具有自由基捕获性能的表面自组装金纳米探针及其制备方法与应用

摘要

本发明公开了具有自由基捕获性能的表面自组装金纳米探针及其制备方法与应用。本发明提供的具有高效自由基捕获性能的表面自组装金纳米探针，是在金纳米颗粒表面，通过式I结构的连接子连接有式II结构的硝酮类自由基探针配基，所述硝酮类自由基探针配基与所述连接子的R

说明书

技术领域

本发明涉及一种具有自由基捕获性能的表面自组装金纳米探针及其制备方法与应用。

背景技术

纳米颗粒由于其特有的物理和化学性质已经广泛应用于生物学和医学领域，如：生物荧光标记(P.Hazarika，F.Kukolka，C.M.Niemeyer.Angew.Chem.Int.Ed.2006，45，6827-6830.)，DNA结构检测(H.Otsuka，Y.Nagasaki，K.Kataoka.Adv.Drug.Deliver.Rev.2003，55，403-419)，药物的输送与细胞成像(J.Chen.et.al.Nano.Lett.2005，5，473-477)等等。作为氧代谢生物体内产生的短寿命活性中间体，氧自由基在生物体系中具有不容忽视的生理学和病理学作用，尤其是超氧自由基(O₂·^-)以及伴随超氧自由基所接续生成的诸多活性氧自由基(ROS)。ROS在体内多承担或参与机体免疫防御、细胞凋亡与信号转导等多种生物学过程。因而借助对氧自由基的探测分析可以更加详尽地了解它们在生理条件下对细胞正常生理功能的调控规律及其引发诸多疾病过程(如高血压，癌症或糖尿病等)的分子机制(Finker，T.；Holbrook，N.J.Nature，2000，408，239-247)。Spin trapping-ESR方法正是一种应用普遍，且最为权威的自由基分析手段。然而，Spin trapping-ESR方法在生物体内的应用却受到现有硝酮类探针的自由基捕获性能(即与短寿命自由基发生加成反应生成更加稳定的顺磁性氮氧自由基自旋加合物的反应性能)的局限。这主要表现在：一、由于GSH(谷胱甘肽)与自由基反应的速度远快于硝酮类自由基探针与自由基反应的速度，因此GSH大大干扰探针与自由基形成稳定加合物的反应(R.P.Mason.Free.Radic.Biol.Med.2004，36，1214-1223)；二、由于硝酮类探针与自由基反应的速度很慢，通常对生物体系中自由基的检测需要相当高浓度(＞10mM)的硝酮类探针，而高浓度的硝酮类探针却易于导致细胞的凋亡(S.Pou，D.J.Hassett，B.E.et.al.Anal.Biochem.1989，177，1-6)。显而易见，硝酮类自由基探针技术在生物体系内的应用直接面临其反应动力学的瓶颈。

所幸，发明人在前期研究工作中发现：当维生素E(Trolox)表面自组装到金纳米颗粒的表面形成Trolox保护的金纳米颗粒后，它清除自由基的能力是维生素E(或Trolox)单体的8倍(Nie，Z et.al.Free.Radic.Biol.Med.2007，43，1243-1254)。另外，生物酶活体系中，催化基团高度集中于活性中心为高效率的酶催化过程提供了分子结构基础。为模拟这一体系，近年来化学家设计并合成出由诸多功能分子组装聚集起的自组装体系，并发现这些功能分子聚集体的化学活性要远大于其单分子活性的总和。在上述自组装体系中，最为新颖，并最令人感兴趣的莫过于功能单分子层保护的金纳米颗粒(AuNP)。AuNP以其独特的尺寸可控性(1-6nm)、分散稳定性与高度的可功能化的特色，使其成为一种研究有序功能基团组装并提高化学反应性的理想平台(Daniel，M.C.；Astruc，D.Chem.Rev.2004；104：293-346)。

鉴于此，发明人通过将EMPO(2-乙氧基酰基-2-甲基-3，4-二氢-吡咯啉-N-氧化合物)自组装在金纳米表面后反应速度提高的原理，实现了对活性自由基的高效捕获与探测。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有自由基捕获性能的表面自组装金纳米探针及其制备方法与应用。

本发明所提供的具有高效自由基捕获性能的表面自组装金纳米探针，是在金纳米颗粒表面通过式Ia或式Ib结构式所示的连接子连接式IIa、式IIb或式IIc结构式所示的硝酮类自由基探针配基；所述硝酮类自由基探针配基与所述连接子的R₃基团端连接，所述金纳米颗粒与所述连接子的巯基端连接；

式Ia和式Ib中，R₂为-OH、-NH₂或-COOH，n＝2-11，n₁＝1-4；

式IIc中，R₁为或-P(O)(OC₂H₅)₂，R₂为OH、COOH或CH₂OH；

(式Ia)    (式Ib)    (式IIa)    (式IIb)    (式IIc)。

上述表面自组装金纳米探针中，金纳米颗粒的金原子与硝酮类自由基探针配基的摩尔比为4-7∶1，优选4.5-4.7∶1；金纳米颗粒的平均粒径为1-6纳米，优选1.5-1.6纳米或4.5-4.6纳米。

本发明涉及具有高效自由基捕获性能的表面自组装金纳米探针的制备方法，具体包含下列两种方法：

方法一，包括如下步骤：

1)将式IIa所示硝酮类自由基探针配基与式IVa或式IVb所示的化合物进行酰基化反应，得到式IXa或式IXb所示的化合物；

或者，将式IIb所示硝酮类自由基探针配基与式IVa或式IVb所示的化合物进行酰基化反应，得到式IXa或式IXb所示的化合物；

或者，将式IIc结构式所示硝酮类自由基探针配基与式IVa或式IVb所示的化合物进行酰基化反应，得到式IXa或式IXb所示的化合物；

(式IXa)        (式IXb)

所述式IIc中，R₁为或-P(O)(OC₂H₅)₂，R₂为OH、COOH或CH₂OH；

所述式IVa和式IVb中，R为NH或O，n＝2-11，n₁＝1-4；

所述式IXa和式IXb中，

2)将所述步骤1)制备得到的式IXa或式IXb所示的化合物与金纳米颗粒进行配基交换反应，得到所述具有自由基捕获性能的表面自组装金纳米探针。

上述方法的步骤1)中，酰基化反应所用的缩合剂选自三(二甲基氨基)1-苯并三唑氧基六氟磷酸季鏻盐(BOP)、N，N-二环己基碳二酰亚胺(DCC)或1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI)。该步骤的反应温度为室温，反应时间为6-24小时，反应溶剂选自四氢呋喃、二甲基甲酰胺或二氯甲烷。

步骤2)中，反应温度为室温，反应溶剂为二氯甲烷或者体积比为1∶1的二氯甲烷和甲醇的混合液，反应时间为4-36小时。

方法二，包括如下步骤：

1)将式VIa、式VIb、式VIc或式VId所示化合物与金纳米颗粒进行配基交换反应，得到连接子修饰的金纳米颗粒；

(式VIa)

(式VIb)

(式VIc)

(式VId)

式VIa、式VIb、式VIc和式VId中，R为NH或O，n＝2-11，n₁＝1-4；

2)将所述步骤1)得到的连接子修饰的金纳米颗粒与式IIa、式IIb或式IIc结构式所示的硝酮类自由基探针配基进行酰基化反应，得到所述具有自由基捕获性能的表面自组装金纳米探针；

所述式IIc中，R₁为或-P(O)(OC₂H₅)₂，R₂为OH、COOH或CH₂OH；

上述方法的步骤1)中，反应温度为室温，反应溶剂为二氯甲烷或者体积比为1∶1的二氯甲烷和甲醇的混合液，反应时间为4-36小时；

步骤2)中，酰基化反应所用的缩合剂选自三(二甲基氨基)1-苯并三唑氧基六氟磷酸季鏻盐、N，N-二环己基碳二酰亚胺或1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐。反应温度为室温，反应时间为6-24小时，反应溶剂选自四氢呋喃、二甲基甲酰胺或二氯甲烷。

本发明中，所用金纳米颗粒是按照如下方法进行制备的：在水与甲苯组成的两相体系中，在三苯基膦(或者四辛基溴化铵)存在下，用过量的硼氢化钠还原氯金酸制的。其中氯金酸、三苯基膦(或者四辛基溴化铵)与硼氢化钠的摩尔比为1∶2-5∶10-20，优选1∶3.5∶15。

另外，本发明提供的上述具有自由基捕获性能的表面自组装金纳米探针在制备硝酮类自由基探针或抗氧化剂中的应用，也属于本发明的保护范围。

通过实验测试表明，本发明提供的具有高效自由基捕获性能的表面自组装金纳米探针，能实现对自由基的低浓度下高效快速捕获，因而可以作为一种新型的硝酮类自由基探针得到广泛的应用；同时，这种具有高效自由基捕获性能的表面自组装金纳米探针可以用做抗氧化剂而得到应用。

已有研究表明金纳米颗粒可以显著增强表面功能基团的化学反应性(Manea，F.；Houillon，F.B.；Pasquato，L.；Scrimin，P.Angew.Chem.Int.Edit.2004；43：6165-6169)，本发明将单分子层保护的金纳米颗粒应用到了硝酮类自由基探针的设计中，得到了具有高效自由基捕获性能的表面自组装金纳米探针。本发明具有如下技术特点：

1.本发明具有高效自由基捕获性能的表面自组装金纳米探针能够实现对自由基的低浓度快速反应。本发明通过将硝酮类自由基探针以及含有巯基的不同链长的烷基或者聚乙二醇配基自组装到金纳米颗粒的表面，通过在金表面形成局部高浓度的硝酮类自由基探针基团，从而实现了低浓度下加快硝酮类自由基探针与自由基的反应速度的目的，经测试其最低使用浓度小于25μM，捕获反应速率为EMPO的200-300倍。

2.本发明具有高效自由基捕获性能的表面自组装金纳米探针通过将含有硝酮类自由基探针基团的巯基配基自组装到金纳米颗粒上的方法来提高捕获反应速率和自由基分析灵敏度，此种方法合成过程简单，很容易实现。而且由于金纳米颗粒的生物相容性和低细胞毒性，不会引入不必要的细胞毒性。

附图说明

图1为实施例1具有高效自由基捕获性能的表面自组装金纳米探针B的紫外光谱图

图2为实施例1具有高效自由基捕获性能的表面自组装金纳米探针B的XPS(X射线能谱)谱图

图3为实施例1具有高效自由基捕获性能的表面自组装金纳米探针B的TEM(透射电镜)照片

图4为实施例2具有高效自由基捕获性能的表面自组装金纳米探针B的XPS谱图

图5为实施例2具有高效自由基捕获性能的表面自组装金纳米探针B的TEM照片

图6为实施例1所得具有高效自由基捕获性能的表面自组装金纳米探针在浓度为25μM时的羟基自由基捕获实验谱图

图7为实施例1所得具有高效自由基捕获性能的表面自组装金纳米探针在浓度为25μM时的碳中心和硫中心自由基捕获实验谱图

图8为实施例2所得具有高效自由基捕获性能的表面自组装金纳米探针在浓度为50μM时的超氧自由基捕获实验谱图

图9为实施例1所得具有高效自由基捕获性能的表面自组装金纳米探针与PBN的羟基自由基捕获竞争实验谱图

具体实施方式

本发明具有高效自由基捕获性能的表面自组装金纳米探针用如下结构式表示。

其中，R为O或NH，R’＝C(CH₃)₃，P(O)(OC₂H₅)₂，n＝2-11，n₁＝1-4，

结构式中，代表金纳米颗粒，硝酮类自由基探针通过配基R-(-CH₂-)-S-/R-(-CH₂CH₂O-)-S-连接到金纳米颗粒表面。需要说明的是，上述结构只是说明金纳米颗粒与硝酮类自由基探针之间的连接关系，不能理解为一个金纳米颗粒表面只链接一个硝酮类自由基探针。金纳米颗粒上的硝酮类自由基探针的数量可以通过如下关系确定：金纳米颗粒的金原子与硝酮类自由基探针的摩尔比，其具体数值可通过XPS结果给出，当摩尔比为2.5-2.7∶1时，硝酮类自由基探针在金纳米颗粒表面接近饱和。

本发明提供的具有自由基捕获性能的表面自组装金纳米探针，可通过以下两种方法制备。

方法一：

硝酮类自由基探针与含有ω-氨基或者羟基的烷基二硫化物(ω-氨基或者羟基的聚乙二醇基二硫化物)在非质子极性溶剂中(如四氢呋喃，N，N-二甲基甲酰胺，二氯甲烷)中发生酰化反应生成化合物A，接着与金纳米颗粒进行配基交换反应4-24小时，得到具有高效自由基捕获性能的表面自组装金纳米探针B。

其中，R为NH或O，n＝2-11，n₁＝1-4的整数

方法二：

将含有ω-氨基或者羟基的烷基硫醇(ω-氨基或者羟基的聚乙二醇基硫醇)、ω-羧基硫醇与金纳米颗粒进行配基交换反应6-24小时即得表面被配基修饰的金纳米颗粒，然后再由金纳米颗粒与硝酮类自由基探针发生酯化反应，即得到具有高效自由基捕获性能的表面自组装金纳米探针B，反应式如下：

其中，R为NH或O，n＝2-11，n₁＝1-4的整数

上述两种方法中，酰化反应均是按目前常用的酰化反应条件进行的，常见的缩合剂为三(二甲基氨基)1-苯并三唑氧基六氟磷酸季鏻盐(BOP)、N，N-二环己基碳二酰亚胺(DCC)或者1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI)等，反应温度为室温，溶剂为N，N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃，二氯甲烷等，反应时间为12-48小时。配基交换反应按如下条件进行：反应溶剂为二氯甲烷或者二氯甲烷和甲醇(体积比为1∶1)的混合溶剂，反应温度为室温，反应时间为4-24小时。

两种方法对于不同链长(n)的配基具有不同的选择性。由于ω-氨基或者羟基的短链烷基硫醇(聚乙二醇硫醇)、ω-羧基硫醇配基保护的具有高效自由基捕获性能的表面自组装金纳米探针(n≤4)稳定性不好，因此适宜采用方法一；而长链的化合物(n＞4)的有机分离过程比较困难，适宜采用方法二。

两种方法中，所用金纳米颗粒的制备过程如下：在水和甲苯组成的两相体系中，在三苯基膦(或者四辛基溴化铵)存在下，用过量的硼氢化钠还原氯金酸在剧烈搅拌下制得，所得金纳米颗粒的平均粒径为1-6nm，优选1.5nm(三苯基膦制备)，4.5nm(四辛基溴化胺制备)。在上述制备过程中，氯金酸、三苯基膦(四辛基溴化铵)、硼氢化钠的摩尔比为1∶2-5∶10-20，优选1∶3.5∶15。

以下通过具体实施例来说明本发明具有高效自由基捕获性能的表面自组装金纳米探针的制备和应用，实施例中氨基或者羟基的烷基硫醇或者二硫化物、羧基的烷基硫醇及其它原料均可购买得到，而氨基或者羟基的聚乙二醇基硫醇或二硫化合物、各种硝酮类自由基探针均是通过下述实施例中的具体方法制备而得。

实施例1、方法一制备具有高效自由基捕获性能的表面自组装金纳米探针B，R＝NH，n＝2。

制备化合物5(CMPO)

化合物1的制备

N₂保护下，向单口烧瓶中加入7.5mL乙醇，7.6mL吡啶，50mL氯仿。冰水浴下，缓慢滴入15mL氯仿和9.9mL的2-溴丙酰溴。室温下反应过夜，得淡黄色溶液。反应完成后，分别用10％H₂SO₄溶液，饱和NaHCO₃溶液洗涤，无水MgSO₄干燥。过滤后，旋蒸除去氯仿得到产物14g，减压蒸馏后得到8g产物(b.p＝43-45℃0.05mmHg)。产率49％。

化合物2的制备

单口瓶中加入10.8g NaNO₂，12.8g间苯三酚，60mL DMSO，搅拌至完全溶解，避光条件下，滴加上步产物。室温下反应3天。反应完成后，将反应液倒入冰水中，乙酸乙酯萃取，再用饱和Na₂CO₃溶液洗涤。无水Na₂SO₄干燥。旋蒸除去乙酸乙酯后，减压蒸馏(b.p＝78-80℃ 0.05mmHg)得产物5.5g。产率48％。

1.3化合物3的制备

N₂保护下，向单口烧瓶中加入50mL乙腈，0.7mL三乙胺，以及上步产物。冰水浴下滴入新蒸的丙烯醛5mL，约2小时滴完。冰浴中继续反应5小时。室温下，反应3天。反应完成后，将反应液倒入冰盐酸中，二氯甲烷萃取，无水Na₂SO₄干燥。旋蒸除去二氯甲烷后，减压蒸馏88-92℃(0.05mmHg)得产物6g。产率74％

1.4化合物4的制备

单口瓶中加入上步产物，使其溶解在18mL水和12mL甲醇的混合溶液中，再加入1.2g NH₄Cl的4.8mL水中的溶液。30min内加入8g锌粉，保持室温下反应4小时。过滤，滤饼用甲醇洗涤，合并滤液后浓缩，用硼砂饱和后，再用二氯甲烷萃取，无水Na₂SO₄干燥。过滤后，旋蒸除去二氯甲烷后得到产物通过柱分离(CH₂Cl₂∶C₂H₅OH＝20∶1)得产物2g。产率42％

1.5化合物5的制备

单口瓶中加入上步产物，加入20mL 2.5％的NaOH溶液，100℃下反应1小时，冷却后，过DOWEX-80，得白色固体1g，产率48％。m.p.＝135-136℃.IR：3500-3300(O-H)，1715(C＝O)，1585(C＝N-O).cm^-1.¹H-NMR(D₂O)δ：1.6(s，3H)，2.10-2.30(m，1H)，2.40-2.65(m，1H)，2.65-2.90(m，2H)，7.35(s，1H).m/z＝143.

2.化合物A的合成

取55mg(2.4×10^-4mol)ω-氨基乙基二硫化物盐酸盐，72mg(5×10^-4mol)CMPO，73.7mg，(6.0×10^-4mol)DMAP，81.6mg(6.0×10^-4mol)HOBt，267.2mg(6.0×10^-4mol)BOP，400-800μl(2.0-4.0×10^-3mol)NMM，溶于适量溶剂中，室温下反应12-24小时，除去溶剂后，用适量CH₂Cl₂溶解后，分别用HCl溶液，饱和NaHCO₃溶液，饱和NaCl溶液洗涤，无水Na₂SO₄干燥，柱分离得产品。

¹H-NMR(D₂O)δ：1.6(s，6H)，2.10-2.30(m，2H)，2.40-2.65(m，2H)，2.65-2.90(m，8H)，3.5(m，4H)，7.35(m，2H).

3.四辛基溴化铵保护的金纳米颗粒的制备

取5mL HAuCl₄水溶液(30.0mM)和14mL四辛基季胺盐的甲苯溶液(50mM)相互混合，搅拌30分钟使HAuCl₄在四辛基的协助下充分进入有机层，最终水层透明而甲苯层变变为酒红色，完全加入后继续搅拌2小时直至反应完全。分离有机层，室温下变为宝石红色。然后在剧烈搅拌的条件下逐滴加入过量的硼氢化钠8毫升(0.2M)，随着滴加的进行，甲苯层逐渐发生由宝石红-白-灰-褐-深氮气吹干。

4.制备目标化合物-具有高效自由基捕获性能的表面自组装金纳米探针B

将步骤3得到的金纳米颗粒10mg溶于5毫升溶剂中，再与15mg化合物A，在氮气氛围下室温搅拌6-24小时直至配基交换反应完全。除去溶剂后将金纳米颗粒的粗产物溶于甲醇，经葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱分离除去副产物、过量的TOAB以及剩余的巯基配基。提纯后的具有高效自由基捕获性能的表面自组装金纳米探针以干粉的形式存储于-20℃备用。

其红外谱图上在1731处有强的C＝O吸收峰，说明金纳米颗粒上已经连接有EMPO；如图2，X射线光电子能谱(XPS)结果表明具有高效自由基捕获性能的表面自组装金纳米探针B中的金原子与表面硝酮类自由基探针之数比为5∶1，透射电镜(TEM)结果表明具有高效自由基捕获性能的表面自组装金纳米探针B的平均粒径为4.5±0.5nm。

实施例2、制备具有高效自由基捕获性能的表面自组装金纳米探针B(R＝O，n＝11)

1.四辛基溴化铵保护的金纳米颗粒的制备过程如实施例1。

2.取10mg四辛基溴化铵保护的金纳米颗粒，8.6mgω-羟基十一烷基硫醇溶于适量溶剂中，室温条件下搅拌6-24小时。反应结束后，蒸除溶剂后，将所得剩余物溶于甲醇中，通过Sephadex LH-20提纯后，得到纯化的金纳米颗粒C(R＝O，n＝11)。其红外谱图的特征吸收峰在3358处有羟基吸收峰；XPS结果表明金纳米颗粒C(R＝O，n＝11)中金原子与硫原子之比为4.5∶1；TEM结果表明平均粒径为4.5±0.5nm。

3.取20mg金纳米颗粒C(R＝O，n＝11)，分别加入CMPO 20mg，BOP 138mg，HOBt 74mg，DMAP 62mg，NMM 400-800μl，再加入适量溶剂，室温下搅拌16-48小时，除去溶剂后，将剩余物溶于甲醇，然后通过凝胶色谱柱Sephadex LH-20提纯后，得到目标产物-具有高效自由基捕获性能的表面自组装金纳米探针B(R＝O，n＝11)。

具有高效自由基捕获性能的表面自组装金纳米探针B(R＝O，n＝11)经过红外光谱检测，在1731处有C＝O的振动吸收峰；XPS结果及透射电镜(TEM)结果表明，所得到的平均粒径与金纳米颗粒C(R＝O，n＝11)相同。

实施例3、制备具有高效自由基捕获性能的表面自组装金纳米探针B(R＝O，n＝4)

1.四辛基溴化铵保护的金纳米颗粒的制备过程如实施例1。

2.取55mg(2.4×10^-4mol)ω-氨基丁基二硫化物盐酸盐，72mg(5×10^-4mol)CMPO，73.7mg(6.0×10^-4mol)DMAP，81.6mg(6.0×10^-4mol)HOBt，267.2mg(6.0×10^-4mol)BOP，400-800μl(2.0-4.0×10^-3mol)NMM，溶于适量溶剂中，室温下反应12-24小时，除去溶剂后，用适量CH₂Cl₂溶解后，分别用HCl溶液，饱和NaHCO₃溶液，饱和NaCl溶液洗涤，无水Na₂SO₄干燥。柱分离得产物60mg。¹H-NMR(400MHz，CHCl₃)δ：1.33(s，6H)，1.40-1.56(m，16H)，2.56(t，4H)，3.20(t，4H)，7.35(t，2H)，8.10(m，2H).

3.将四辛基溴化铵保护的金纳米颗粒10mg溶于适量溶剂中，加入14.2mg上步产物的，室温搅拌6-24小时直至配基交换反应完全。除去溶剂后将金纳米颗粒的粗产物溶于甲醇，经葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱分离，得到纯化的目标产物-具有高效自由基捕获性能的表面自组装金纳米探针B(R＝O，n＝4)。

具有高效自由基捕获性能的表面自组装金纳米探针的红外光谱与实施例2所得的具有高效自由基捕获性能的表面自组装金纳米探针相同；X射线光电子能谱(XPS)结果表明具有高效自由基捕获性能的表面自组装金纳米探针B中的金原子与硫原子之比为6∶1；透射电镜(TEM)结果表明具有高效自由基捕获性能的表面自组装金纳米探针B的平均粒径为4.5±0.5nm。

实施例4、制备具有高效自由基捕获性能的表面自组装金纳米探针B(R＝O，n＝1)

1.化合物8的合成

1.1化合物6的合成

单口烧瓶中加入15g(0.01mol)(n＝1)多聚乙二醇，7.5mL(0.07mol)三乙胺，150mL二氯甲烷，分批加入9g(0.005mol)对甲苯磺酰氯，室温下反应14小时，用NaHSO₄溶液，5％NaHCO₃洗涤，无水硫酸钠干燥，柱分离得产物9g。¹H-NMR(300MHz，CDCl₃).δ：7.8-7.31(m，4H)；4.14(t，2H)；3.67(t，2H)；3.61-3.19(m，10H)；2.43(s，3H).

1.2化合物7的合成

单口瓶中加入上步产物9g(0.029mol)，NaI·9H₂O 11g(0.036mol)，以及50mL丙酮回流反应过夜，过滤除去沉淀，除去溶剂后，柱分离得产物5g。¹H-NMR(300MHz，CDCl₃).δ：7.8-7.31(m，4H)；4.14(t，2H)；3.67(t，2H)；3.61-3.19(m，10H)；2.43(s，3H).

1.3化合物8的合成

单口瓶中加入2.9g(0.01mol)化合物7，加入NaSH的甲醇溶液10mL，室温下，搅拌4小时。柱分离得产物4g。¹H-NMR(300MHz，CDCl₃).δ：4.91(s，1H)；3.52-3.60(m，8H)；3.44(t，2H)；2.7(t，2H)；1.8(s，1H).

2.四辛基溴化铵保护的金纳米颗粒的制备过程如实例1所述。

3.取10mg四辛基溴化铵保护的金纳米颗粒，8.6mg化合物8溶于适量溶剂中，室温条件下搅拌6-24小时。反应结束后，蒸除二氯甲烷后，将所得剩余物溶于甲醇中，通过Sephadex LH-20提纯后，得到纯化的金纳米颗粒C(R＝O，n＝1)。其红外谱图的特征吸收峰在3358处有羟基吸收峰；XPS结果表明金纳米颗粒C(R＝O，n＝1)中金原子与硫原子之比为6∶1；TEM结果表明平均粒径为4.5±0.5nm。

4.取20mg金纳米颗粒C(R＝O，n＝1)，分别加入CMPO 37mg，BOP 138mg，HOBt 74mg，DMAP 62mg，NMM 400-800μl，再加入适量溶剂，室温下搅拌12-24小时，除去溶剂后，将剩余物溶于甲醇，然后通过凝胶色谱柱Sephadex LH-20提纯后，得到目标产物-具有高效自由基捕获性能的表面自组装金纳米探针B(R＝O，n＝1)。

具有高效自由基捕获性能的表面自组装金纳米探针C(R＝O，n＝1)经过红外光谱检测，在1731处有C＝O的振动吸收峰；具有高效自由基捕获性能的表面自组装金纳米探针B(R＝O，n＝1)的XPS结果与金纳米颗粒C相同，其透射电镜(TEM)结果表明，所得到的平均粒径与金纳米颗粒C(R＝O，n＝1)相同。

实施例5、制备具有高效自由基捕获性能的表面自组装金纳米探针B(R＝N，n＝2)

1.化合物11的合成

1.1化合物9的合成

单口瓶中加入三聚乙二醇1.96g(13mmol)(n＝2)，四氢呋喃20mL，三苯基膦7g(26.7mmol)，CBr₄ 8.7g(26.2mmol)。反应5小时，滤除白色沉淀后，蒸除溶剂，剩余物溶于二氯甲烷中，加入正己烷后，出现白色沉淀，过滤再除去白色沉淀，浓缩后所得产物柱分离(正己烷和乙酸乙酯体积比4∶1)。

¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ3.49(t，4H)，3.69(s，4H)，3.83(t，4H)

1.2化合物10的合成

单口瓶中加入1.25g(4.56mmol)化合物9，5mL THF，再加入0.844g(4.56mmol)邻苯二甲酰亚胺钾盐的3mL DMF溶液，加热回流反应5小时，蒸除溶剂后，剩余物溶于乙酸乙酯中，水洗，饱和食盐水洗，无水硫酸镁干燥。柱分离(正己烷和乙酸乙酯体积比2∶1)。¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ3.31(t，2H)，3.56(m，4H)，3.66(m，4H)，3.83(t，2H)，7.6-7.8(m，4H).

化合物9溶于10mL乙腈中，加入0.755g(5.45mmol)碳酸钾，硫代乙酸0.39mL(5.45mmol)。加热回流反应2小时。蒸除溶剂后，剩余物溶于乙酸乙酯中，NH₄Cl洗，盐水洗，无水MgSO₄干燥。柱分离(正己烷和乙酸乙酯体积比1∶1)。¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ2.23(s，3H)，2.94(t，2H)，3.44(t，2H)，3.49(m，2H)，3.54(m，2H)，3.66(t，2H)，3.81(t，2H)，7.6-7.8(m，4H).

1.3化合物11的合成

化合物10溶于15mL甲醇中，加入0.55mL(17mmol)水合肼。搅拌反应5小时。除去溶剂后，柱分离。¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ2.64(t，2H)，2.88(t，2H)，3.52(t，2H)，3.56(t，2H)，3.57(s，4H).

2.四辛基溴化铵保护的金纳米颗粒的制备过程如实例一所述。

3.取10mg四辛基溴化铵保护的金纳米颗粒，25mg化合物11溶于适量溶剂中，室温条件下搅拌6-24小时。反应结束后，蒸除二氯甲烷后，将所得剩余物溶于甲醇中，通过Sephadex LH-20提纯后，得到纯化的金纳米颗粒C(R＝O，n＝1)。其红外谱图的特征吸收峰在3358处有羟基吸收峰；XPS结果表明金纳米颗粒C(R＝O，n＝1)中金原子与硫原子之比为4.5∶1；TEM结果表明平均粒径为4.5±0.5nm。

4.取20mg金纳米颗粒C(R＝O，n＝1)，分别加入CMPO 37mg，BOP 138mg，HOBt 74mg，DMAP 62mg，NMM 400-800μl，再加入适量溶剂，室温下搅拌16-48小时，除去溶剂后，将剩余物溶于甲醇，然后通过凝胶色谱柱Sephadex LH-20提纯后，得到目标产物-具有高效自由基捕获性能的表面自组装金纳米探针B(R＝O，n＝1)。具有高效自由基捕获性能的表面自组装金纳米探针C(R＝O，n＝1)经过红外光谱检测，在1731处有C＝O的振动吸收峰；具有高效自由基捕获性能的表面自组装金纳米探针B(R＝O，n＝1)的XPS结果与金纳米颗粒C相同，其透射电镜(TEM)结果表明，所得到的平均粒径与金纳米颗粒C(R＝O，n＝1)相同。

实施例6、制备具有高效自由基捕获性能的表面自组装金纳米探针B(R＝O，n＝2)

1.化合物A的合成

取55mg(2.4×10^-4mol)ω-羟基聚乙二醇基二硫化物盐酸盐，72mg(5×10^-4mol)CMPO，73.7mg(6.0×10^-4mol)DMAP，81.6mg(6.0×10^-4mol)HOBt，267.2mg(6.0×10^-4mol)BOP，400-800μl(2.0-4..0×10^-3mol)NMM，溶于适量溶剂中，室温下反应12-24小时，除去溶剂后，用适量CH₂Cl₂溶解后，分别用HCl溶液，NaHCO₃溶液，无水Na₂SO₄干燥。柱分离得产物。¹H-NMR(400MHz，CHCl₃)δ：1.33(s，6H)，1.40-1.70(m，8H)，2.73(t，4H)，3.54-3.70(m，16H)，4.25(t，4H)，7.35(m，2H).

2.四辛基溴化铵保护的金纳米颗粒的制备：

取5mL HAuCl₄水溶液(30.0mM)和14mL四辛基季胺盐的甲苯溶液(50mM)相互混合，搅拌30分钟使HAuCl₄在四辛基的协助下充分进入有机层，最终水层透明而甲苯层变为宝石红色。然后在剧烈搅拌的条件下逐滴加入过量的硼氢化钠8毫升(0.2M)，随着滴加的进行，甲苯层逐渐发生由宝石红-白-灰-褐-深酒红色的颜色变化，完全加入后继续搅拌2小时直至反应完全。分离有机层，室温下氮气吹干。

3.制备目标化合物-具有高效自由基捕获性能的表面自组装金纳米探针B

将步骤2得到的金纳米颗粒10mg溶于适量溶剂中，再加入30mg化合物A，在氮气氛围下室温搅拌12-24小时直至配基交换反应完全。除去溶剂后将金纳米颗粒的粗产物溶于甲醇，经葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱分离除去副产物、过量的TOAB以及剩余的巯基配基。提纯后具有高效自由基捕获性能的表面自组装金纳米探针以干粉的形式存储于-20℃备用。

其红外谱图上在1733处有强的C＝O吸收峰，说明金纳米颗粒上已经连接有EMPO；X射线光电子能谱(XPS)结果表明具有高效自由基捕获性能的表面自组装金纳米探针B中的金原子与表面硝酮类自由基探针之数比为6.5∶1，透射电镜(TEM)结果表明具有高效自由基捕获性能的表面自组装金纳米探针B的平均粒径为4.5±0.5nm。

实施例7、制备具有高效自由基捕获性能的表面自组装金纳米探针B(R＝O，n＝11)

1.化合物A的合成

取50.4mg(2.4×10^-4mol)ω-羧基二硫化物盐酸盐，103.5mg(5×10^-4mol)对羟乙基PBN，73.7mg(6.0×10^-4mol)DMAP，81.6mg(6.0×10^-4mol)HOBt，267.2mg(6.0×10^-4mol)BOP，400-800μl(2.0-4..0×10^-3mol)NMM，溶于适量溶剂中，室温下反应16-48小时，除去溶剂后，用适量CH₂Cl₂溶解后，分别用稀盐酸溶液，NaHCO₃溶液，无水Na₂SO₄干燥。柱分离得产物。¹H-NMR(400MHz，CHCl₃)δ：1.30(s，18H)，2.54(t，4H)，2.80-3.10(m，8H)，4.40(t，4H)，7.34(d，4H)，7.80(d，4H)，8.25(s，2H).

2.四辛基溴化铵保护的金纳米颗粒的制备：

取5mL HAuCl₄水溶液(30.0mM)和14mL四辛基季胺盐的甲苯溶液(50mM)相互混合，搅拌30分钟使HAuCl₄在四辛基的协助下充分进入有机层，最终水层透明而甲苯层变为宝石红色。然后在剧烈搅拌的条件下逐滴加入过量的硼氢化钠8毫升(0.2M)，随着滴加的进行，甲苯层逐渐发生由宝石红-白-灰-褐-深酒红色的颜色变化，完全加入后继续搅拌2小时直至反应完全。分离有机层，室温下氮气吹干。

3.制备目标化合物-具有高效自由基捕获性能的表面自组装金纳米探针B

将步骤3得到的金纳米颗粒10mg溶于适量溶剂中，加入35mg化合物A，室温搅拌12-24小时直至配基交换反应完全。除去溶剂后将金纳米颗粒的粗产物溶于甲醇，经葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱分离除去副产物、过量的TOAB以及剩余的巯基配基。提纯后的具有高效自由基捕获性能的表面自组装金纳米探针以干粉的形式存储于-20℃备用。

其红外谱图上在1568处有强的C＝N吸收峰，说明金纳米颗粒上已经连接有PBN；X射线光电子能谱(XPS)结果表明具有高效自由基捕获性能的表面自组装金纳米探针B中的金原子与表面硝酮类自由基探针之数比为5∶1，透射电镜(TEM)结果表明具有高效自由基捕获性能的表面自组装金纳米探针B的平均粒径为4.5±0.5nm。

实施例8、合成具有高效自由基捕获性能的表面自组装金纳米探针B(R＝N，n＝1)

1.化合物13的合成

1.1化合物12的合成

取0.119g化合物11 5mL THF中，向其中滴加0.22g(7.9×10^-4mol)三苯基氯甲烷。50℃下反应4小时。蒸除溶剂后，柱分离得无色液体0.145g。¹H-NMR(400MHz，CHCl₃)δ：2.40(t，2H)，3.11(br，2H)，3.26(t，2H)，3.42(br，2H)，3.50(br，2H)，3.69(br，2H)，7.1-7.5(m，15H).

1.2化合物13的合成

取0.145g化合物12，溶于5mL DMF中，向其中加入DMAP(52mg，4.26×10^-4mol)，EDC(82mg，4.5×10^-4mol)。室温下继续反应12-24小时。柱分离得到产物。将所得产物溶于10％三氟乙酸的二氯甲烷中，再向其中滴加三乙基硅烷(30μl)。室温下搅拌1小时。柱分离得产物。¹H-NMR(400MHz，H₂O)δ：1.36(s，3H)，1.60-2.10(m，4H)，2.73(m，2H)，3.40-3.70(m，10H)，7.35(m，1H).

2.四辛基溴化铵保护的金纳米颗粒的制备

取5mL HAuCl₄水溶液(30.0mM)和14mL四辛基季胺盐的甲苯溶液(50mM)相互混合，搅拌30分钟使HAuCl₄在四辛基的协助下充分进入有机层，最终水层透明而甲苯层变为酒红色，完全加入后继续搅拌2小时直至反应完全。分离有机层，室温下变为宝石红色。然后在剧烈搅拌的条件下逐滴加入过量的硼氢化钠8毫升(0.2M)，随着滴加的进行，甲苯层逐渐发生由宝石红-白-灰-褐-深，氮气吹干。

3.制备目标化合物-具有高效自由基捕获性能的表面自组装金纳米探针B

将步骤2得到的金纳米颗粒10mg溶于适量溶剂中，再加入16mg化合物16，在氮气氛围下室温搅拌12-24小时直至配基交换反应完全。除去溶剂后将金纳米颗粒的粗产物溶于甲醇，经葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱分离除去副产物、过量的TOAB以及剩余的巯基配基。提纯后的具有高效自由基捕获性能的表面自组装金纳米探针以干粉的形式存储于-20℃备用。

其红外谱图上在1731处有强的C＝O吸收峰，说明金纳米颗粒上已经连接有EMPO；X射线光电子能谱(XPS)结果表明具有高效自由基捕获性能的表面自组装金纳米探针B中的金原子与表面硝酮类自由基探针之数比为5∶1，透射电镜(TEM)结果表明具有高效自由基捕获性能的表面自组装金纳米探针B的平均粒径为4.5±0.5nm。

实施例9、合成具有高效自由基捕获性能的表面自组装金纳米探针B(R＝N，n＝1)

1.四辛基溴化铵保护的金纳米颗粒的制备过程如实例1所述。

2.取10mg四辛基溴化铵保护的金纳米颗粒，8.6mg化合物11溶于适量溶剂中，室温条件下搅拌6-16小时。反应结束后，蒸除溶剂后，将所得剩余物溶于甲醇中，通过Sephadex LH-20提纯后，得到纯化的金纳米颗粒C(R＝O，n＝1)。其红外谱图的特征吸收峰在3358处有羟基吸收峰；XPS结果表明金纳米颗粒C(R＝O，n＝1)中金原子与硫原子之比为4.5∶1；TEM结果表明平均粒径为4.5±0.5nm。

3.取20mg金纳米颗粒C(R＝O，n＝1)，分别加入AMPO 37mg，BOP 238mg，HOBt74mg，DMAP 62mg，NMM 400-600μl，再加入适量溶剂，在室温下搅拌12-48小时，除去溶剂后，将剩余物溶于甲醇，然后通过凝胶色谱柱Sephadex LH-20提纯后，得到目标产物-具有高效自由基捕获性能的表面自组装金纳米探针B(R＝O，n＝1)。具有高效自由基捕获性能的表面自组装金纳米探针C(R＝O，n＝1)经过红外光谱检测，在1731处有C＝O的振动吸收峰；具有高效自由基捕获性能的表面自组装金纳米探针B(R＝O，n＝1)的XPS结果与金纳米颗粒C相同，其透射电镜(TEM)结果表明，所得到的平均粒径与金纳米颗粒C(R＝O，n＝1)相同。

实施例10、具有高效自由基捕获性能的表面自组装金纳米探针的自由基捕获实验

1.羟基自由基捕获实验

实验中羟基自由基(HO^·)由Fenton反应产生，具体如下：将Fe²⁺(2mM)加到含有自组装金纳米探针(25μM)，H₂O₂(0.2％)及EDTA(2mM)的磷酸缓冲溶液(0.1M，pH 7.4)中。在具有高效自由基捕获性能的表面自组装金纳米探针B存在下，得到了如图所示的ESR信号，而且在加入氧化氢酶(Catalase，3600U mL^-1)或在未加H₂O₂的情6况下均检测不到该信号，这就说明该信号的产生与Fenton体系产生的HO·直接相关。

2.其他碳中心自由基的捕获实验

采用Fenton体系外加醇的方法得到了一系列的α-羟基烷基自由基，在这些体系中加入具有高效自由基捕获性能的表面自组装金纳米探针B(25μM)，得到了相类似的ESR谱图，如图7，均有五条谱峰组成，且有谱峰变宽的现象。

3.超氧自由基的捕获实验

超氧自由基是由超氧化钾和N，N-二甲基甲酰胺体系产生，在此体系中加入具有高效自由基捕获性能的表面自组装金纳米探针B(50μM)，得到的超氧自由基加合物的谱图，如图8，是由六条峰组成的。

实施例11、具有高效自由基捕获性能的表面自组装金纳米探针与PBN(α-苯基-N-叔丁基硝酮)的羟基捕获竞争实验

具有高效自由基捕获性能的表面自组装金纳米探针B捕获光照H₂O₂产生的OH自由基会产生ESR信号。具有高效自由基捕获性能的表面自组装金纳米探针B(0-25μM)捕获OH自由基的速率常数是由其与PBN(10μM)的竞争实验得到的。相对于存在具有高效自由基捕获性能的表面自组装金纳米探针B和不存在具有高效自由基捕获性能的表面自组装金纳米探针B，PBN的ESR谱图的第一、第二条峰位置基本上没有发生变化。因此采用测量第二条峰强度的方法(F.A.Villamena，C.M.Hadad，J.L.Zweier.J.Phys.Chem.A 2003，107，4407-4414)来计算具有高效自由基捕获性能的表面自组装金纳米探针B捕获OH的速率常数。测量第一、二条峰的强度，并将数据用于如下方程得其速率常数：

V-PBN不存在具有高效自由基捕获性能的表面自组装金纳米探针时的捕获速率

v-PBN存在具有高效自由基捕获性能的表面自组装金纳米探针时的捕获速率

K_Au@EMPO具有高效自由基捕获性能的表面自组装金纳米探针的OH捕获速率常数

K_PBNPBN的OH捕获速率常数

[PBN]-PBN的浓度

[Au@EMPO]-Au@EMPO的浓度

Au@EMPO代表具有高效自由基捕获性能的表面自组装金纳米探针B

采用[1]式得到了关于Au@EMPO的OH反应速率常数k_Au@EMPO＝8.26×10¹²M-1S^-1，其结果如图9所示。Au@EMPO和OH^·的反应速率是EMPO的200倍。这个结果证明了我们的预想，将EMPO基团自组装在金纳米颗粒表面能够显著增强其反应活性，同时也证明这种基于金纳米颗粒的高效捕获自由基的设计思路的有效性。