基于渐消波生物传感器的实时PCR微阵列

摘要

用于样品中核酸的同时、定量测量的系统和方法。通过与寡探针杂交将靶核酸的荧光标记的扩增子固定在基底表面，该寡探针已经以预定的二维模式排列并且系于基底表面。然后使用合适波长的渐消波光通过激发其荧光标记，检测杂交的扩增子。由于渐消波的有限穿透(约100～300nm)，反应室剩余部分中的荧光标记的核苷酸不发荧光。通过测量基底表面各个位置的荧光，可测定每一靶核酸的杂交的扩增子的当前丰度。然后可以使用实时PCR的分析技术获得样品中每一核酸的准确、定量测量。

说明书

发明领域

[0001]本发明涉及核酸定量测量的系统和方法，并且具体涉及多 个核酸实时、同时定量测定的系统和方法。

发明背景

[0002]在基础生物学研究中以及例如临床微生物学领域中，核酸 定量测定十分重要。通常在两个阶段里完成定量测定。首先将样品中 的靶核酸扩增，以产生用于定量化工具的可检测量的核酸。然后将可 检测量的靶核酸用于计算样品中最初存在的核酸的量。

[0003]聚合酶链反应(PCR)是扩增核酸的强大途径，尤其是脱 氧核糖核酸(DNA)。对实践PCR关键的是热稳定性DNA聚合酶 的使用，即，能催化DNA复制的蛋白质，在将DNA螺旋分离成两 条单链核酸所需的升高的温度下，该蛋白质不变性。

[0004]通过将靶双链DNA放置于核苷酸缓冲液中，同时提供叫 做引物的单链DNA小序列和热稳定性DNA聚合酶来启动PCR，该 引物与靶DNA互补。通过在三个阶段循环混合物的温度，可以将靶 DNA指数扩增。第一阶段是高温(94℃)变性阶段，此阶段中双链 DNA分离成两条单链。第二阶段是低温(60℃)退火阶段，此阶段 中引物与单链DNA结合。最后，延伸阶段在中等温度(72～78℃) 发生。在延伸阶段，DNA聚合酶催化已经与靶DNA单链退火的引物 的延伸，从而添加合适的核苷酸直到完整的双链DNA螺旋形成。在 每一个PCR循环中，靶DNA的拷贝数几乎加倍，从而使得靶DNA 能够快速积聚。

[0005]原则上，在一系列PCR循环结束时产生的靶DNA(也称 作“终产物”)的量与原始样品中靶DNA的拷贝数成比例。然而， 实际上，扩增的指数特性，以及启动复制的引物退火的微妙，导致饱 和和其他作用，其使PCR终产物成为对原始样品中靶DNA量的非常 不可靠的估计。

[0006]为了改进原始的PCR方法，20世纪90年代中期，开发 了实时聚合酶链反应(实时PCR)，其在某种程度上避免这些困难 并且提供样品中任何靶DNA拷贝数的可靠的、准确的定量测量。在 实时PCR中，将仅当与靶DNA结合时才有活性的荧光探针添加入 PCR缓冲液中。这些荧光探针是单链DNA，链中部有与靶DNA互 补的核苷酸序列。该中部的每一侧，是彼此互补的延伸核苷酸序列， 以便未附着的探针可以以发夹构型自身折叠。荧光探针一端有荧光分 子，另一端有荧光猝灭分子。所以未附着的、折叠的探针有彼此相邻 的发荧光和猝灭分子，并且因此当照射未附着的探针时没有荧光被发 射。然而，当荧光探针附着于其靶DNA时，探针是非折叠的，这样 发荧光和猝灭分子彼此分离。当用合适波长的光照射附着的探针时， 荧光分子因此发射荧光。

[0007]通过为特定的靶DNA提供足够的荧光探针，并且测量 PCR反应每阶段结合的探针发出的荧光，可以测量反应每个阶段的 扩增子数目。由于达到预定阈值的扩增子数目的循环的分数与原始样 品中拷贝数的对数之间存在直线关系，所以这种测量可以用于非常精 确地测定原始样品中DNA的拷贝数。

[0008]使用这种方法，实时PCR可以用于测定一种样品中靶 DNA的量，在9个数量级的范围内误差小于2％，即，它能计数小到 5，且多达五十亿条原始样品中的靶DNA拷贝链。

[0009]然而，实时PCR技术确实有局限，其中最重要的是，由 于具有合适的对应的荧光激发光源的合适荧光染料数目有限，所以迄 今为止实时PCR仅能测量一个反应管中少数的核酸。

[0010]对很多应用而言，多于一种核酸的同时定量分析是高度需 要的。所需要的是一种仪器和方法，其允许实时PCR使用少量荧光 染料，并且优选仅一种荧光染料，用于同时定量数百种不同核酸。

发明概述

[0011]本发明提供样品中多个核酸同时、定量测量的一种系统和 方法。

[0012]在示例性的实施方案中，在单一反应室中用聚合酶链反应 (PCR)、逆转录PCR、滚环(roll cycle)复制或T7转录线性扩增来 扩增样品中所有的核酸，其中扩增缓冲液中额外含有荧光标记的核苷 酸或荧光标记的引物，从而靶核酸的扩增子能进行自身荧光标记。

[0013]在扩增过程的退火和/或延伸阶段期间，以预定的二维模 式，通过与已经排列且系于基底表面的寡探针(oligoprobe)进行杂 交，将荧光标记的靶核酸扩增子定位于基底表面上。寡探针有与靶核 酸互补的核苷酸序列，并且可以使用商业上可获得的微阵列技术，通 过自动印刷将其排列。

[0014]当由合适波长的光的渐消波激发了它们的荧光标记时，就 可以通过发射的荧光检测杂交的、荧光标记的靶扩增子。因为当进入 反应室时，渐消波指数衰减，具有大约100～300nm的有效范围，所 以渐消波穿透到反应室中的深度仅仅足以激活与基底表面非常靠近 的荧光标记，即，与系于表面的寡探针杂交的荧光标记的靶扩增子。 因此，渐消波不能激活反应室剩余部分的荧光标记的核苷酸。

[0015]通过在基底表面的各个区域监控荧光的强度，可以测定每 一靶核酸的杂交扩增子的当前丰度。这可以在PCR反应进行时实时 完成，并且然后将实时PCR的分析技术用于获得原始样品中每一靶 核酸丰度的准确的、定量的测量。

[0016]通过参考下面的附图可以更加全面地理解本发明的这些 和其它特性。

附图简述

[0017]图1是在PCR方法的起始阶段微阵列PCR反应中能进行 渐消波检测荧光标记的扩增子的示例性筒(cartridge)的横截面视图。

[0018]图2是在PCR方法的退火和延伸阶段结束时微阵列PCR 反应中能进行渐消波检测荧光标记的扩增子的示例性筒的横截面视 图。

[0019]图3是在PCR方法的变性阶段微阵列PCR反应中能进行 渐消波检测荧光标记的扩增子的示例性筒的横截面视图。

[0020]图4是在PCR方法的检测阶段微阵列PCR反应中显示进 行渐消波检测荧光标记的扩增子的示例性筒的横截面视图。

[0021]图5是荧光强度对PCR循环的示例性图。

[0022]图6是原始样品中靶DNA链拷贝数的对数(log[N])对 所述靶DNA循环阈值(CT)的示例性图。

详述

[0024]本发明提供能实时、同时、定量测量样品中多个核酸的系 统和方法。

[0025]在示例性实施方案中，用聚合酶链反应(PCR)扩增样品 中的核酸。PCR是众所周知的扩增一个或多个脱氧核糖核酸(DNA) 链的方法，其开始于将靶DNA置于含有引物DNA，核苷酸腺嘌呤 (A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和鸟嘌呤(G)(共同称为dNTP)， DNA聚合酶和引物的缓冲液中。引物是短链DNA，其具有与要扩增 的核酸一端互补的序列。引物启动靶DNA的复制。

[0026]PCR方法有三个主要的步骤：变性、退火和延伸。在变性 步骤中，将混合物加热至约94℃，在此温度下所有的DNA分离成单 链。然后将混合物快速冷却。当温度降至约60℃时，退火步骤发生， 在此步骤中引物与靶DNA上其互补序列杂交或结合。然后为进行延 伸步骤将温度升至最佳72～78℃的范围之内。在此步骤中，DNA聚 合酶利用溶液中的dNTPs延伸退火后的引物，并且形成称为扩增子 的DNA新链。扩增子是原始靶DNA链的互补拷贝，并且最初以双 螺旋构型与其结合。然后将混合物短暂地重新加热回约94℃，以使 新形成的双螺旋链分离成单链核酸，且这样开始了PCR方法的另一 个循环。对于每个PCR方法的循环，原始靶DNA的拷贝数大概翻倍。

[0027]在本发明优选实施方案中，PCR缓冲液额外含有荧光标记 的dNTPs，即，具有附着其上的荧光染料分子的dNTPs，从而在每 个PCR循环结束时，生成的扩增子是被荧光标记的。然后使用称为 寡探针的DNA探针链定位靶DNA的扩增子。寡探针具有与靶DNA 互补的核苷酸序列。将寡探针以已知的二维模式系于基底表面，同时 基底表面形成含有PCR成分的反应室的部分。

[0028]在PCR方法的退火和延伸阶段期间，荧光标记的靶扩增子 与其相应的寡探针杂交。然后用合适波长的光的渐消波照射杂交的、 荧光标记的靶扩增子，以激活标记的dNTPs的荧光染料分子。这种 渐消波通过寡探针系于其上的基底表面进入反应室后以指数幂衰 减，其有效穿透范围大约为300nm。这就意味着渐消波穿透反应室的 深度足以激活与那些寡探针杂交的荧光标记的扩增子，但是不能激活 在反应室主体的溶液中的荧光标记的dNTPS。通过监控基底表面各 个位置的荧光强度，可以测定相应靶DNA的扩增子的当前丰度。这 可以在PCR反应进行时实时完成，并且结果用于获得原始样品中特 定靶丰度的定量测量，在某种意义上类似于实时PCR计算。

[0029]现在通过参考附图，将更详细地描述方法中示例性的实施 方案，在附图中尽可能同样的数字指同样的元件。

[0030]图1是在微阵列PCR反应中能进行渐消波检测荧光标记 的扩增子的示例性筒的横截面视图，其包括反应筒10、有表面13的 基底12、第一寡探针14、第二寡探针15、缓冲液16、第一DNA链 18、第二DNA链20、dNTPs 22、荧光标记的dNTPs 24、引物26、 热稳定的DNA聚合酶28、加热元件30和冷却元件31。

[0031]在优选的实施方案中，基底12包含光学上比缓冲液16 更致密的材料，从而可以使用下文详细描述的渐消波检测。例如基底 12可以是玻璃，或合适涂覆的塑料或聚合物。

[0032]第一和第二寡探针14和15是DNA链，各自具有它们用于 检测的DNA18和20的靶链之一的特定核苷酸序列。在优选的实施方 案中，这些寡探针是不可延伸的。换句话说，不能将核苷酸添加于寡 探针的任一端。寡探针14和15可以是天然的或合成制作的多核苷 酸、具有人造碱基和/或人造碳水化合物的多核苷酸、肽核酸(“PNA” s)、二环核酸、或其他核苷酸类似物，用商业上可获得的寡核苷酸 合成仪构建，例如，但不限于，Ann Arbor，MI的Genomic Solutions， Inc.提供的合成仪，或其可以是，但不限于选自DNA序列 文库的序列，例如已知有一些生物学重要意义的表达序列标签 (EST)文库。

[0033]将寡探针14和15排列在基底表面13上。在优选实施方 案中，用自动印刷将寡探针14和15作为小点排列在基底上，其中使 用商业上可提供的微阵列技术，例如，但不限于，Ann Arbor，MI的 Genomic Solutions，Inc.提供的微阵列仪(microarrayer)。

[0034]使用众所周知的技术之一将寡探针固定化在基底表面，例 如，但不限于，将活性甲硅烷基部分共价缀合到寡探针上。在手动或 自动沉积后这样硅烷化的分子即刻固定化于玻璃表面。通过适当地使 表面带电交替地固定寡探针，优选通过使用合适的涂层，例如，但不 限于，硅烷或聚-L-赖氨酸。

[0035]荧光标记的dNTPs 24是用荧光染料标记的核苷酸，例 如，但不限于，荧光素或罗丹明绿色染料，或有类似发荧光特性的类 似的、相关化合物，如官能化或嵌入染料和发光的、官能化的纳米颗 粒(nanoparticle)(“量子点”)。dNTPs 24可以具有荧光标记的四 个碱基核苷酸dGTP、dCTP、dATP和dTTP中的一个、两个、三 个或四个。在优选的实施方案中，仅将核苷酸之一标记，例如，仅仅 dCTP。

[0036]加热元件30可以是任意合适的电阻性材料，例如，但不 限于碳，该元件在电流通过它时可以提供热。加热元件30需要能在 数分钟内将反应室加热至94℃。冷却元件31可以是任意合适的固态 冷却元件，例如，但不限于，众所周知的发挥蒸汽泵功能的Peltier 固态装置。加热元件和冷却元件也能在筒外部。

[0037]图2是在PCR方法的退火和/或延伸阶段结束时微阵列 PCR反应中能进行渐消波检测荧光标记的扩增子的示例性筒的横截 面视图，其进一步包含第一和第二荧光标记的扩增子32和34。第一 荧光标记的扩增子32是具有核苷酸序列的DNA链，该序列是第一靶 DNA链18的互补拷贝，即，对于在第一靶DNA链18中的每一腺嘌 呤(A)核苷酸，在第一扩增子32中有胸腺嘧啶(T)核苷酸，并且 反之亦然。类似地，对于第一靶链18中的每一胞嘧啶(C)核苷酸， 在第一扩增子32中有鸟嘌呤(G)核苷酸。

[0038]在PCR方法的退火和/或延伸阶段结束时，由退火的引物 26延伸产生的扩增子32和34仍与其相应的靶DNA链18和20杂交。 此外，将PCR方法的前面循环产生的扩增子与系着的寡探针14和15 杂交。例如，在表面位点36，第二荧光标记的扩增子34与第二寡探 针15杂交。类似地，在表面位点38，第一荧光标记的扩增子32与 第一寡探针15杂交。设计寡探针14和15使其在PCR方法中不被扩 增，方法如下，例如，通过其3’端将其系于基底，或通过用双脱氧化 (dideoxidation)修饰3’端，或通过将稳定基团添加于3’端，或通过 在特定引物存在的情况下使寡探针不参与PCR方法的其他众所周知 的方法。

[0039]图3是在PCR方法的变性阶段微阵列PCR反应中能进行 渐消波检测荧光标记的扩增子的示例性筒的横截面视图。在这个阶 段，已将反应室12中的混合物加热至接近100℃，并且最优是大约 94℃。在此温度下，DNA发生变性，即，其分离成单独的单链。在 PCR方法的下一阶段将其冷却时，单独DNA靶链18和20的每一条， 以及荧光扩增子32和34的每一个将与第一引物26退火。在每一单 独DNA靶链18和20，以及每一荧光扩增子32和34与作为原始靶 链18和20的拷贝或互补拷贝的新扩增子杂交之前，在热稳定的DNA 聚合酶28添加合适的核苷酸时，将延伸退火的引物26。

[0040]图4是在PCR方法的检测阶段微阵列PCR反应中显示进 行渐消波检测荧光标记的扩增子的示例性筒的横截面视图，其进一步 包含光入射束40、入射角42、光反射束44、光渐消束46、光荧光束 48和荧光检测器50。检测阶段可与退火和/或延伸阶段同时发生。

[0041]选择光入射束40为适于激发用于标记dNTPs 24的荧光 团(flurophore)的波长。在优选的实施方案中，光入射束40是氩离 子激光器的488nm谱线，该谱线与优选用于标记dNTPs 24的荧光染 料的激发最大值(494nm)相匹配。

[0042]选择比基底与缓冲液界面临界角大的光入射束40的入射 角42。入射临界角是全内反射发生时的角并且取决于形成界面的材 料的折射率。从Snell’s折射定律来看，

入射临界角＝sin^-1(n₁/n₂)

其中n₁和n₂是界面每一侧材料的折射率。在本发明的优选实施 方案中，基底12包含玻璃并且折射率大约1.5，然而缓冲液16主要 包含折射率约1.3的水，从而入射临界角大约是61度。

[0043]当光以大于临界角的入射角42从界面13反射，从而发生 全内反射时，渐消波46形成并且通过界面传播。对于距离界面的距 离每增加130nm，渐消波46的强度以e因子降低。这样使用渐消波 46仅可以照射与界面距离很近的物体。这个特性用于本发明的优选 实施方案中，以优选地照射与第一和第二寡探针14和15杂交的第一 和第二荧光标记的扩增子32和34。然后可以且通过荧光检测器50 检测并分析由荧光标记的扩增子14和15发射的荧光48。荧光检测 器50通常包含收集光学装置，例如，但不限于，将光线聚焦于检测 系统上的显微镜物镜，该检测系统例如，但不限于，光电倍增管或电 荷耦合设备(CCD)照相机或光电二极管。

[0044]收集的荧光来源和强度然后可用于估计荧光发射分子的数 目，并且因此用例如在实时或动态PCR分析中使用的众所周知的定 量技术，估计目前与特定种类的寡探针杂交的荧光标记的扩增子的数 目。其中，反应的特征在于第一次检测到PCR产物的扩增时在循环 期间的时间点，而不是在固定循环数之后累积的PCR产物的量。原 始样品中核酸靶的拷贝数越高，观察到荧光显著的增加越快。

[0045]在本发明进一步的实施方案中，通过监控反射光和测定荧 光标记吸收的光的量，可以检测荧光信号。

[0046]图5是荧光信号对三条靶DNA链的循环数的示例性图 52、54和56，每一条在原始样品中都有不同的拷贝数。即使当没有 PCR循环发生时，也有开始或基线，背景荧光信号，可检测。在PCR 的起始循环中，该荧光信号有很小改变。超过基线的荧光增加显示累 积的PCR产物的检测。通过设置固定的超过基线的荧光阈值，循环 阈值(CT)参数可定义为特定寡探针的荧光通过该固定阈值的部分 循环，如三个部分值C_T1、C_T2和C_T3所示的。

[0047]图6是原始样品中靶DNA链拷贝数的对数(log[N])对 靶DNA循环阈值(CT)的示例性图。由于PCR的指数特性，原始 靶拷贝数对数对CT的图是直线60。通过引入大量校准DNA靶，其 具有已知的原始样品中拷贝数，与其相应的寡探针结合的荧光可用于 产生原始拷贝数的对数对CT的直线校准线60。通过测量已知有特定 寡探针的反应室上位置的CT，然后可以从校准曲线推断出与该寡探 针相应的靶DNA的拷贝数。

[0048]虽然上述讨论已经用DNA作为示例性核酸，但是对本领 域的技术人员显而易见的是将本发明应用于其它核酸，包括RNA序 列或RNA和DNA序列的组合。

[0049]虽然上述讨论已经用PCR作为示例性的反应，但是对本 领域的技术人员显而易见的是利用任何合适的扩增反应应用本发明 的方法，例如，但不限于，逆转录PCR、随机引物扩增、滚环扩增 或线性扩增“T7”。

[0050]虽然上述讨论已经将荧光标记的dNTP用于标记靶 DNA，但是对本领域的技术人员显而易见的是将相关结构，例如，但 不限于，荧光标记的引物、官能化的纳米颗粒、或嵌入染料用于标记 靶DNA。

[0051]虽然为了简单起见，已经按照两个靶核酸讨论了上述讨 论，但是对本领域的技术人员显而易见的是将本方法和装置用于一个 靶核酸或多个靶核酸的定量评估。

[0052]虽然已经用对结构特征和/或方法行为特定的语言进行了 描述，但是应该理解在附加权利要求中定义的本发明不需要限于所描 述的特定特性或行为。而是，以实现请求保护的发明的示例性形式， 公开特定的特性和行为。