一株非谷氨酸依赖型γ－聚谷氨酸合成菌及其发酵方法

摘要

本发明提供了一株非谷氨酸依赖型γ－聚谷氨酸合成菌——解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens NK－LL3)，本发明还提供了该菌株的发酵培养方法以及适用的培养基。本发明提供的γ－聚谷氨酸的菌株营养要求简单，传代稳定，而且培养方法简单易行。以Bacillus amyloliquefaciens NK－LL3作为发酵菌株，利用糖质原料进行摇瓶发酵，在发酵原料中无需添加L－谷氨酸，这与以往通常采用的需要谷氨酸作原料的微生物发酵相比，有效降低了生产成本，具有良好的工业化应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及生物法制备高分子聚合物材料γ-聚谷氨酸的生产，具体地涉及一株非谷氨酸依赖型产γ-聚谷氨酸的菌株及其培养与发酵方法。

背景技术

1937年Ivanovics等发现炭疽芽孢杆菌中含有γ-聚谷氨酸[Poly(γ-glutamicacid)，γ-PGA)，它是由单个谷氨酸分子在γ-羟基和α-氨基形成的酰胺键而连接成的多聚体，为水溶性的酰胺化合物，γ-PGA相对分子量范围一般在10-1,000万之间。它的结构式如图所示：

聚谷氨酸含有大量的羧基，为弱阴离子型聚合大分子，且单体中含有手性碳原子。γ-PGA及其衍生物具有极佳的成膜性，成纤维性，阻氧性，可塑性，粘结性，保湿性和可生物降解等独特的理化和生物学特性。由于聚谷氨酸独特的性质，它被广泛运用于各种领域，包括食品工业、保湿剂、药物载体、生物絮凝剂、生物粘合剂等。因此，目前聚谷氨酸及其工业化生产的研究得到了众多研究者的关注。

根据培养基中是否需要谷氨酸的情况，可将γ-PGA产生菌分为两类，一类为需要谷氨酸来产生γ-PGA(I型)，而另一类培养基中不需要加入谷氨酸(II型)。前者包括许多微生物，如B.subtilis ATCC9945，B.subtilis IFO3335，B.subtilis F-2-01和B.licheniformisNK-03等这类菌通常生成较多量的γ-PGA，这类生产菌不仅广泛使用在γ-PGA的生产方面，而且在阐明整个芽孢杆菌的γ-PGA合成机制方面都起到了很重要的作用。后一类包括B.subtilis TAM-4，B.licheniformis A35，由于培养基中无需加入要提供谷氨酸，可显著降低生产成本，但相对于谷氨酸依赖型生产菌来而言，它们种类较少，且在培养基中积累的γ-PGA量不如谷氨酸依赖型生产菌高，所以目前对它们的了解还不是很多。

发明内容

一.要解决的技术问题

本发明的目的是提供一株非谷氨酸依赖型γ-PGA合成菌，本发明的又一目的是提供该菌株的培养及发酵方法。

二.技术方案

本发明从食品中筛选获得一株非谷氨酸依赖型γ-PGA合成菌，解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens NK-LL3)，该菌株已于2008年7月14日被保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC No：M208109.

该菌株通过16S rDNA PCR扩增获取1431bp的基因片断，将扩增产物送商业公司测序，登录GenBank注册测序结果，获得注册序列号EU755383。

解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens NK-LL3)的形态学特征为：

菌体形态为杆状，数个菌体可连成链状，在细胞生长后期产生芽孢。

菌落特征为菌落湿润、圆形、不透明，表面光滑，挑起时有粘稠感，长时间培养会有倒挂现象(倒置培养时由于菌落粘度过大，出现了菌落分泌物滴于下方的现象)；

解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens NK-LL3)的培养特征为：

好氧，有氧条件下才能生长。适宜生长温度为28-37℃，适宜pH为6.5-7.2，在发酵培养基中迟缓期较短，两小时后即可进入对数生长期，5小时后进入对数生长期的后期，在17小时左右得到最大的菌体量。

解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens NK-LL3)的分离方法为：

用灭过菌的小铲采用无菌操作将发酵食品接入无菌生理水中，-4℃条件下，在磁力搅拌器上搅拌30分钟，然后转入100℃处理15分钟。再进行梯度稀释，选择合适梯度的菌悬液涂布在筛选平板上，挑取表面变粘的菌落若干株传代并纯化，通过发酵小试最终获得了本发明所述的γ-PGA合成菌----解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens NK-LL3)。纯化后得到的菌株保藏于-70℃的甘油管中。

解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens NK-LL3)的培养方法为：

1.菌种的活化：接种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens NK-LL3)至培养皿固体培养基，在37℃下培养24小时；

2.种子培养：在500ml灭菌的三角瓶内装100ml液体种子培养基，然后将活化的菌种接至种子培养基中，37℃，以180-220rpm振荡培养24小时，制得种子液；

3.发酵培养：以体积比1.0-5.0％的接种量将种子液接入发酵培养基中，37℃，180-220rpm振荡培养48-72小时。

其中所用到的培养基组成分别为：

(1)培养皿固体培养基：蛋白胨8.0-12.0g/L，酵母粉3.0-8.0g/L，NaCl9.0-11.0g/L，琼脂15.0-25.0g/L，pH6.5-7.2；

(2)液体种子培养基：葡萄糖20.0g/L，K₂HPO₄ 10.0-15.0g/L，KH₂PO₄ 5.0-8.0g/L，MgSO₄ 0.1-0.4g/L，(NH₄)₂SO₄ 2.0-6.0g/L，微量元素溶液(以FeSO₄·4H₂O，CaCl₂·2H₂O，MnSO₄·4H₂O和ZnCl₂配制水溶液，使各成分浓度均为1.0mM)1.0-3.0mL pH6.5-7.2；

(3)发酵培养基：葡萄糖20.0-50.0g/L，K₂HPO₄ 12.0g/L，KH₂PO₄ 6.0g/L，MgSO₄ 0.3g/L，(NH₄)₂SO₄ 4.0g/L，微量元素(以FeSO₄·4H₂O，CaCl₂·2H₂O，MnSO₄·4H₂O和ZnCl₂配制水溶液，使各成分浓度均为1.0mM)1.0-3.0mL，pH6.5-7.2。

三.有益效果

本发明提供的γ-PGA合成菌株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciensNK-LL3)是从一种发酵食品中分离得到的。该菌株发酵合成γ-PGA的过程中培养基中无需添加L-谷氨酸，可以直接从糖质原料出发合成γ-PGA。这与以往采用的需要谷氨酸作为原料的微生物发酵相比，有效地降低了生产成本，具有工业化应用前景。

本发明所述的非谷氨酸依赖型γ-PGA合成菌解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens NK-LL3)已于2008年7月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC No：M208109.

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

非谷氨酸依赖型γ-PGA合成菌的分离筛选

用灭过菌的小铲采用无菌操作将发酵食品接入装有100ml无菌生理盐水的250ml三角瓶中，-4℃条件下，在磁力搅拌器上搅拌30分钟，制成菌悬液，100℃处理15分钟。再进行梯度稀释，制成稀释了10¹—10⁹不同梯度的菌悬液。选择稀释了10³、10⁵、10⁷、10⁹倍的菌悬液涂布于不含谷氨酸的筛选平板上，进行培养，挑取菌落表面变粘的菌落若干株在培养皿固体培养基上传代培养并纯化，获得纯化的单菌落。通过发酵小试最终获得了本发明所述的γ-PGA合成菌----解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens NK-LL3)。将获得的单菌落培养在液体种子培养基中，以15％的浓度保存在甘油管中，-70℃保存。

本发明依此方法筛选获得一株非谷氨酸依赖型γ-PGA合成菌-----解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens NK-LL3)。

实施例2

解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens NK-LL3)的培养及γ-PGA检测

(1)菌种活化：将-70℃保存的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciensNK-LL3)用接种环接种至活化培养皿固体平板上，活化培养基成分为：蛋白胨8.0-12.0g/L，酵母粉3.0-8.0g/L，NaCl 9.0-11.0g/L，琼脂15.0-25.0g/L，pH6.5-7.2；将培养皿固体平板倒置于37℃下培养24小时；

(2)种子培养：将活化好的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens NK-LL3)一环接种于种子培养基中(500ml三角瓶中含有100ml种子培养液)。种子培养液成分为：葡萄糖20.0g/L，K₂HPO₄ 10.0-15.0g/L，KH₂PO₄ 5.0-8.0g/L，MgSO₄0.1-0.4g/L，(NH₄)₂SO₄ 2.0-6.0g/L，微量元素溶液(以FeSO₄·4H₂O，CaCl₂·2H₂O，MnSO₄·4H₂O和ZnCl₂配制水溶液，使各成分浓度均为1.0mM)1.0-3.0mL pH6.5-7.2，将接种好的种子培养液置于37℃恒温振荡培养箱中，180-220rpm振荡培养24小时，制得种子液；

(3)发酵培养：将培养好的种子培养液取1.0-5.0ml接入发酵培养集中(500ml三角瓶中含有100ml发酵培养液)，发酵培养基成分为：葡萄糖20.0-50.0g/L，K₂HPO₄ 12.0g/L，KH₂PO₄ 6.0g/L，MgSO₄ 0.3g/L，(NH₄)₂SO₄ 4.0g/L，微量元素(以FeSO₄·4H₂O，CaCl₂·2H₂O，MnSO₄·4H₂O和ZnCl₂配制水溶液，使各成分浓度均为1.0mM)1.0-3.0mL，pH6.6-7.2。将接种好的发酵培养基置于37℃恒温振荡培养箱中180-220rpm振荡培养48小时。

(4)γ-PGA产量的测定：将发酵液6000rpm离心10分钟收集上清，以四倍体积乙醇沉淀上清液，离心获取沉淀，将沉淀物溶于去离子水再次加入四倍体积乙醇，离心获取沉淀，所得沉淀溶解后在去离子水中透析(截留范围：8000-15000)12小时，每2小时换一次去离子水，最后冷冻干燥并称重。

(5)检测及结果：

采用FT-IR、¹HNMR、气-质联用等，对采用上述培养基成分和培养方法发酵生产γ-PGA的水解物进行检测，确认其为γ-PGA。