一种人血管内皮细胞生长抑制因子嵌合多肽及其制备方法和在靶向性抗肿瘤活性中的应用

摘要

本发明提供了一种人血管内皮细胞生长抑制因子的嵌合多肽，其嵌合多肽是人血管内皮细胞生长抑制因子VEGI－192A与RGD－4C多肽相连接而成的RGD－VEGI－192A嵌合重组蛋白。上述嵌合多肽的制备方法包括用SEQ IDNO：1所示的核苷酸序列构建表达载体，并在宿主细胞中诱导表达的步骤。本发明的该嵌合多肽是一种新型血管新生拮抗剂，可应用在靶向性抗肿瘤中，在肿瘤等血管新生性疾病中具有潜在治疗价值。同时，本发明丰富了VEGI－192A在肿瘤治疗中的应用形式，为肿瘤靶向治疗提供了新思路，为RGD－VEGI－192A嵌合多肽作为一种更为有效的临床药物开发打下基础。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种人血管内皮细胞生长抑制因子嵌合多肽及其制备方法和在靶向性抗肿瘤活性中的应用。

背景技术

恶性肿瘤是严重威胁人类生命健康的头号杀手，手术、放疗和化疗是治疗肿瘤的常用方法。放疗、化疗因同时杀伤肿瘤细胞和正常细胞，副作用大，因此寻找特异、高效的肿瘤治疗方法一直是肿瘤研究的热点。肿瘤靶向治疗是利用具有一定特异性的载体，将药物或其他杀伤肿瘤细胞的活性物质选择性地运送到肿瘤部位，把治疗作用或药物效应尽量限定在特定的靶细胞、组织或器官内，而不影响正常细胞、组织或器官的功能，从而提高疗效、减少毒副作用的一种方法。

肿瘤的血管新生(tumor angiogenesis)是一个多步骤的复杂过程，且受控于多种血管生成因子，是血管生成刺激因子与血管生成抑制因子的不平衡调节的结果。“抑制肿瘤新生血管理论”认为异常活跃的血管新生(Angiogenesis)是肿瘤生长的必要条件：(1)肿瘤必须建立新的血管获取营养以利于其生长和扩散；(2)如果没有新生血管提供营养，实体瘤的生长不会超过2mm³，并且不会发生转移和扩散；(3)已经形成的肿瘤在新生血管崩溃后亦发生肿块崩溃。血管新生拮抗剂(Antiangiogenic agents，or Angiogenesis inhibitors)通过阻断肿瘤诱导血管新生的病理过程，在动物肿瘤模型试验中，可以观察到肿瘤体积由较大消退至微小，并可以在药效范围内使之保持休眠。

肿瘤血管有四大特点，使其成为开发抗癌药物的一个理想靶标。(1)同处于静止状态的正常血管相比，肿瘤血管内皮细胞处于高度活跃的生长状态，两者具有明显相异的表型，因而选择性地抑制生长中的肿瘤血管内皮而不损伤静息的正常血管，使得药物的副作用小，从而可长期使用；(2)肿瘤血管细胞是从正常组织进入肿瘤的正常细胞，基因组稳定，与基因组极不稳定的癌细胞相比，不容易产生抗药性；(3)尽管各种肿瘤细胞的基因组和表型差异极大，其血管细胞因为是正常细胞，差异较小，因此针对肿瘤血管的同一药物理论上对不同肿瘤均有疗效；(4)由于一条血管可供养成百上千个肿瘤细胞，因此其作用效率较高。此外，抗血管新生疗法只是阻抑新生血管的发生和生长，从而阻止肿瘤的增殖和扩散。正常细胞不会受到影响。

血管内皮生长抑制因子(VEGI)是一种新发现的血管新生拮抗剂，由Tan等人于1997年通过筛选人脐静脉内皮细胞cDNA文库首先发现的，定位于染色体9q32。VEGI由血管内皮细胞合成，属于TNF(tumour necrosis factor肿瘤坏死因子)超家族成员，与TNF超家族其他成员的氨基酸序列同源性为20％-30％，属II型跨膜糖蛋白，其N端1-25位氨基酸为胞内区和跨膜区，C端29-174为胞外区。完整的成熟蛋白质(VEGI174)由174个氨基酸组成，分子量为22kD。人VEGI基因全长17kb，由四个外显子和三个内含子组成，通过不同的剪接方式形成三种异构体，分别含有174个(VEGI-174)，192个(VEGI-192)和251(VEGI-251)个氨基酸。研究发现，全长的VEGI-174的可溶性很差，对于体外培养的血管内皮细胞无明显的抑制作用。而人VEGI的第29-174氨基酸残基的重组蛋白却表现出对血管内皮细胞很强的抑制作用。在进一步的研究中，我们发现VEGI不只是特异性的作用于内皮细胞，它对于各种不同的肿瘤模型(其中包括乳腺癌、前列腺癌、结肠癌等)都具有显著的抗肿瘤疗效。体外实验表明，VEGI-192A能显著抑制牛主动脉内皮细胞与人脐静脉内皮细胞的增殖，在三种拼接异构体中为最高，而对人冠状动脉平滑肌细胞以及鼠路易士肺癌细胞LLC等其他类型的细胞无抑制增殖作用。此外，VEGI-192A还能抑制内皮细胞形成血管状结构。体内实验研究显示，在鼠路易士肺癌同种移植C57BL/6小鼠肿瘤模型中，系统性腹腔注射VEGI-192A可有效抑制异体移植的肿瘤生长，肿瘤血管化程度显著降低。且对肾脏、肝脏显示无毒性。作为血管内皮细胞自分泌的抑制因子，VEGI-192A具有重要的病理生理意义。这说明VEGI有望成为一种广谱性的肿瘤抑制药物。

整合素是一类膜受体家族，每个成员的分子都是由a、β两条链(亚单位)靠非共价键连接形成的异源双体跨膜蛋白。现已经发现有18种a亚单位和8种β亚单位。整合素通过与相应配体结合介导细胞与基底膜、细胞与细胞的粘附，还作为细胞内外信息传递的桥梁。目前已知的24种整合素中，大部分与配体结合是通过识别配体所含的RGD序列。虽然，不同的整合素都能以一定的亲合力与含RGD的配体结合，但是不同的整合素还是能够区分出各自不同的配体。在一些肿瘤细胞或者肿瘤新生血管内皮细胞常特异性地高表达某些整合素，如a_vβ₃或a_vβ₅受体，而正常细胞不表达或表达量很低。整合素a_vβ₃在肿瘤新生血管形成、肿瘤生长和转移过程中发挥重要作用，利用RGD肽竞争结合整合素，可以抑制肿瘤迁移和肿瘤新血管生成，因此这类受体可以作为一类新的肿瘤治疗靶点。

RGD肽是一类含有精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸(Arg-Gly-Asp)的短肽，细胞外基质(ECM)和血液中的粘附蛋白是人体中最常见的含RGD序列的蛋白，主要包括纤维蛋白(fibrinogen，Fg)、层粘连蛋白原(vitronectin，Vn)、胶原(collagen)等。研究发现，大部分整合素与其配体的结合过程，是通过识别配体中所含的RGD序列来完成的(Pierschbacher MD，et al.Nature，1984，309：30-33；Ruoslahti E.Matrix Biol，2003，22(6)：459-465.)。作为整合素和其配体相互作用的识别位点，介导细胞与细胞外基质及细胞之间的相互作用。肿瘤细胞或者新生血管可以特异表达某些整合素如a_vβ₃，能以一定的亲和力结合RGD肽，成为肿瘤治疗的新靶点。因此，RGD肽在肿瘤治疗中的应用已成为研究热点。RGD肽可以诱导肿瘤细胞凋亡且作为载体在肿瘤靶向治疗中发挥重要作用。目前，通过噬菌体表面展示技术，筛选出了一类与整合素a_vβ₃特异性结合的RGD肽，即ACDCRGDCFCG(RGD-4C)，这类RGD肽可以作为肿瘤靶向载体，特异性地引导抗肿瘤药物到达肿瘤部位。RGD肽在肿瘤显像、抑制肿瘤血管形成、肿瘤基因靶向治疗等方面有着广泛应用将TNF-a和含RGD的多肽ACDCRGDCFCG融合后，RGD多肽结合a_vβ₃的能力没有减低，同时TNF-a的抗肿瘤特性也得到增强，更重要的是发挥了RGD多肽的靶向性，减少了TNF-a单独使用的副反应。有研究显示将通过噬菌体库筛选的与a_vβ₃高亲和力的RGD多肽与抗肿瘤抗体的Fc融合，抑制肿瘤血管生成并且具有靶向治疗效果。

目前对于VEGI蛋白的三维立体结构、作用机理和药理学性质没有完整清晰的了解，需要构建靶向性更强的嵌合重组蛋白，并检测其生物学活性，研究融合蛋白体外诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞生长的能力，并检测其与肿瘤细胞的结合特性，鉴定其肿瘤靶向性，深入探讨利用VEGI蛋白构建的重组蛋白的体内靶向抑瘤活性及肿瘤治疗的应用前景。

发明内容

为了克服上述技术缺陷，本发明提供了一种人血管内皮细胞生长抑制因子嵌合多肽，具体指RGD-VEGI-192A嵌合多肽，同时提供了该嵌合多肽的制备方法和在靶向性抗肿瘤活性中的应用，为RGD-VEGI-192A嵌合多肽作为一种更为有效的临床药物开发打下基础。

本发明的具体技术方案如下：

本发明的一种人血管内皮细胞生长抑制因子的嵌合多肽是人血管内皮细胞生长抑制因子VEGI-192A与RGD-4C多肽相连接而成的RGD-VEGI-192A嵌合重组蛋白。

该嵌合多肽具有如SEQ ID NO：1所示的编码核苷酸序列。

该嵌合多肽具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

上述RGD-4C多肽的氨基酸序列为ACDCRGDCFCG：Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly。

本发明还提供了一种上述嵌合多肽的制备方法，包括用上述SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列构建表达载体，并将该表达载体在宿主细胞中诱导表达的步骤。

进一步，本发明还提供了一种上述嵌合多肽的制备方法，通过RT-PCR从人脐静脉血管内皮细胞总RNA扩增得到RGD-VEGI-192A目的基因片段，将ACDCRGDCFCG多肽和VEGI-192A的N端融合，使用限制性内切酶双酶切取目的基因，连接至表达载体pET-30a中构建重组蛋白RGD-VEGI-192A表达载体，插入位点5’端含有编码ACDCRGDCFCG多肽的核苷酸序列，3’端含有编码6个组氨酸的核苷酸序列。再转化至大肠杆菌宿主菌中诱导表达，最后纯化蛋白。

上述RT-PCR中使用的上游引物和下游引物分别为：

5’-TTCCATATGGCTTGCGACTGCCGTGGTGACTGCTTCTGCGGTCAACTCACAAAGGGCCGTCT-3’，

5’-CGCGGATCCCTATAGTAAGAAGGCTCCAAAGAAGGTT-3’，

所述上游引物和下游引物均含有5’端的Nde I限制性酶切位点以及3’端的BamH I限制性酶切位点。

优选的，所述的大肠杆菌宿主菌为OrigamiB(DE3)。

优选的，所述的诱导方法采用pET T7 RNA聚合酶复合自动诱导。

优选的，所述的纯化方法采用镍离子金属螯合亲和层析。

上述人血管内皮细胞生长抑制因子RGD-VEGI-192A的嵌合多肽可以应用在靶向性抗肿瘤中。

本发明具有如下有益效果：

本发明的一种人血管内皮细胞生长抑制因子RGD-VEGI-192A的嵌合多肽是一种新型血管新生拮抗剂。以整合素a_vβ₃为肿瘤靶点，RGD-4C肽为肿瘤靶向载体，VEGI-192A蛋白为抗肿瘤效应分子，RGD-VEGI-192A嵌合蛋白体内靶向性抑瘤活性更强，在肿瘤等血管新生性疾病中具有巨大的潜在治疗价值。同时，本发明丰富了VEGI-192A在肿瘤治疗中的应用形式，为肿瘤靶向治疗提供了新思路，为RGD-VEGI-192A嵌合多肽作为一种更为有效的临床药物开发打下基础。

下面将结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

附图说明

图1是本发明PCR扩增RGD-VEGI-192A目的基因的一个优选实施例的电泳图；

图2是本发明酶切鉴定重组质粒所得酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳的一个优选实施例的电泳分析图；

图3是本发明自动诱导表达系统中高表达克隆的筛选获得的8个克隆菌落裂解液的SDS-PAGE的一个优选实施例的结果图；

图4是本发明自动诱导表达系统的不同诱导时间表达的蛋白的SDS-PAGE的一个优选实施例的结果图；

图5是本发明采用7种不同特性的变性剂溶解包含体检测最佳溶解方案的一个优选实施例的结果图；

图6是本发明在变性条件下采用Ni-NTA柱金属螯合亲和层析技术纯化提取重组蛋白的SDS-PAGE的一个优选实施例的结果图；

图7是本发明纯化的目的蛋白的Western Blotting的一个优选实施例的结果图；

图8是本发明MTT比色法检测RGD-VEGI-192A嵌合蛋白体外剂量依赖性抑制牛主动脉内皮细胞增殖的生物学活性的一个优选实施例的结果图；

图9是本发明MTT比色法检测RGD-VEGI-192A嵌合蛋白体外剂量依赖性抑制人脐静脉内皮细胞增殖的生物学活性的一个优选实施例的结果图；

图10是本发明AnnexinV-FITC/PI染色流式细胞仪检测RGD-VEGI-192A重组蛋白诱导内皮细胞凋亡的生物学活性的一个优选实施例的结果图；

图11是本发明采用鸡胚绒毛尿囊血管新生抑制试验测定RGD-VEGI-192A嵌合蛋白及rhVEGI-192A重组蛋白体内抑制血管新生活性的一个优选实施例的结果图；

图12是本发明对BALB/cA-nude裸鼠皮下接种人乳腺癌细胞MDA-MB435体内抗肿瘤活性检测中腹腔注射RGD-VEGI-192A嵌合蛋白及rhVEGI-192A重组蛋白对体内肿瘤生长抑制的一个优选实施例的曲线图；

图13是本发明对BALB/cA-nude裸鼠皮下接种人乳腺癌细胞MDA-MB435体内抗肿瘤活性检测中小鼠体重随给药时间变化的一个优选实施例的曲线图。

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1：嵌合蛋白RGD-VEGI-192A表达载体的构建

通过RT-PCR方法技术从人脐静脉血管内皮细胞总RNA中扩增，根据SEQID NO：1所示的VEGI-192A核苷酸序列，将ACDCRGDCFCG多肽和VEGI-192A的N端融合，扩增获得RGD-VEGI-192A目的基因。PCR上游引物为5’-TTCCATATGGCTTGCGACTGCCGTGGTGACTGCTTCTGCGGTCAACTCACAAAGGGCCGTCT-3’，下游引物为：5’-CGCGGATCCCTATAGTAAGAAGGCTC CAAAGAAGGTT-3’。上下游引物都含有5’端的Nde I限制性酶切位点以及3’端的BamH I限制性酶切位点。图1是PCR扩增RGD-VEGI-192A目的基因后，将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳分析的电泳图，其中1，2，3，4为PCR产物，M为1Kb梯度DNA分子量标准。图1的结果显示扩增得到的产物片段大小在500bp-750bp之间，与RGD-VEGI-192A目的基因的预期片段大小630bp相符。

再使用以上两种限制性内切酶双酶切取目的基因，最后连接至表达载体pET-30a中构建融合重组蛋白RGD-VEGI-192A表达载体。插入位点5’端含有编码ACDCRGDCFCG多肽的核苷酸序列，3’端含有编码6个组氨酸的核苷酸序列。图2是酶切鉴定重组质粒实验中，将酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳分析的电泳图，其中1，2，3，4，5为pET-30a-RGD-VEGI-192A经Nde I和BamH I双酶切产物，M为1Kb梯度DNA分子量标准。图2的结果显示酶切后的产物除了pET-30a外，还有一段RGD-VEGI-192A的基因片段，在500bp-750bp之间，与RGD-VEGI-192A目的基因的预期片段大小630bp接近。

实施例2：RGD-VEGI-192A嵌合蛋白在大肠杆菌中的自动诱导表达及高表达克隆的筛选

1.自动诱导：采用表达载体pET-30a-RGD-VEGI-192A转化感受态细胞BL21(DE3)pLysS，随机挑取8个克隆菌落到3mL LB培养基中，添加卡那霉素至终浓度50μg/mL，37℃复苏培养过夜。次日离心收集菌体沉淀，通过SDS-PAGE分析重组表达的情况。

2.1000×微量金属溶液：0.05M FeCl₃；-0.12M HCl；0.02M CaCl₂；0.01M MnCl₂-4H₂O；0.01M ZnSO₄-7H₂O；0.002M CoCl₂-6H₂O；0.002M CuCl₂-2H₂O；0.002M NiCl₂-6H₂O；0.002M Na₂MoO₄-5H₂O；0.002M Na₂SeO₃-5H₂O；0.002MH₃BO_3·加双蒸水定量到100mL。

3.自诱导表达培养基：1％胰蛋白胨(tryptone)，0.5％酵母提取物(yeastextract)，25mM Na₂HPO₄，25mM KH₂PO₄，50mM NH₄Cl，5mM Na₂SO₄，2mM MgSO₄，0.2×metals(10μM Fe+9)，0.5％甘油(glycerol)(54mM)，0.05％ glucose(葡萄糖)(2.8mM)，0.2％a-乳糖(a-lactose)(5.6mM)。

4.应用高通量SDS-PAGE的方法，从136个克隆菌落中筛选出表达效率最高的8个单菌落。图3是自动诱导表达系统中高表达克隆的筛选获得的8个克隆菌落裂解液进行的SDS-PAGE结果图，其中1至8为高表达克隆菌落组，C为转化了空质粒载体的克隆菌落组，M为蛋白质分子量标准(kD)，宿主菌为OrigamiB(DE3)。在进行后续表达、纯化工作的同时低温-80℃保种已筛选出的克隆菌落。SDS-PAGE后应用凝胶扫描软件分析目的蛋白表达量占到总菌体蛋白的50％。

实施例3：自动诱导表达系统的条件优化

1.宿主菌优化：为改善RGD-VEGI-192A嵌合蛋白的可溶性，我们采用BL21(DE3)pLysS和OrigamiB(DE3)两种宿主菌，其中OrigamiB(DE3)宿主菌trxB和gor基因有突变，从而为重组蛋白在宿主菌中提供均衡氧化还原势，以利于蛋白的正确空间折叠。根据上述图3的结果，在两种宿主菌中自动诱导RGD-VEGI-192A嵌合蛋白重组蛋白的产量相差不大，但是在宿主菌OrigamiB(DE3)中自动诱导体系中背景杂蛋白较稍小，所以我们最终选择宿主菌为OrigamiB(DE3)的#1号高表达克隆菌落，培养时间为16h，培养温度为25℃，采用自诱导培养系统高密度培养来制备目的蛋白。

2.诱导温度优化：在10℃、25℃、37℃三种温度下，自动诱导下大量表达RGD-VEGI-192A嵌合蛋白重组蛋白，并以包含体形式回收RGD-VEGI-192A嵌合蛋白。由结果可知诱导温度越低，高活性的RGD-VEGI-192A嵌合蛋白(以二聚体或多聚体形式存在)越多。综合产量和活性考量，我们选择25℃诱导条件。

3.诱导时间优化：在以下六个时间点：2h，4h，8h，12h，16h，24h，分别收集菌液用裂解缓冲液裂解细菌进行SDS-PAGE电泳检测目的蛋白诱导产量。结果见图4，图4中BSA加样量为2μg，M为蛋白质分子量标准，宿主菌为OrigamiB(DE3)。由此图可知，诱导时间为16h就可以得到较高产量。

实施例4：重组蛋白的纯化与复性

1.首先用7种不同特性的变性剂溶解包含体。图5是采用7种不同特性的变性剂溶解包含体检测最佳溶解方案。1至7分别表示为：1：1％ Triton X-100；2：0.1％ Triton X-100；3：CHAPS(3-[(3-胆酰氨基丙基)二甲氨基]丙磺酸盐)；4：PBS；5：Non-detergent sulfobetaines-195(1-(3-磺丙基)吡啶内嗡盐-195)；6：8M尿素(Urea)；7：4M尿素(Urea)，M为蛋白质分子量标准(kD)，宿主菌为OrigamiB(DE3)。由图5得出最佳溶解方案为利用8mM尿素溶解细菌和包涵体。由图5可知，选用8M尿素作为变性剂较好。

2.采用Ni-NTA柱金属螯合亲和层析技术纯化提取重组蛋白：

1)取诱导培养的菌液，15000r/min，1min离心收集菌体沉淀；加入1/100倍细菌培养液体积的细菌裂解液重悬细菌，15000r/min，1min离心，收集上清液；

2)在第1)步中收集到的上清液中加入1/4倍细菌培养液体积的50％Ni-NTA His·Bind层析剂，然后将混合液放到摇床上，室温下混合60min。(为了达到更好的结合效果，可以混合更长时间，不过如果时间很长的话，应在冰上操作，避免蛋白的降解)。将混合物装柱，待柱料沉降完全后，收集剩余1mL上清，用于SDS-PAGE分析。

3)用4mL洗涤液洗涤层析柱，流速约28-30滴/min，共洗涤8次，收集每次洗涤液从层析柱流出的液体，用于SDS-PAGE分析。

4)用0.5mL洗脱液洗脱目的蛋白，流速约28-30滴/min，共洗脱8次，收集每次洗涤液从层析柱流出的液体，用于SDS-PAGE分析。

利用8mM尿素溶解细菌和包含体，采用Ni-NTA柱亲和层析技术对收集的重组蛋白包含体溶解液进行纯化。SDS-PAGE结果显示，Ni²⁺-NTA亲和层析柱与目的蛋白的结合能力很强，所以过柱后的流出液中几乎无目的蛋白。鉴于我们的蛋白产量非常高，所以洗涤4次。洗脱的结果很好，SDS-PAGE结果显示为电泳单带，没有其它的杂蛋白条带，结果见图6。图6是在变性条件下采用Ni-NTA柱金属螯合亲和层析技术纯化提取重组蛋白的电泳图。W1至W4为四次洗涤液点样，E1至E12为十二次洗脱液点样，FT为过柱后流出液，BSA加样量为2μg，M为蛋白质分子量标准(kD)，宿主菌为OrigamiB(DE3)。

3.重组蛋白的透析复性

透析复性缓冲液(50×Dialysis buffer)：购自Novagen公司，使用时稀释成1×Dialysis buffer；1mol/L DTT：购自Novagen公司；30％十二烷基肌氨酸钠溶液(N-lauroylsarcosine)：购自Novagen公司；透析液A：1×Dialysis buffer，加入DTT至终浓度0.1mmol/L；透析液B：1×Dialysis buffer；透析液C：1×Dialysis buffer，加入1mmol/L还原型谷胱甘肽和0.2mmol/L氧化型谷胱甘肽。

利用8mol/L尿素强变性剂保持蛋白的溶解性，在透析过程中使变性蛋白逐渐自然复性。将含有目的蛋白的洗脱液按比例用去离子水稀释，加入4mol/L尿素溶液，装入上述经过预处理的透析袋中。取50倍于蛋白稀释体积的透析液A，4℃透析3小时，更换透析液A继续透析3小时。然后用透析液透B析3小时，更换透析液B继续透析3小时。取25倍于蛋白稀释体积的透析液C，4℃透析过夜。收集透析后蛋白，离心收集上清液。通过SDS-PAGE分析透析结果。对该纯化蛋白应用Novagen Refolding试剂盒结合阴离子交换树脂的方法进行复性，成功建立了针对RGD-VEGI-192A的稳定的复性方法，获得可溶性的重组蛋白，复性得率约为60％。

实施例5：Western Blot鉴定目的蛋白

SDS-PAGE只能从分子量上去推测得到的是目的蛋白，要进一步确定得到的是目的蛋白，需要进行Western Blotting检测，所以我们对制备的RGD-VEGI-192A嵌合蛋白进行Western Blotting分析，结果证明我们纯化提取的重组蛋白即为RGD-VEGI-192A嵌合蛋白，见图7。图7是鉴定目的蛋白的Western Blotting结果，RGD-VEGI-192A为纯化得到的重组蛋白。

Western blotting实验方法：将蛋白质样品进行SDS-PAGE，待溴酚蓝跑出胶后停止电泳；准备好两张3M滤纸和一张PVDF膜，浸入甲醇去离子水5分钟，然后与专用滤纸和纤维垫浸泡于1×转膜缓冲液中；剥下凝胶，去掉浓缩胶部分，并把滤纸和PVDF膜裁成凝胶大小；按照三明治夹心法转膜，安置次序如下：负极-纤维垫-1张专用滤纸-凝胶-PVDF膜-1张专用滤纸-纤维垫正极板，将其放入转膜槽中；冰浴，300mA转膜1小时；取出PVDF膜，封闭液封闭2小时；一抗孵育2小时；回收一抗，TBST洗膜，每次15min，重复3次；二抗孵育45-60min；回收二抗，TBST洗膜，每次15min，重复3次；在暗房用ECL显色液显色。

实施例6：浓度和纯度的检测

1.纯度检测：SDS-PAGE法检测，96％单体，4％为多聚体。多聚体中95％为二聚体，3％为三聚体及多聚体。应用透析法复性，并采用液相层析法去除内毒素。以鲎试剂法检测每批次蛋白内毒素浓度均小于5EU/mg。

2.浓度检测：采用BCA蛋白定量法对提取纯化的RGD-VEGI-192A嵌合蛋白重组蛋白定量，得到定量标准曲线图及浓度公式Y＝0.0521X+0.0357，相关系数R2达到0.999，结果准确度非常高。由此计算出获取RGD-VEGI-192A嵌合蛋白重组蛋白最大产量达80mg/L(最佳产量菌株#1号克隆)。

实施例7：RGD-VEGI-192A嵌合蛋白及rhVEGI-192A重组蛋白的体外剂量依赖性抑制内皮细胞增殖的生物学活性比较

1.细胞培养：牛主动脉内皮细胞(ABAE)培养于含5％胎牛血清、2mML-谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸、10mM Hepes(羟乙基哌秦乙硫磺酸溶液)、100IU/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM完全培养基中，置于37℃、5％CO₂孵箱中孵育培养；传代时用含0.02％ EDTA的0.05％胰酶消化，以DMEM完全培养基终止消化。人脐静脉内皮细胞(HUVEC)培养于含20％胎牛血清HESFM培养基中，置于37℃、5％ CO₂孵箱中孵育培养；传代时用上述胰酶消化，以胰酶抑制剂终止消化。

2.MTT比色实验：将人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和牛主动脉内皮细胞(ABEC)细胞消化后计数，按每孔1.0×10⁴个细胞分别接种至96孔细胞培养板中，置于37℃、5％ CO₂孵箱中孵育培养。24h后更换为含不同浓度的rhVEGI-192A重组蛋白以及RGD-VEGI-192A嵌合蛋白的培养基，每个浓度均设3个平行复孔，继续培养48h。随后每孔加入5mg/mLMTT溶液20μL，37℃作用4h，离心后弃上清液，加入DMSO150μL，振荡器振荡10min充分溶解结晶，置酶标仪上测定波长为570nm下的吸光度A值，按以下公式计算抑制率。细胞生长抑制率(％)＝(对照组平均A值-实验组平均A值)/对照组平均A值×100％。对照组即rhVEGI-192A重组蛋白或RGD-VEGI-192A嵌合蛋白浓度为0的培养孔。使用半数抑制浓度(IC₅₀)计算软件Bliss’s software计算IC₅₀，应用SPSS软件进行数据统计分析。

3.结果：应用MTT比色试验法测定rhVEGI-192A重组蛋白和RGD-VEGI-192A嵌合蛋白对内皮细胞生长增殖的抑制活性，结果见图8和图9。图8是MTT比色法检测重组蛋白RGD-VEGI-192A体外剂量依赖性抑制牛主动脉内皮细胞增殖的生物学活性。图9是MTT比色法检测重组蛋白RGD-VEGI-192A体外剂量依赖性抑制人脐静脉内皮细胞增殖的生物学活性。比较RGD-VEGI-192A嵌合蛋白与rhVEGI-192重组蛋白抑制内皮细胞生长的活性，发现，前者比后者强一倍左右。RGD-VEGI-192A嵌合蛋白对HUVEC细胞系IC₅₀为0.396382μg/mL，对ABAE细胞系IC₅₀为0.0791472μg/mL。rhVEGI-192重组蛋白对HUVEC细胞系IC₅₀为0.566185μg/mL，对ABAE细胞系IC₅₀为0.100979μg/mL。

实施例8：Annexin V-FITC/PI染色检测RGD-VEGI-192A嵌合蛋白及rhVEGI-192A重组蛋白诱导内皮细胞凋亡效果的比较

使用Annexin V细胞染色分析检测细胞早期凋亡指标。在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V是一种的Ca²⁺依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。将Annexin V进行荧光素FITC标记，以标记了的Annexin V作为荧光探针，利用荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将Annexin V与PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。

Annexin V-FITC/PI染色方法：将HUVEC细胞分别用0.5μg/mLRGD-VEGI-192A嵌合蛋白及rhVEGI-192A重组蛋白蛋白处理后，用细胞刮从培养皿上刮取细胞，1×PBS洗涤细胞二次(2000xrpm离心5min)，收集5×10⁵个细胞。加入500μL的结合缓冲液悬浮细胞后，加入5μL Annexin V-FITC混匀，再加入5μL碘化丙锭(PI)，混匀，室温避光反应5～15min。在1h内，用流式细胞仪检测，激发波长Ex＝488nm；发射波长Em＝530nm。AnnexinV-FITC的绿色荧光通过FITC通道(FL1)检测；PI红色荧光通过PI通道(FL2或FL3)检测，建议使用FL3。荧光补偿调节：使用未经凋亡诱导处理的正常细胞，作为对照进行荧光补偿调节去除光谱重叠和设定十字门的位置。

对HUVEC细胞分别用RGD-VEGI-192A嵌合蛋白及rhVEGI-192A重组蛋白以同等浓度0.5μg/mL处理8小时后，结果显示，两种蛋白能够诱导人脐静脉内皮细胞HUVEC的凋亡。且RGD-VEGI-192A嵌合蛋白诱导内皮细胞凋亡的能力比rhVEGI-192A重组蛋白的强，在同等浓度同样时间作用下，前者诱导内皮细胞凋亡细胞所占比例为后者的一倍左右。见图10(AnnexinV-FITC/PI染色流式细胞仪检测RGD-VEGI-192A重组蛋白诱导内皮细胞凋亡的生物学活性的结果图)。

实施例9：RGD-VEGI-192A嵌合蛋白及rhVEGI-192A重组蛋白的抑制鸡胚绒毛尿囊膜血管新生生物学活性的比较

种蛋孵化第6天，在超净台上将蛋胚用酒精消毒后用牙科钻或砂轮在蛋胚顶端戳一小口，然后小心地去掉周围的蛋壳和壳膜，使开口约为1.5cm×1.5cm大小。此时可以看到气室底部隔着一气室膜即为尿囊膜(CAM)，并且可以清楚地看到CAM膜上血管网的大小和分布位置以及跳动的鸡胚心脏。确定加样部位后小心地用注射针头从气室与卵黄分隔处挑破气室膜，注人1-2滴无菌水，使气室膜与CAM膜分开，然后用镊子轻轻去除上层的气室膜，暴露下层的CAM膜。先期准备好样品，并分为三组：PBS对照组，rhVEGI-192A重组蛋白组以及RGD-VEGI-192A嵌合蛋白组，将样品以10μL体积(均为10mg)拌加到5mm×5mm大小的明胶海绵载体上风干后，用镊子轻轻将载样滤纸置于CAM和卵黄囊膜处血管较少的部位，然后用灭菌透明胶封口，继续孵育48h或更长时间。由观察窗加入甲醇:丙酮＝1∶1的固定液预固定15min，去掉鸡胚，取下CAM并与蛋皮分离，完成后固定，将CAM平铺在平板或滤纸上，可长期保存。

解剖镜下相同放大倍数计数血管，根据直径分为大、中、小三种血管。以实验部位边缘1mm范围内为一级血管，以实验部位边缘5mm处为二级血管，一、二级管血管分别观察分析。以被检物为中心，周围血管放射状朝向被检物的生长状态，称为血管辐辏。主干血管向载体盘的弯曲和靠近称之为血管的吸引。在解剖显微镜观察下，根据血管直径将血管分为3类：d>0.1mm为大血管；0.1mm>d>0.05mm为中血管；d<0.05mm为小血管(王蕾，张树成，吴志奎，等，中国药理与临床，2000，16(6)：46-47)。阳性标准表现出明显的血管辐辏，以实验部位为中心，尿囊膜血管大量向载体生长集中，排列成车辐状，其中有1条以上中血管或小血管成车辐状，但同时有中等以上的血管吸引。阴性标准周围血管形成正常，或血管反应较轻，向载体生长的血管少而细，分布零乱，甚至产生视觉可见的无血管区域。居于二者之间的也定为阴性。血管计数可结合自动图像分析系统、摄像等技术完成。我们观察明胶海绵载体周围1cm范围内与远离(大于1cm)位置的血管密度，计算出现血管新生抑制的鸡胚数目，数据进行方差分析。表1是重组蛋白rhVEGI-192A及RGD-VEGI-192A对鸡胚尿囊膜一级血管，二级血管的抑制作用的数据方差分析，表2是重组蛋白rhVEGI-192A及RGD-VEGI-192A对鸡胚尿囊膜大、中、小血管的抑制作用。图11是采用鸡胚绒毛尿囊血管新生抑制试验测定RGD-VEGI-192A嵌合蛋白及rhVEGI-192A重组蛋白体内抑制血管新生活性的结果图。

由结果我们发现rhVEGI-192A重组蛋白组以及RGD-VEGI-192A嵌合蛋白组相比较于对照组，大血管数目变化不显著，血管分支明显减少，中小血管数目明显降低，说明两组蛋白均显著抑制新生血管生成，且主要抑制中、小血管的新生。同时，我们发现RGD-VEGI-192A嵌合蛋白组相比较于rhVEGI-192A重组蛋白组，大血管数目变化不显著，血管分支明显减少较多，中小血管数目明显降低较多，说明RGD-VEGI-192A嵌合蛋白组抑制新生血管生成的作用更强。

表1

^*P<0.05

表2

^*P<0.05

实施例10：RGD-VEGI-192A嵌合蛋白及rhVEGI-192A重组蛋白的体内抗肿瘤活性检测

对BALB/cA-nude裸鼠皮下接种人乳腺癌细胞MDA-MB 435，分别以20mg/kg剂量重组蛋白rhVEGI-192A以及RGD-VEGI-192A每3天腹腔注射给药一次，持续28天，观察并记录rhVEGI-192A以及RGD-VEGI-192A的体内抑瘤作用。体内抗肿瘤实验证明，同剂量的两种重组蛋白组，与对照组相比，具有明显的抑制肿瘤生长的作用，同时嵌合了RGD肽的VEGI-192蛋白表现出更高的体内抗肿瘤活性，并且差别有统计学意义。表3是重组蛋白rhVEGI-192A及RGD-VEGI-192A体内抑制肿瘤生长抑制率的数据方差分析。图12是本发明实施10例对BALB/cA-nude裸鼠皮下接种人乳腺癌细胞MDA-MB 435体内抗肿瘤活性检测中RGD-VEGI-192A嵌合蛋白及rhVEGI-192A重组蛋白对体内肿瘤生长抑制曲线。并且小鼠表征指标之一的体重随给药时间的变化并不明显，见图13，图13是对BALB/cA-nude裸鼠皮下接种人乳腺癌细胞MDA-MB 435体内抗肿瘤活性检测中小鼠体重随给药时间变化曲线图。初步提示在高剂量长期给药情况下，表现出毒性较低、安全性较高的特点。

表3

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

序列表

<110>中山大学

<120>人血管内皮细胞生长抑制因子RGD-VEGI-192嵌合重组多肽

<160>2

<210>1

<211>612

<212>cDNA

<213>人工序列

<220>

<221>

<222>

<223>

<400>1

<210>2

<211>203

<212>PRT

<213>人工序列

<400>2