苦参碱/羧甲基壳聚糖/磷酸化壳聚糖农药纳米粒子水分散制剂的制备方法

摘要

本发明公开了苦参碱/羧甲基壳聚糖/磷酸化壳聚糖农药纳米粒子水分散制剂的制备方法和应用。该方法包括：(1)磷酸化壳聚糖的制备；(2)苦参碱/羧甲基壳聚糖/磷酸化壳聚糖纳米粒子水分散制剂的制备。本发明克服了壳聚糖不溶于水的缺点，为壳聚糖及其衍生物在农业上新的应用提供了借鉴；农药纳米粒子水分散制剂对害虫的杀灭效果优于简单的水溶液制剂；植物源农药被纳米化后，纳米粒子对农药起到了保护、稳定作用，使其具有缓释、长效功能；制备方法易行，避免了有机溶剂和助剂的使用，壳聚糖及其衍生物的降解产物对植物生长具有调节作用，其氮、磷元素也是植物的肥料，使本发明制剂成为真正意义的环境友好农药。

说明书

技术领域

本发明属于天然高分子改性和农业农药制剂领域，特别涉及一种苦参碱/羧甲基壳聚糖/磷酸化壳聚糖农药纳米粒子水分散制剂的制备方法及其用途。

背景技术

带有阳离子的天然多糖——壳聚糖因其独特的生物性能受到人们的青睐。然而，壳聚糖只能溶于酸性溶液的性质使其直接应用受到限制。一方面，作为药物载体，酸性介质很容易造成对生物体的毒性和对药物性能的干扰；另一方面，壳聚糖分子在中性pH值的水溶液中会沉淀出来。这种性能使其作为农药和药物载体的应用受到限制。因此，寻求壳聚糖的水溶性途径，制备其水溶性衍生物，是应用壳聚糖作为农药和药物纳米载药粒子的基质物质的关键。

苦参碱(Matrin)是从豆科槐属植物苦参的根、茎中分离得到的生物碱，一般为苦参总碱，以苦参碱、氧化苦参碱的含量最高。苦参碱属于喹嗪啶类衍生物(结构式见图1)。苦参碱可作为药物和植物源农药，对害虫具有触杀、胃毒作用。害虫一旦触及该药剂，能使其拒食、中枢神经麻痹，虫体蛋白质发生凝固，使害虫窒息而死。苦参碱对菜青虫、蚜虫、小菜蛾、红蜘蛛、蓟马、斑潜蝇等害虫具有良好的杀灭效果。

苦参碱具有广谱杀虫、害虫抗药性低的特点，对非靶标生物安全，对人畜无害，环境友好，且植物的地域分布广，来源丰富，成本低，这使得苦参碱作为农药制剂的研究愈发深入。但与合成农药相比，还存在植物源农药共同存在的不足：发挥药效慢，活性成分易分解，对光不稳定，持续期短。其中，稳定性控制是公认的难题。另外植物源农药除少数水溶外，大都需用人工合成助剂，制剂成分复杂，不利于环保。提高苦参碱对害虫的杀虫效果，使其具有缓释、长效，是植物源农药制剂的研制追求的目标。

发明内容

为了解决上述现有技术的不足之处，本发明的首要目的在于提供一种苦参碱/羧甲基壳聚糖/磷酸化壳聚糖农药纳米粒子水分散制剂的制备方法。

本发明的另一目的在于提供上述方法制备的苦参碱/羧甲基壳聚糖/磷酸化壳聚糖农药纳米粒子水分散制剂的用途。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种苦参碱/羧甲基壳聚糖/磷酸化壳聚糖农药纳米粒子水分散制剂的制备方法，包括以下操作步骤：

苦参碱/羧甲基壳聚糖/磷酸化壳聚糖(Mat/CMC/PCS)纳米粒子水分散制剂的制备：将5～10ml浓度为1.0～2.0mg/ml的苦参碱水溶液和5～15ml浓度为0.25～0.5mg/ml的羧甲基壳聚糖水溶液混合；在搅拌的条件下，将上述混合液逐滴加入到5～15ml浓度为0.5～1.0mg/ml步骤(1)所得磷酸化壳聚糖(PCS)的水溶液中，得到苦参碱/羧甲基壳聚糖/磷酸化壳聚糖农药纳米粒子水分散制剂。

所述的磷酸化壳聚糖的制备包括以下操作步骤：将5～10g壳聚糖溶解于250～500ml体积百分浓度为1％～1.5％的乙酸溶液中，升温至60～75℃，加入质量体积浓度为0.25～0.5g/ml的磷酸溶液；加入6～15ml质量百分数为37～40％的甲醛溶液，于70～80℃下搅拌反应1～5.5h；将反应液倾入无水乙醇中沉淀，过滤，收集沉淀，用无水乙醇浸洗2～3次，在-30～-10℃冷冻干燥24～48h，得到磷酸化壳聚糖。

所述的壳聚糖的粘均分子量为3.0×10⁴～2.2×10⁵、脱乙酰度≥90％。

所述的羧甲基壳聚糖的粘均分子量为6.1×10⁴～5.3×10⁵。

一种根据上述方法制备的苦参碱/羧甲基壳聚糖/磷酸化壳聚糖农药纳米粒子水分散制剂。

上述苦参碱/羧甲基壳聚糖/磷酸化壳聚糖农药纳米粒子水分散制剂应用于农药制剂，可以杀灭害虫。

本发明相对现有技术具有如下的优点及有益效果：(1)磷酸化壳聚糖作为壳聚糖的衍生物能够完全溶解于中性的水溶液中，不仅克服了壳聚糖及其衍生物一般不溶于水的缺点，为壳聚糖及其衍生物在农业上的应用提供了借鉴；新官能团磷酸基的引入，也进一步拓展了壳聚糖的应用领域；(2)本发明以羧甲基壳聚糖和磷酸化壳聚糖为农药载体，制备了苦参碱/羧甲基壳聚糖/磷酸化壳聚糖农药纳米粒子水分散制剂，有效提高了苦参碱的药效和稳定性。苦参碱分子负载于由壳聚糖衍生物形成的纳米粒子的内部或表面，纳米粒子对农药起到了保护、稳定作用，使该制剂显示出缓释、长效得功能。不仅克服了苦参碱水溶剂的缺陷，而且本发明农药纳米粒子水分散制剂对害虫的杀灭效果优于简单的水性制剂；(3)在该农药纳米粒子水性制剂中，粒子的尺寸在100～300nm范围，纳米粒子的数量多，表面积大，既增大了农药分子的分散性和接触面积，也有利于对植物叶片和生物体的粘附和渗透；(4)本发明的植物源农药纳米粒子水分散制剂是一种新型的农药剂型，不仅制备方法易行，避免了有机溶剂和其它助剂的使用，而且壳聚糖衍生物的降解产物对植物生长具有调节作用，其氮、磷元素也是植物的肥料，使其成为真正意义的绿色农药。该植物源农药制剂的发明为研制环境友好的农药制剂提供了新的研究思路。

附图说明

图1是苦参碱的化学结构式。

图2是磷酸化壳聚糖的红外图谱(a为壳聚糖；b为磷酸化壳聚糖)。

图3是磷酸化壳聚糖的核磁共振图。

图4是苦参碱/羧甲基壳聚糖/磷酸化壳聚糖纳米粒子的扫描电镜图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

首先对实验材料的说明如下：

壳聚糖，脱乙酰度(DD)≥90％，粘均分子量(M_v)分别为2.2×10⁵、8.5×10⁴、3.0×10⁴；甲醛(A.R.，广州化学试剂厂)，乙醇(A.R.，天津大茂化学试剂厂)；亚磷酸(A.R.，国药集团化学试剂有限公司)；苦参碱(陕西金鑫生物工程有限公司)；羧甲基壳聚糖(粘均分子量为6.1×10⁴，取代度为0.66，浙江奥兴科技有限公司；粘均分子量5.3×10⁵，取代度为0.65，为本实验室自制，制备方法见刘宗华，“天然多糖及其衍生物纳米载药体系的研究”，博士学位论文，第2章，2007年，暨南大学)

实施例1

(1)磷酸化壳聚糖的制备：将5g粘均分子量为8.5×10⁴、脱乙酰度为95％的壳聚糖溶解于250ml体积百分浓度为1％的乙酸溶液中，升温至60℃，加入质量体积浓度为0.25g/ml的亚磷酸溶液；加入15ml质量百分数为37％的甲醛溶液，于70℃下搅拌反应1h；将反应液倾入无水乙醇中沉淀，过滤，收集沉淀，用无水乙醇浸洗2次，在-20℃冷冻干燥24h，得到磷酸化壳聚糖；

(2)苦参碱/羧甲基壳聚糖/磷酸化壳聚糖纳米粒子水分散制剂的制备：将5ml浓度为1.5mg/ml的苦参碱(苦参碱的化学结构式如图1所示)水溶液和5ml浓度为0.35mg/ml的羧甲基壳聚糖水溶液混合，所述羧甲基壳聚糖的粘均分子量为5.3×10⁵；在搅拌的条件下，将上述混合液逐滴加入到5ml浓度为0.5mg/ml步骤(1)所得磷酸化壳聚糖的水溶液中(磷酸化壳聚糖的水溶液含有正电荷)，得到苦参碱/羧甲基壳聚糖/磷酸化壳聚糖农药纳米粒子水分散制剂。

实施例2

(1)磷酸化壳聚糖的制备：将10g粘均分子量为8.5×10⁴、脱乙酰度为95％的壳聚糖溶解于500ml体积百分浓度为1.5％的乙酸溶液中，升温至75℃，加入质量体积浓度为0.5g/ml的亚磷酸溶液；加入6ml质量百分数为40％的甲醛溶液，于80℃下搅拌反应5.5h；将反应液倾入无水乙醇中沉淀，过滤，收集沉淀，用无水乙醇浸洗3次，在-30℃冷冻干燥48h，得到磷酸化壳聚糖；

(2)苦参碱/羧甲基壳聚糖/磷酸化壳聚糖纳米粒子水分散制剂的制备：将10ml浓度为1.0mg/ml的苦参碱水溶液和15ml浓度为0.5mg/ml的羧甲基壳聚糖水溶液混合，所述羧甲基壳聚糖的粘均分子量6.1×10⁴；在搅拌的条件下，将上述混合液逐滴加入到15ml浓度为1.0mg/ml步骤(1)所得磷酸化壳聚糖的水溶液中，得到苦参碱/羧甲基壳聚糖/磷酸化壳聚糖农药纳米粒子水分散制剂。

实施例3

(1)磷酸化壳聚糖的制备：将8g粘均分子量为2.2×10⁵、脱乙酰度为92％的壳聚糖溶解于350ml体积百分浓度为1.2％的乙酸溶液中，升温至65℃，加入质量体积浓度为0.45g/ml的亚磷酸溶液；加入10ml质量百分数为38％的甲醛溶液，于75℃下搅拌反应2h；将反应液倾入无水乙醇中沉淀，过滤，收集沉淀，用无水乙醇浸洗2次，在-10℃冷冻干燥38h，得到磷酸化壳聚糖；

(2)苦参碱/羧甲基壳聚糖/磷酸化壳聚糖纳米粒子水分散制剂的制备：将8ml浓度为2.0mg/ml的苦参碱水溶液和10ml浓度为0.25mg/ml的羧甲基壳聚糖水溶液混合，所述羧甲基壳聚糖的粘均分子量5.3×10⁵；在搅拌的条件下，将上述混合液逐滴加入到10ml浓度为0.8mg/ml步骤(1)所得磷酸化壳聚糖的水溶液中，得到苦参碱/羧甲基壳聚糖/磷酸化壳聚糖农药纳米粒子水分散制剂。

实施例4

(1)磷酸化壳聚糖的制备：将6g粘均分子量为3.0×10⁴、脱乙酰度为98％的壳聚糖溶解于450ml体积百分浓度为1.4％的乙酸溶液中，升温至70℃，加入质量体积浓度为0.45g/ml的亚磷酸溶液；加入12ml质量百分数为37％的甲醛溶液，于78℃下搅拌反应4h；将反应液倾入无水乙醇中沉淀，过滤，收集沉淀，用无水乙醇浸洗2次，在-15℃冷冻干燥45h，得到磷酸化壳聚糖；

(2)苦参碱/羧甲基壳聚糖/磷酸化壳聚糖纳米粒子水分散制剂的制备：将9ml浓度为1.7mg/ml的苦参碱水溶液和13ml浓度为0.3mg/ml的羧甲基壳聚糖水溶液混合，所述羧甲基壳聚糖的粘均分子量6.1×10⁴；在搅拌的条件下，将上述混合液逐滴加入到14ml浓度为1.0mg/ml步骤(1)所得磷酸化壳聚糖的水溶液中，得到苦参碱/羧甲基壳聚糖/磷酸化壳聚糖农药纳米粒子水分散制剂。

实施例5

(1)磷酸化壳聚糖的制备：将9g粘均分子量为8.5×10⁴、脱乙酰度为95％的壳聚糖溶解于400ml体积百分浓度为1.1％的乙酸溶液中，升温至65℃，加入质量体积浓度为0.5g/ml的亚磷酸溶液；加入15ml质量百分数为37％的甲醛溶液，于72℃下搅拌反应3h；将反应液倾入无水乙醇中沉淀，过滤，收集沉淀，用无水乙醇浸洗3次，在-25℃冷冻干燥30h，得到磷酸化壳聚糖；

(2)苦参碱/羧甲基壳聚糖/磷酸化壳聚糖纳米粒子水分散制剂的制备：将10ml浓度为1.0mg/ml的苦参碱水溶液和11ml浓度为0.5mg/ml的羧甲基壳聚糖水溶液混合，所述羧甲基壳聚糖的粘均分子量5.3×10⁵；在搅拌的条件下，将上述混合液逐滴加入到5ml浓度为0.9mg/ml步骤(1)所得磷酸化壳聚糖的水溶液中，得到苦参碱/羧甲基壳聚糖/磷酸化壳聚糖农药纳米粒子水分散制剂。

实施例6

磷酸化壳聚糖的结构分析：

将实施例1所用材料壳聚糖进行红外光谱测定，结果如图2a所示；将实施例1步骤(1)所得磷酸化壳聚糖进行红外光谱测定，结果如图2b所示；b线与a线相对比，可见，1400～1100cm^-1区域的P＝O伸缩振动吸收谱带明显增强，1025.91cm^-1处的P—O—C的伸缩振动吸收谱带也明显增强，在2915.21cm^-1处明显出现亚甲基的反对称伸缩振动吸收谱带，1630.92cm^-1处的强氨基吸收谱带依然存在，说明磷酸化反应主要发生在羟基上。

将实施例1步骤(2)所得磷酸化壳聚糖进行核磁共振测定氢谱，如图3所示，磷酸化壳聚糖质子的化学位移：δ＝4.77(H₁)，δ＝3.56～3.84(H₂H₃H₄H₅H₆)，δ＝2.0(N-COCH₃)，δ＝3.10(-CH₂-)。

综上，经过分析确定，实施例1所用壳聚糖和实施例1步骤(1)所得磷酸化壳聚糖的质子类型和化学位移强度与如下表示的化学结构是一致的：

壳聚糖结构式

R₁＝H，R₂＝CH₂PO₃H₂

R₁＝R₂＝CH₂PO₃H₂

磷酸化壳聚糖结构式

实施例7

苦参碱/羧甲基壳聚糖/磷酸化壳聚糖(Mat/CMC/PCS)农药纳米粒子水分散制剂中纳米粒子的粒径和Zeta电位

表1为苦参碱溶液浓度对纳米粒子粒径、粒径分布和表面电荷的影响。羧甲基壳聚糖(CMC)和磷酸化壳聚糖(PCS)溶液的浓度分别为1.0和0.50mg/ml；苦参碱的浓度分别为1.0和2.0mg/ml。先取等体积的羧甲基壳聚糖(CMC)溶液和苦参碱(Mat)溶液混合，再取不同体积的上述混合液分别滴入相同体积的PCS溶液中。由表可见，在给出的溶液浓度范围，苦参碱纳米粒子的粒径在150nm～220nm，粒径尺寸变化稳定，故粒径分布较窄，在0.22～3.22范围；粒子表面的Zeta电位值为正电荷。随着苦参碱溶液浓度的增大，纳米粒子粒径、粒径分布和zeta电位值变化不大。但是，当苦参碱溶液浓度的一定，随着制备纳米粒子所需的苦参碱溶液的体积减小时，呈现纳米粒子粒径逐渐增大、粒径分布逐渐变窄和Zeta电位值逐渐减小的趋势。

表1 苦参碱浓度对纳米粒子粒径、粒径分布和表面电荷的影响

实施例8

苦参碱/羧甲基壳聚糖/磷酸化壳聚糖(Mat/CMC/PCS)农药纳米粒子的形态结构

经扫描电镜观察实施例2所得到的苦参碱/羧甲基壳聚糖/磷酸化壳聚糖(Mat/CMC/PCS)农药纳米粒子的形态结构，如图4所示，可见，所得粒子大小较均一，形态呈规则的球形，表面光滑，能呈现单分散；部分粒子出现粘连的原因，是在制备电镜样品时，由于水分蒸发，使纳米粒子浓度增大从而聚集形成的。

实施例9

对实施例3所得苦参碱/羧甲基壳聚糖/磷酸化壳聚糖(Mat/CMC/PCS)农药纳米粒子水分散制剂的室外稳定性进行了考察，试验方法如下：将20cm×20cm的尼龙白布分别在苦参碱/羧甲基壳聚糖/磷酸化壳聚糖农药纳米粒子水分散制剂(浓度0.25mg/ml)和苦参碱水溶液制剂(浓度0.25mg/ml)中浸渍，取出在自然条件下晾晒，分别在1、3、5、7、10、15、20天取回。在装有50ml去离子水的三角瓶中，在搅拌下，萃取残余苦参碱5小时。萃取液用高效液相色谱(HPLC)检测苦参碱浓度。表2为浸渍苦参碱/羧甲基壳聚糖/磷酸化壳聚糖农药纳米粒子水分散制剂和苦参碱水溶液的尼龙白布萃取液中苦参碱残余量随时间的变化。

结果显示：在相同的室外自然条件下，浸渍苦参碱水溶液制剂的尼龙白布上的残余苦参碱含量开始较高，但随时间降低的幅度较大，第20天的残余量与第1天相比降低了45.5％。而浸渍苦参碱/羧甲基壳聚糖/磷酸化壳聚糖农药纳米粒子水分散制剂的尼龙白布上的残余苦参碱含量随时间降低的趋势则非常平缓，第20天与第1天相比，仅降低了16.5％。

浸渍苦参碱/羧甲基壳聚糖/磷酸化壳聚糖农药纳米粒子水分散制剂的残余苦参碱含量普遍低于浸渍苦参碱水溶液制剂的残余含量是两方面原因造成的。一方面，对于浸渍苦参碱水溶液的尼龙白布，由于苦参碱溶于水，可以将残余的苦参碱全部溶解洗出；而浸渍苦参碱/羧甲基壳聚糖/磷酸化壳聚糖农药纳米粒子水分散制剂的尼龙白布，由于负载苦参碱的纳米粒子对纤维的粘附作用，不能全部洗出。萃取后的尼龙白布的电镜照片证明了这一点，在尼龙纤维上可看到许多粘附在纤维上的苦参碱纳米粒子。另一方面，HPLC也可能无法检测到包裹在纳米粒子内部的苦参碱分子。由于这两方面的原因，造成苦参碱/羧甲基壳聚糖/磷酸化壳聚糖农药纳米粒子水分散制剂中的苦参碱残余含量在表观上普遍低于苦参碱水溶液制剂。但苦参碱残余含量随时间变化的趋势表明，在相同的室外自然条件下，苦参碱/羧甲基壳聚糖/磷酸化壳聚糖农药纳米粒子水分散制剂对苦参碱分子具有保护、稳定作用。

表2 浸渍不同苦参碱水性制剂的尼龙白布在室外环境晾晒后其残余量随时间的变化

实施例10

苦参碱/羧甲基壳聚糖/磷酸化壳聚糖(Mat/CMC/PCS)农药纳米粒子水分散制剂的杀虫试验与药效评价

植物源农药纳米粒子水分散的杀虫药效试验与药效评价，是在广东省农业科学院植物保护研究所进行。试验和评价方法均按照国家标准或科学标准进行。

(1)苦参碱/羧甲基壳聚糖/磷酸化壳聚糖农药纳米粒子水分散制剂对柑橘红蜘蛛的杀虫效果：

用自来水分别配置浓度为25mg/l的苦参碱/羧甲基壳聚糖/磷酸化壳聚糖农药纳米粒子水分散制剂和苦参碱的水溶液制剂，对田间生长旺盛的柑橘施药，考察对柑橘红蜘蛛存活的影响。试验方法为每个处理设3次重复。叶片两面喷雾。喷药后1天开始调查虫口基数，计算红蜘蛛的存活率，结果如表3所示。

杀虫结果显示：施药后3天以内，苦参碱/羧甲基壳聚糖/磷酸化壳聚糖农药纳米粒子水分散制剂和苦参碱水溶液对柑橘红蜘蛛存活率的影响差别不大；3天以后，杀虫效果的差异开始显现，苦参碱/羧甲基壳聚糖/磷酸化壳聚糖农药纳米粒子水分散制剂的蚜虫存活率开始低于苦参碱水溶液制剂；到第15天，前者的蚜虫存活率为118.4％，而后者为140.3％。可见，苦参碱农药纳米粒子制剂显示出缓释、长效的杀虫效果。

表3 田间苦参碱对柑橘红蜘蛛的存活影响

注：表中数据为3次重复的平均值±标准差

(2)苦参碱/羧甲基壳聚糖/磷酸化壳聚糖(Mat/CMC/PCS)农药纳米粒子水分散液对小菜蛾虫卵的抑制效果：

试验方法如下：将长有3～4片的芥兰苗移栽至塑料杯(杯底直径为4cm，杯口直径为6.5cm，高度为8cm)，每杯1株苗。待芥兰苗长至5～6片真叶备用。将苦参碱/羧甲基壳聚糖/磷酸化壳聚糖农药纳米粒子水分散制剂(农药负载率为66％，浓度0.25mg/l)和苦参碱水溶液制剂(浓度0.25mg/l)用水稀释50倍；以清水为空白对照。将上述溶液分别均匀涂抹于芥兰苗叶片的正反面；放置4天，第5天将处理过的芥兰苗按随机区组设计放入养虫笼(60cm×60cm×60cm)，每个处理3个重复，再将88对已经羽化3天的小菜蛾成虫接入养虫笼，套上笼罩；每24h调查小菜蛾成虫在芥兰苗上的着卵量，调查96h，结果如表4所示。

表4 苦参碱纳米体系对小菜蛾虫卵的抑制效果

注：表中数据为4次重复的平均值±标准差

试验结果显示，两组数据经邓肯氏新极差检验在0.05水平上差异显著。在喷药5天后，苦参碱/羧甲基壳聚糖/磷酸化壳聚糖农药纳米粒子水分散制剂和苦参碱水溶液制剂对小菜蛾成虫卵均有抑制作用，且前者对虫卵作用优于后者；第8天时，纳米组着卵量为2.25％，不到后者(4.75％)的一半；显示出苦参碱被纳米化后，纳米粒子对虫卵的抑制具有缓释、长效功能。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。