棉纤维化学修饰可逆固定化酶载体的制备及其对β-半乳糖苷酶的固定化

摘要

酶催化反应具有高效性、底物专一性、反应条件温和等优点,具有节能的优势,因而酶催化在食品工业、生物化工工业等领域应用潜力巨大。同游离酶相比,固定化酶具有易于分离、反复利用,酶污染小等特点,实现了连续化生产和成本的降低,近年来已在生物、食品、医学等领域得到广泛应用。固定化酶的催化效率与固定化效率紧密相关,而影响固定化效率的两个重要因素是固定化载体及固定化方法的选择。本文对棉纤维进行化学修饰、共价接枝聚乙烯亚胺,制备了聚阳离子离子吸附型固定化酶载体,研究了该固定化载体对乳糖酶的固定化效率,探讨了该固定化酶连续催化水解乳糖。
　　开发了表面接枝聚乙烯亚胺(PEI)的离子吸附型固定化酶载体。载体的主要成分是纤维素,在高碘酸钠作用下,纤维素表面的羟基被氧化为醛基,然后基于聚乙烯亚氨分子的氨基基团与氧化棉纤维醛基间的共价反应,获得表面共价结合聚乙烯亚胺的棉纤维,其可用作酶固定化的载体。在一定pH条件下,聚乙烯亚胺分子带正电荷,表现为对带负电荷的酶分子具有强烈的吸附性,从而实现对酶的固定化。本试验开发的表面接枝聚乙烯亚胺的氧化棉纤维载体是一种新型的固定化酶载体材料。与离子吸附载体相比,在酶固定化过程中,固定化酶的装载量大,吸附对酶的空间结构影响小。因此,该固定化酶的催化效率高。
　　通过高碘酸钠氧化得到的氧化棉纤维,以醛基含量为指标,研究了氧化反应中氧化温度、氧化时间及氧化剂浓度对氧化程度的影响。结果显示当氧化温度为30℃,氧化时间为10h,氧化剂浓度为0.2mol/L时得到最佳的氧化效果,所对应的醛基含量为49.43％。聚乙烯亚胺作用氧化棉纤维载体制备PEI-氧化棉纤维载体,研究聚乙烯亚胺溶液浓度、pH及接枝时间对载体表面氨基含量的影响。最终优化并确定的接枝条件为:聚乙烯亚胺浓度为6mg/ml,pH6.5,时间为2h。在该条件下得到的载体表面氨基含量为1.35mmol/g。
　　利用接枝聚乙烯亚胺的氧化棉纤维可逆固定化乳糖酶,研究了固定化过程中载体与酶比例、固定化时间及固定化pH对乳糖酶固定效果的影响。结果表明在载体与酶比例为0.3g/ml,固定化时间6h,反应介质pH=7.5的条件下,固定化效率最高为62.13%。载体重复使用6个批次后,相对固定化酶活力仍保持在75%以上。离子强度会影响载体与酶之间的作用,研究表明当NaCl浓度达0.5mol/L时,载体与酶间的吸附力最弱。
　　对比了游离乳糖酶与固定化乳糖酶的酶学性质,包括热稳定性、动力学参数等。与游离酶相比,固定化酶适合的温度范围向高温偏移。采用 Lineweaver-Burk双倒数作图法作图得到固定化乳糖酶的Km值为1.44 mmol/L,较游离酶的Km(3.18 mmol/L)较小,说明其对底物具有更好的亲和力。此外,固定化乳糖酶的贮存稳定性较强,经过两周的低温(4℃)贮存,固定化酶的酶活力仍保持在75%以上。
　　利用所制备的固定化乳糖酶制成简易的填充床柱形反应器,催化乳糖水解。研究了反应过程中固定化酶装载量、反应温度及底物流速对乳糖水解速率的影响。结果显示乳糖水解速率随着底物流速的增加而降低,固定化酶装载量为4g/40ml,温度为30℃的条件利于乳糖水解。选择最佳的酶装载量及温度条件,底物流速选择为2ml/min,得到的乳糖水解率为64.39%。利用固定化乳糖酶连续催化乳糖水解八次后,乳糖水解率仍保持在最初水解率的55%以上。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

目录

第一章 前 言

1.1 固定化酶

1.2 酶的固定化方法

1.3 酶的固定化载体

1.4 固定化酶的性质变化

1.5 酶促反应动力学

1.6 β-D-半乳糖苷酶

1.7 棉纤维

第二章 棉纤维表面接枝聚乙烯亚胺的离子吸附载体的制备

2.1 实验材料与仪器

2.2 实验方法与内容

2.3 结果与讨论

2.4 本章小结

第三章 表面接枝聚乙烯亚胺棉纤维载体可逆固定化K.fragilisβ-D-半乳糖苷酶

3.1 实验材料与仪器

3.2 实验方法与内容

3.3 结果与讨论

3.4 本章小结

第四章 棉纤维表面接枝聚乙烯亚胺吸附β-D-半乳糖苷酶连续催化乳糖水解

4.1 实验材料与仪器

4.2 实验方法与内容

4.3 结果与讨论

4.4 本章小结

第五章 总结与展望

5.1 结论

5.2 创新点

5.3 展望

参考文献

发表论文及参加科研情况说明

致谢