基因改造和RNAi的基础上利用植物隐性基因的方法

摘要

本发明公开了一种基因改造和RNAi的基础上利用植物隐性基因的方法。该方法通过构建培育抗病植物的DNA分子来实现，该DNA分子包括RNA干扰表达盒和人工改造基因表达盒，所述RNA干扰表达盒自上游至下游依次包括启动子、表达发卡RNA的DNA分子和终止子，所述表达发卡RNA的DNA分子由A、B和C三个片段依次连接组成，所述A片段选自目的蛋白的编码基因的至少277bp，所述C片段与A片段反向互补；所述人工改造基因表达盒自上游至下游依次包括启动子、人工改造的目的基因和终止子，所述人工改造的目的基因编码所述目的蛋白，并且与A或C片段不互补。利用本发明的DNA分子能改良水稻白叶枯的抗性，同时不影响水稻其他的农艺性状。

说明书

技术领域

本发明涉及基因改造和RNAi的基础上利用植物隐性基因的方法。

背景技术

RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术是一项基因沉默新技术，自20世纪90年代被发现以来，已被广泛应用到动植物功能基因组研究及医学研究当中，现在已逐渐成为分子生物学和细胞生物学研究的有用工具之一。

基因工程育种是分子育种的重要内容，也是未来育种的趋势。基因工程中利用大都是显性抗病基因，至今尚未有通过基因工程手段利用隐性抗病基因仅改变植物抗性但不影响植物其它农艺性状的报道。这是由于在植物转基因过程中很少发生同源重组，因此通过基因工程手段将来源于植物的隐性抗病基因导入植物后，在转基因植株中由于显性基因的存在而不能获得抗病效果，另外大多数隐性抗病基因不仅参与了抗病，还在植物的生长发育过程起着重要的作用，Chu等通过RNAi(RNAInterference)的方法验证水稻白叶枯病隐性xa13基因的功能时发现，转基因水稻的产量随着xa13表达量的降低而减少，水稻基因xa5编码一个基本转录因子TFIIAγ的隐性抗病基因，通过RNAi方法抑制与xa5等位的显性感病基因Xa5的表达，可能影响水稻的生长发育和产量。因此，一种能通过基因工程手段利用隐性抗病基因只改良水稻抗性，不影响水稻其他农艺性状的方法不仅具有重要的理论意义，也为改良水稻抗性提供更多可利用的抗源和途径。

发明内容

本发明的目的是提供一种基因改造和RNAi的基础上利用植物隐性基因的方法。

本发明在基因改造和RNAi的基础上利用植物隐性基因的方法是通过构建培育抗病植物的DNA分子来实现的。

所述培育抗病植物的DNA分子包括RNA干扰表达盒和人工改造基因表达盒，所述RNA干扰表达盒自上游至下游依次包括启动子、表达发卡RNA的DNA分子和终止子，所述表达发卡RNA的DNA分子由A、B和C三个片段依次连接组成，所述A片段选自目的蛋白的编码基因的至少277bp，所述C片段与A片段反向互补；所述人工改造基因表达盒自上游至下游依次包括启动子、人工改造的目的基因和终止子，所述人工改造的目的基因编码所述目的蛋白，并且没有与A或C片段的任一段连续19bp的互补区。

其中，所述RNA干扰表达盒和所述人工改造基因表达盒的转录方向最好相反。

启动子和终止子没有特别的要求，能在真核生物中具有启动外源基因表达的启动子均可，当然如果针对单子叶植物可优先选择玉米泛素(ubiquitin)基因的启动子。

上述目的蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列4。针对该目的蛋白，所述A片段的核苷酸序列具体可为序列表中的序列1，所述人工改造的目的基因为序列表中的序列2。

所述B片段没有特别的限制，可以选择多种植物基因的内含子，如Race intron，其核苷酸序列为序列表中的序列3。

含有所述DNA分子的重组载体、转基因细胞系和重组菌也属于本发明的保护范围。所述重组表达载体可为在植物表达载体的多克隆位点插入所述的DNA分子。

所述的DNA分子和所述的重组表达载体可用来培育抗病植物。

本发明的另一个目的是提供一种培育抗病植物的方法。

本发明所提供的培育抗病植物的方法，是将所述的DNA分子导入植物中获得抗病植物。

其中，所述植物可为水稻，所述抗病植物可为抗白叶枯菌的水稻。

本发明的培育抗病植物的DNA分子可构建到植物表达载体中导入植物中，获得抗病的植物。将本发明的培育抗病植物的DNA分子转入水稻台北309中，获得的转基因株系，在成株期对白叶枯菌株P1具有高度抗性，同时其结实率不会受到影响，说明利用本发明的DNA分子培育能调控水稻隐性基因xa5，改良水稻白叶枯的抗性，同时不影响水稻其他农艺性状的，获得抗白叶枯菌且高产的水稻新品种，对农业生产具有重要意义。

附图说明

图1为pXa5^RNAi-xa5^M载体图谱。

图2为转pXa5^RNAi-xa5^M载体水稻的分子检测。

图3为转pXa5^RNAi-xa5^M载体水稻抗白叶枯菌。

具体实施方式

下述实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法，所用试剂均可从商业途径获得。

一、转基因载体的构建

1)显性Xa5 RNAi片段序列的获得

以水稻品种IR24(国际水稻所)为实验材料，提取其叶片总RNA，将其反转录成cDNA。以此cDNA为模板，以Xa5RNAiF(5′GACTAGTGGTACCATTCAAGTTCTTGTCCAG3′)和Xa5RNAiR(5’GGAGCTCGGATCCAGGTCTAGCAGAAGAG3′)为引物，PCR扩增显性Xa5的RNAi片段(Xa5^RNAi)。

PCR反应条件：先94℃预变性4min；然后94℃变性45S；55℃退火45S；72℃延30min，共29个循环；最后72℃延伸10min。

对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，获得约300bp左右的片段。回收该300bp左右的片段，连接到T-easy载体上，获得重组载体命名为T-Xa5^RNAi。对T-Xa5^RNAi进行测序300bp左右的片段的核苷酸序列如序列表中序列1所示。

2)人工改造的隐性抗病基因xa5编码序列的获得

根据氨基酸密码子的简并性，依据xa5基因的蛋白序列，在xa5 ORF(xa5^ORF)DNA序列基础上，将编码同一种氨基酸的不同密码子位置两两对换，最后成单的氨基酸密码子用该氨基酸在xa5中出现频率较高的密码子代替，并兼顾GC含量与原来xa5^ORF相当，使之没有任一段连续19bp完全匹配的区域。人工改造的隐性抗病基因xa5编码序列如序列表中序列2所示。为了便于基因操作，在ORF5’端添加了NcoI酶切点，3’端添加BstE II酶切位点，命名为xa5^M。

xa5^M由上海生物公司合成，将xa5^M连接到T-easy载体上，获得重组载体命名为T-xa5^M。

3)转化载体的构建

分别将T-Xa5^RNAi和pTCK303(ZHEN WANG、CHANGBIN CHEN、YUNYUAN XU、RONGXIJIANG、YE HAN、ZHIHONG XU and KANG CHONG，A Practical Vector for EfficientKnockdown ofGene Expression in Rice(Oryza sativa L.)；Plant MolecularBiology Reporter 22：409-417，December2004)(中国科学院遗传与发育生物学研究所)用Kpn I和BamH I双酶切，经琼脂糖凝胶电泳回收300bp左右的Xa5^RNAi片段和13K左右的pTCK303大片段，获得重组质粒命名为pXa5^RNAi-1。再用SacI和Spe I双酶切pXa5^RNAi-1和T-Xa5^RNAi，回收300bp左右的Xa5^RNAi片段和13K左右的pXa5^RNAi-1载体片段，连接获得重组质粒命名为pXa5^RNAi。用NcoI和BstEII双酶切载体T-xa5^M，回收300bp左右片段，再将pXa5^RNAi先用BstE II完全酶切，然后用Nco I进行不完全酶切，回收13000bp左右大片段，将300bp左右片段和13000bp左右大片段连接获得重组载体命名为pXa5^RNAi-xa5^M(图1)。

二、转pXa5^RNAi-xa5^M载体水稻的获得

利用农杆菌介导的方法，将重组表达载体pXa5^RNAi-xa5^M导入到水稻台北309中，获得了18个转基因株系。

以Xa5^RNAiF：5′-GACTAGTGGTACCATTCAAGTTCTTGTCCAG-3′和Xa5R^NAiR：5′-GGAGCTCGGATCCAGGTCTAGCAGAAGAG-3′为引物，检测Xa5 RNAi片段是否整合到水稻基因组以及Xa5基因的表达水平。

以xa5^MF：5′-GAACTTTACAGGCGGTCTACG-3′和xa5^MR：5′-TGGCTAAGAAGCTTAGAATCG-3′为引物，检测人工合成基因xa5^M是否整合到水稻基因组以及xa5^M基因的表达水平。

以hptF5′-TAGGAGGGCGTGGATATGTC-3′和hptR5′-TACACAGCCATCGGTCCAGA-3′为引物，检测潮霉素基因是否整合到水稻基因组和潮霉素基因的表达水平。

以引物Xa5⁵(5’GGTCTCCTCCGCTCCTCCTC3’)和(R：5’GGGCGATGCGTGCGCCTAAAC3’)检测Xa5基因的5’非翻译区(缩写Xa5⁵)。

以引物Xa5³(5’ATTGATAACTGCGAGGTCAG3’)和(R：5’GGTACCATTAACATAGGATCC3’)检测Xa5基因的3’UTR区(缩写Xa5³)。

以引物TFIIAγ1F(5’TGACAAGTCCAT GACTAGC3’)和TFIIAγ1R(5’CTCTTCTTTAGTCTCCAGC3’)检测与Xa5同源的位于第一染色体的成员TFIIAγ1的表达。

PCR检测结果如图2A所示，表明18个转基因株系有10个株系能同时检测到hpt、xa5^M和Xa5^RNAi的目的条带。

图2A中，positive CK为以pXa5^RNAi-xa5^M载体为模板，Negative CK为以水为模板，1-18分别表示18个T₀代转pXa5^RNAi-xa5^M载体水稻。

对同时检测到hpt、xa5^M和Xa5^RNAi的目的条带的转pXa5^RNAi-xa5^M载体水稻和未转基因的水稻台北309进行RT-PCR分析结果如图2B所示，2对分别位于5’UTR区、3’UTR区的引物的PCR扩增均未出现扩增产物，说明Xa5基因在转pXa5^RNAi-xa5^M载体水稻中几乎没有表达，转pXa5^RNAi-xa5^M载体水稻的中Xa5被沉默，以xa5^MF和xa5^MR为引物的PCR扩增出现扩增产物，说明转pXa5^RNAi-xa5^M载体水稻的中xa5^M表达。此外与Xa5同源的位于第一染色体的成员TFIIAγ1的表达在转基因株系不受影响。

图2B中，1为分子量标准，2-6为同时检测到hpt、xa5^M和Xa5^RNAi的目的条带的转pXa5^RNAi-xa5^M载体水稻的不同株系，7为未转基因的水稻台北309。

挑选上述能同时检测到hpt、xa5^M和Xa5^RNAi的目的条带的8个株系、携抗性基因xa5的抗病对照IRBB5(国际水稻所提供)和未转基因的水稻台北309，移栽到海南陵水中科院遗传与发育生物学研究所南繁基地，每个株系100株，随机分成2组，实验组和对照组，每组设3个小区。

实验组于成株期通过剪叶法对充分伸展的叶片接种白叶枯菌株P1(国际水稻所)。接种病原菌在PSA培养基(马铃薯300g/L，Ca(NO3)₂·4H₂O 0.5g/L，Na₂HPO·12H₂O 2.0g/L，蔗糖15g/L，琼脂粉15g/L)上于28℃培养72h，调节浓度至10⁹CFU/mL，接种14d当病斑长度明显而稳定时进行调查，每一植株测量三片叶。接种14d后观察各个株系的表型。

表型观察结果如图3所示，未转基因的水稻台北309的病斑长度约7cm(平均值)，同时检测到hpt、xa5^M和Xa5^RNAi的目的条带的8个株系的病斑长度都不超过1cm(平均值)，均表现出对白叶枯病的高度抗性。

图3中，TP309为未转基因的水稻台北309，IRBB5是携抗性基因xa5的抗病对照数字编号为同时检测到hpt、xa5^M和Xa5^RNAi的目的条带的转pXa5^RNAi-xa5^M载体水稻。

对转基因植株的农艺性状调查结果如表1，同时检测到hpt、xa5^M和Xa5^RNAi的目的条带的株系3、6、17的结实率与对照相当，产量没有受到影响。说明利用pXa5^RNAi-xa5^M载体系统是可以获得高抗白叶枯病，但不影响产量的转基因植株的。

表1.转基因植株农艺性状调查

序列表

<110>中国科学院遗传与发育生物学研究所

<120>基因改造和RNAi的基础上利用植物隐性基因的方法

<160>4

<210>1

<211>277

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<230>

<400>1

<210>2

<211>321

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<230>

<400>2

<210>3

<211>477

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<230>

<210>4

<211>106

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<230>

<400>4