基于可逆固定化酶的量热式生物传感器

摘要

本发明涉及一种结合可逆固定化酶的量热式生物传感器，系统由恒流泵、注入阀、恒温器、微反应器、检测器和循环流路等组成。其特征是注入阀除对酶液、底物、载流和试剂等进行组合和控制，并能实现循环模式，就是微反应器流出液重新进入恒温器循环通过微反应器，实现可逆固定化。结合可逆固定化酶技术的量热式生物传感器可实现酶的反应器装载(固定化)和反应器卸载(逆固定化)，无需更换载体便可在线切换测试物和酶种类。其省略预制固定化酶步骤，节省了时间和经济成本，并能降低干扰，应用在多试样和组合测试时尤其灵活方便。本发明提高了系统的集成化和自动化程度，同时加强和扩展了传统量热式生物传感器的功能和反应模式。

说明书

技术领域

本发明专利涉及一种结合可逆固定化酶技术的量热式生物传感器，能够应用在食品、医药、生化、环境和化工等领域的现场及在线多试样和组合测试与分析。

背景技术

目前，分析设备向着准确化、集成化与自动化的方向发展。要求能够用更低的消耗、更简便的方法和设备、更快的分析速度提供实时、准确、全面的信息。

量热式生物传感器是通过测量生化反应过程产生的热量变化来进行分析的生物传感器。量热式生物传感器通用性强，适用于绝大多数的生化样品。另外其不受颜色、浑浊和电化学等样品属性的影响，尤其适合于检测未经处理的实际样品和现场、在线组合分析检测。量热方法简便、可靠、快速、灵敏度高，并有利于微型系统的开发。但量热式生物传感器的缺点是基线稳定时间长、易受干扰。

基于稳定性及重复利用的考虑，传统的量热式生物传感器往往结合固定化酶，并采用交联、包埋等方法预制备，其步骤烦琐、增加成本，并且保证固定化酶在长时间的制备、贮藏、运输和检测过程中维持均一、稳定的活性，即固定化酶的标准化，是一个复杂的问题。尤其重要的是，对于进行不可逆抑制剂(像农药、重金属等有毒物质)检测时，不能重复使用，额外增加了成本。另外，现场及在线多试样和组合分析测试要求频繁更换试剂和酶种类，将人为引入干扰，这大大影响了量热式生物传感器在现场及在线测试中的高效、稳定使用。

可逆固定化酶技术是利用官能团、pH、温度等特征条件，控制酶固定在载体上的可逆过程。结合可逆固定化酶技术的量热式生物传感器十分方便地在载体上在线装载酶，即固定化，也可在线卸载酶，即逆固定化。无需更换载体便可切换测试物和固定化酶的种类，操作灵活方便，还可降低干扰。同时，省略了预制备固定化酶的过程，节省时间和经济成本，并能回收酶，对昂贵的酶种，尤为重要。

发明内容

本发明的目的是通过提供一种能通过交互反应、pH、温度等方式控制酶的可逆固定化过程的量热式生物传感器，其灵活方便、适用性强，尤其适用于现场、在线多试样和组合测试。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种基于可逆固定化酶的量热式生物传感器系统，包括恒流泵、注入阀、恒温器、微反应器、检测器和循环流路等。其特点是恒流泵提供载流、酶液和试剂的定流量输送的动力；注入阀实现样液、载流和试剂等的组合和控制。并可切换工作模式，即开路模式和循环模式，前者将微反应器的流出液排出系统，作为废液或回收利用，后者将微反应器的流出液重新通过恒温器循环进入微反应器，进行酶的固定化；恒温器使样液、载流和试剂等的组合在进入微反应器前恒定达到设定温度，并能通过调节设定温度来改变反应温度；微反应器内部填充酶可逆固定化的功能载体(吸附材料、高分子材料、凝胶等)；用于检测器的热传感器检测微反应器中热量的变化，其输出端分别与处理、显示单元和计算机相连接，进行信号处理，并显示；恒温器、微反应器及连接管路和热传感器均放置在绝热环境中。基于可逆固定化酶的量热式生物传感器采用如下检测流程：第一步，准备和稳定过程，在微反应器中自然堆积填充功能载体，整个系统通入载流并至系统稳定，获得稳定基线；第二步，酶装载(固定化)过程，切换注入阀门，工作在循环模式，此时载流、酶液和试剂混合物定流量循环流过微反应器，过程持续设定时间作为固定时间，酶被固定到功能载体上；第三步，反应及检测过程，切换注入阀门，工作在开路模式，底物被引入系统，在微反应器中的功能载体上进行酶反应。热传感器全程监测反应器中各种反应放出的热量变化，其信号变化反映了酶反应程度；第四步，卸载过程，是逆固定化过程，改变酶固定化的控制条件，酶从载体上脱离，微反应器的流出液可以作为废液，也可以用于回收酶；第五步，通入载流，排除微反应器及流路中的残液，进行下一测试。所述的系统流程，每步分别对应相应的程序和控制，实现流速和切换等操作。

本发明的有益效果是基于可逆固定化的量热式生物传感器省去预制固定化酶的环节，节省了时间和经济成本，能够灵活、方便、快速地更换测试物或酶种类，简化步骤、降低干扰。提高了检测的自动化和集成化程度，扩展并优化了传统量热式生物传感器的功能和反应模式。

附图说明

图1为基于可逆固定化酶的量热式生物传感器系统

图2为基于可逆固定化酶的量热式生物传感器多试样组合分析示意图

具体实施方式

本发明结合附图作一说明，如图1所示基于可逆固定化酶的量热式生物传感器系统。其中C为载流；E为酶液；S为底物；R为试剂；P为恒流泵；V为注入阀；T为恒温器；M为微反应器；D为检测器；C & D为信号处理及显示单元；PC为计算机；W为废液。恒流泵P实现载流C、酶液E、底物S和试剂R等的设定流量的传输，恒流保证了系统的重现性和精度；通过注入阀V实现载流C、酶液E、、底物S试剂R间的切换和自由组合，完成定时、定量注入，实现程序控制和自动进样等操作。并可实现开路模式和循环模式的切换，开路模式使流出微反应器M的流出液排出系统，作为废液或回收利用，循环模式就是流出液重新通过恒温器T循环通过微反应器M；恒温器T对进入微反应器的载流C、酶液E、底物S或试剂R的混合物进行恒温，能保证反应在最适温度条件下的重现性；微反应器M内部填充固定化载体(吸附材料、高分子材料、凝胶等)，用于酶的可逆固定化；作为检测器的热传感器D得到微反应器M中的反应热信号，并经信号处理及显示单元C & D，或与计算机PC连接，进行信号处理并显示；恒温器T、微反应器M及相连管路和检测器D外部的绝热环境，能有效消除热损失，提高精度。使用上述基于可逆固定化酶的生物传感器系统的具体实施检测流程为：第一步，准备和稳定过程，在微反应器M中自然堆积填充富集载体，开启恒流泵P和恒温器T。通入载流C至系统稳定，获得稳定基线。第二步，切换注入阀V，酶液E、试剂R与载流C的混合物定流量流过微反应器M，为固定过程，持续设定时间作为固定时间。此时，酶被固定到固定化载体上；第三步，反应及检测过程，切换注入阀V，引入底物S、试剂R和载流C的混合物定流量流过微反应器M，并在其中的固定化载体上进行酶反应。热传感器D-全程监测微反应器中各种反应放出的热量变化，其信号变化被信号处理及显示单元C & D或计算机PC处理后显示；第四步，卸载过程，即逆固定化过程，改变酶固定化的控制条件，酶从固定载体上脱离，微反应器M的流出液不循环使用，可以作为废液，也可以用于酶的回收；第五步，切换注入阀V，载流C冲刷系统流路，排除微反应器M及流路中的残液，并稳定基线，进行下一测试。

图2给出了上述基于可逆固定化酶的量热式生物传感器实施多试样组合分析的示意图。箭头标记的含义分别为a、开始控制逆固定化条件(引入逆固定化试剂、调节温度等)，进行酶的卸载过程；b、引入载流，稳定系统基线；c、引入酶液、试剂和载流组合，进行酶的固定化；S1、引入酶E1对应的底物S1进行反应；S2、引入酶E2对应的底物S2进行反应。以两种酶E1和E2的相关测试为例说明。首先引入载流C进行系统的稳定过程，在获得稳定基线后，进行酶E1的测试，通过引入酶液E1、试剂R和载流C的混合物，进行酶的固定化。测试时，引入底物S1，进行酶反应，重复引入底物S1，可以连续多试样测试。测试完毕后系统通入载流C，稳定基线。转换控制逆固定化酶的条件，通过引入逆固定化试剂、调节pH和温度等，进行酶E1的逆固定化过程。然后引入载流C清除系统内残液，并稳定基线。随后进行的是酶E2的测试，引入酶液E2、试剂R和载流C的混合物，进行酶的固定化，引入底物S2，进行酶反应，测试完毕后引入载流C，稳定基线，进入下一测试循环。

根据控制方式的不同，提供基于可逆固定化酶的量热式生物传感器检测过氧化氢的两个测试例。过氧化氢在过氧化氢酶的作用下进行如下反应，利用基于可逆固定化酶的量热式生物传感器测试过程的反应焓，来反映过氧化氢的量。

2H₂O₂→2H₂O+O₂+ΔH

测试例1：

依靠抗原-抗体交互反应控制可逆固定化过程。固定化载体为琼脂糖凝胶，功能团为兔抗人血清白蛋白(anti-HSA)，底物为过氧化氢。载流为0.1M、pH7.0磷酸钾的缓冲液。流速设定为1ml/min，反应温度为30℃。使用20U/ml的过氧化氢酶和人血清白蛋白(HSA)混合液进行固定，固定时间为2min。0.2M、pH2.2的甘氨酸-盐酸和缓冲液混合液冲刷固定化酶，进行卸载，时间为2min。

测试例2：

依靠pH控制可逆固定化过程。固定化载体为陶瓷羟基磷灰石，底物为过氧化氢。流速设定为0.1ml/min，反应温度为30℃。5mM、pH6.5磷酸盐缓冲液，pH6.5、20U/ml的过氧化氢酶液混合物进行固定，固定时间20分钟。引入缓冲液，改变缓冲液的pH和离子强度，进行卸载，时间为10min。