源添加策略在发酵过程优化中的应用技术领域。本发明用重组毕赤酵母GS115为发酵菌株，在发酵诱导期以恒速或加速添加山梨醇到发酵液中，以提高细胞活力，减弱甲醇的毒害作用，进而提高碱性果胶酶的产量。较低的山梨醇添加量不仅不会抑制甲醇对菌体的产酶效果，还可以从一定程度上削弱菌体受到的甲醇毒害作用，从而进一步提高产酶效率。当山梨醇采用变速流加(0.9g/h－7.2g/h)时，酶活从对照的930U/ml提高到1541U/ml。本发明工艺简单有效，而且可应用于今后果胶酶的工业化生产中，且对其它的毕赤酵母发酵过程优化具有一定的指导意义。

说明书

技术领域

利用重组毕赤酵母作为宿主高效表达碱性果胶酶，一种用添加山梨醇提高发酵生产碱性果胶酶产量的方法，涉及碳源添加策略在发酵过程优化中的应用技术领域。

背景技术

碱性果胶酶是一类能在碱性条件下高效分解植物组织中果胶质(由D-半乳糖醛酸以α-1，4糖苷键连接形成的直链状的聚合物)的酶的总称，作为一种用于纺织清洁生产的全新温和的生物精练酶制剂而备受关注。在前期研究中，本研究室在分离筛选得到一株碱性果胶酶高产菌株WSHB04-02的基础上，将其原核碱性果胶酯裂解酶基因PL利用穿梭载体pPIC9K的连接，并成功表达于毕赤酵母GS115中，菌种保藏号为CGMCC NO.2143。之后的研究工作都围绕重组毕赤酵母发酵过程优化而展开。在发酵过程的诱导阶段，由于长时间的流加甲醇，对细胞活力有着较强的毒害作用，因此如何在高效的诱导表达阶段又可以维持细胞的活力是进一步提高酶活的关键问题。利用山梨醇的低速流加便可以解决这一问题，提高果胶酶的产量，尚未见文献报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种用添加山梨醇的策略提高发酵生产碱性果胶酶产量的方法，利用本发明能显著提高碱性果胶酶的产量。

本发明的技术方案：一种用添加山梨醇提高发酵生产碱性果胶酶产量的方法，用重组毕赤酵母GS115为发酵菌株，在发酵诱导期以恒速或加速添加山梨醇到发酵液中，以提高细胞活力，减弱甲醇的毒害作用，进而提高碱性果胶酶的产量；

流加速度从0.9g/h至7.2g/h的固体山梨醇计范围内任选一恒定速度，配成体积百分浓度50％山梨醇溶液进行流加；

或流加速度以每10h提高流速0.6g/h，从0.9g/h逐步提高至7.2g/h，配成体积百分浓度50％山梨醇溶液进行流加。

碱性果胶酶的产量随山梨醇流速的提高而提高，但是当其流速过高时，碱性果胶酶的产量又会减少。在山梨醇的恒定添加速度为3.6g/h时，碱性果胶酶的产量由对照(不添加山梨醇)的930U/mL提高到1389U/mL。当采用梯度增加山梨醇的添加流速时，发现碱性果胶酶的产量提高到1541U/mL。

碱性果胶酶酶活的测定：取一定量发酵液于10000r/min离心10min，上清液作为碱性果胶酶活性测定的样品。反应体系中包括粗酶稀释液(一般稀释200-800倍不等)20μL，2mL含0.2％聚半乳糖醛酸的甘氨酸-NaOH缓冲液(缓冲液配方：甘氨酸1.8775g，NaOH 0.35g，CaCl₂-2H₂O 0.028g定容至500mL)，以无活性的酶液作为空白对照，以含底物的缓冲溶液的加入起动酶促反应；反应条件为45℃反应15min，用3mL 0.03mol/L的磷酸终止反应，在235nm处测定其吸光度值。

一个标准酶活单位(1U)定义为：每分钟使聚半乳糖醛酸裂解产生1μmol的不饱和聚半乳糖醛酸的酶量。

本发明的有益效果：利用本发明能显著提高碱性果胶酶的产量。较低的山梨醇添加量不仅不会抑制甲醇对菌体的产酶效果，还可以从一定程度上削弱菌体受到的甲醇毒害作用，从而进一步提高产酶效率。此外，本发明所提供的通过添加山梨醇提高产外源蛋白的策略对其它的毕赤酵母的表达体系也有一定的借鉴和指导作用。

具体实施方式

对照实施例：本发明所用的菌种：重组毕赤酵母P.pastoris GS115为宿主，整合来自Bacillus sp.WSHB04-02菌株中的碱性果胶酶的编码基因，具有His⁺和Mut⁺表型，拷贝数为2-3个。重组毕赤酵母P.pastoris GS115已在【生物工程学报2008.24(4).p635-639】公开。

培养基：

种子培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L。

分批发酵培养基为：85％磷酸26.7mL/L，CaSO₄0.93g/L，K₂SO₄18.2g/L，MgSO₄·7H₂O 14.9g/L，KOH 4.13g/L，甘油40.0g/L，PTM14.35mL/L，25％氨水调pH5.5。

补料生长培养基：50％(W/V)甘油(含12mL/L PTM1)。

发酵诱导培养基：100％甲醇(含12mL/L PTM1)。

培养条件：先从保藏菌种的甘油管转至摇瓶在30℃，200rpm的摇床中培养24小时，然后在3L发酵罐中进行发酵，第一阶段为生长期36h左右，第二阶段为诱导期100h左右，发酵条件为：pH 5.5，调节搅拌转速和通气量维持溶氧30％以上，通气速率2.0vvm，生长期温度维持在30℃，诱导期温度降为22℃。

基于此工艺下的发酵法生产碱性果胶酶，产量可达930U/mL左右。

实施例1：发酵罐发酵采用山梨醇恒速添加策略，其余条件同对照实施例。发酵进入诱导期时添加山梨醇(50％，v/v，1.8g/h的固体山梨醇)。结果：碱性果胶酶的产量由对照的930U/mL提高到1176U/mL。

实施例2：发酵罐发酵采用山梨醇恒速添加策略，其余条件同对照实施例。发酵进入诱导期时添加山梨醇(50％，v/v，3.6g/h的固体山梨醇)。结果：碱性果胶酶的产量由对照的930U/mL提高到1389U/mL。

实施例3：发酵罐发酵采用山梨醇恒速添加策略，其余条件同对照实施例。发酵进入诱导期时添加山梨醇(50％，v/v，5.4g/h的固体山梨醇)。结果：碱性果胶酶的产量由对照的930U/mL提高到1211U/mL。

实施例4：发酵罐发酵采用山梨醇变速添加策略，其余条件同对照实施例。发酵进入诱导期时添加山梨醇(50％，v/v，流加速度从0.9g/h逐步提高至7.2g/h，每10h提高流速0.6g/h)。结果：碱性果胶酶的产量由对照的930U/mL提高到1541U/mL。