一种改善红细胞变形性的复方中药有效部位及其制备方法

摘要

本发明公开了一种改善红细胞变形性的复方中药有效部位及其制备方法，其以六味地黄丸的中药复方为基础，采用醇提取法从熟地黄、山茱萸、牡丹皮、山药、茯苓和泽泻中提取得到的有效部位，该有效部位经初步实验证明：可改善红细胞变形性。将该有效部位用于改善红细胞变形性的药物或保健品的应用。本发明工艺简单，成本低，易于获得有效部位，适用于工业化生产，可用于制备成治疗亚健康人群红细胞形态改变的药物和保健品。

说明书

技术领域

本发明属医药技术领域，具体涉及一种以六味地黄丸的中药复方为基础的复合中药有效部位及其制备方法，该有效部位可应用于制备治疗亚健康人群红细胞形态改变的药物或保健品。

背景技术

六味地黄丸自钱乙创制以来，历代医家十分推崇此方，广泛应用于临床。此方收载于《中华人民共和国药典》2005年版，其组成为熟地黄160g、山茱萸(炙)80g、牡丹皮60g、山药80g、茯苓60g、泽泻60g六味中药。本方功效为滋阴补肾，用于肾阴亏损，头晕耳鸣，腰膝酸软，骨蒸潮热，盗汗遗精，消渴。此方配伍的特点是：三补三泻。熟地黄、山茱萸、山药为三味补药，牡丹皮、茯苓、泽泻为三味泻药。其中，熟地黄是君药，滋补肾阴为主；辅以山茱萸养肝肾，山药补益脾胃，二者同为臣药；又配以茯苓淡渗脾湿以助山药之益脾；泽泻清泄肾火，并放熟地黄之滋腻；牡丹皮清泄肝肾虚火，并制山茱萸之温热。本方配伍用药严谨，是为通补开合之代表方药。

六味地黄丸的中药复方为传统配方，现已有多种剂型用于临床，如浓缩丸[国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[Z].北京：化学工业出版社，2005：402)、(国家药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准(中药成方制剂，第11册)[S]，1996)]、颗粒剂[国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[Z].北京：化学工业出版社，2005：402)]、软胶囊[国家药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准(中药成方制剂，第13册)[S]，1998)]、口服液[张立庆，张春风.影响六味地黄丸口服液澄明度因素初探.[J]中草药，1999，30(12)：912]。虽然，近年来对六味地黄丸的制剂、质量控制方面的研究有了很多进展，但是对此方的其它方面如化学成分、药效学等的研究还不够深入，比如该方的多种药理作用的具体物质基础、活性成分或活性部位仍不清楚。再则，有关六味地黄丸的药效学研究主要集中在增强免疫功能、抗衰老、抗肿瘤及抗化疗药物毒副作用、降血糖、调解血脂、降血压等方面[周京燕、韩立新.六味地黄丸的现代研究与进展[J].中国药师，2008，11(6)：710]，而其对红细胞变形性的影响及其活性部位的研究尚未见文献报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种改善红细胞变形性的复方中药有效部位及其制备方法，其以六味地黄丸的中药复方为基础、采用醇提取法从熟地黄、山茱萸、牡丹皮、山药、茯苓和泽泻中提取得到的有效部位，该有效部位经初步实验证明：可改善红细胞变形性，将该有效部位用于改善红细胞变形性的药物或保健品的应用。

本发明所采用的技术方案是：

一种改善红细胞变形性的复方中药有效部位的制备方法，其具体步骤如下：

(1)取复方中药粉碎混合，放入超声提取罐中，用75％～95％的乙醇浸泡30min解吸，料液比1：1.5～2.0倍。将6～12倍体积60～100℃蒸馏水加入超声波提取罐中，超声提取二次，每次2min，过滤，超声功率为100～5400W。合并提取液，减压回收乙醇，提取液备用；所述复方中药中按重量比计各组分为熟地黄8～32、山茱萸4～16、牡丹皮3～12、山药4～16、茯苓3～12、泽泻3～16。

(2)取备用提取液，用乙酸乙酯溶液进行多级逆流萃取，合并萃取液，再用无水硫酸钠进行干燥后得到有效部位。所述乙酸乙酯溶液是指经过和水两相平衡后的溶液。

所述的制备方法，乙醇浓度优选为85％，提取时的料液比优选为为1：2。

所述的制备方法，萃取时的萃取条件优选为相比＝1：1，萃取时间5min，萃取pH值3，萃取温度为室温。

所述萃取步骤如下：①取6个分液漏斗，分别编号1、2、3、4、5、6；向1号分液漏斗中加入所得的提取液和乙酸乙酯溶液，摇匀，萃取5min后分相。萃取相为一级逆流萃取液，萃余相移至2号分液漏斗中。②向2号分液漏斗中加入新的乙酸乙酯溶液，萃取5min后分相。萃取相移至4号分液漏斗中，萃余相移至3号分液漏斗中。③再向3号分液漏斗中加入新的乙酸乙酯溶液和4号分液漏斗中加入新提取液。3号分液漏斗中分相后的萃取液移至5号分液漏斗中，萃余相为三级逆流萃取的萃余液。4号分液漏斗中分相后的萃取液为二级逆流萃取液，萃余相移至5号分液漏斗中。④5号分液漏斗中萃取分相后的萃取相移至6号分液漏斗中，萃余相为二级逆流萃余液。再向6号分液漏斗中加入新的提取液进行萃取，5min分相后萃取相为三级逆流萃取液，萃余相为一级逆流萃余液。合并上述各级萃取液，用无水硫酸钠干燥脱水，回收乙酸乙酯后得到有效部位。

本发明所提供的有效部位的药效学实验：①实验动物为健康Wistar系雄性大鼠，21月龄，体重480～620g，6月龄，体重220～280g。②红细胞变形性实验：受试药(六味地黄丸有效部位)溶于5％吐温80中。各组大鼠经口给予不同浓度的受试溶液，每天1次，给药7天，每组10只大鼠。对照组经口给予5％吐温80。末次给药1h后，戊巴比妥麻醉，颈动脉取血，抗凝处理后离心，用pH值7.35的PBS缓冲液洗涤3次，收集红细胞检测红细胞变形性。在DXC-400核孔滤膜红细胞变形能力测定仪上测定红细胞变形能力。结果，六味地黄丸有效部位可增强大鼠红细胞变形活性。

本发明工艺简单，成本低，易于获得有效部位，适用于工业化生产，可用于制备成治疗亚健康人群红细胞形态改变的药物和保健品。

具体实施方式

下面用实施例对本发明作进一步说明。

实施例

1、有效部位的制备

取熟地黄320g、山茱萸160g、牡丹皮120g、山药160g、茯苓120g、泽泻120g，共1kg组成复方药材，粉碎(40目)，放入超声提取罐中，用85％的乙醇浸泡30min解吸，料液比1：2。加入6倍体积80℃蒸馏水，超声提取二次，每次2min，过滤，超声功率为100W。合并两次提取液，减压回收乙醇，浓缩至500ml，调节pH值至3。将浓缩液用萃取剂已预处理的乙酸乙酯进行多级逆流萃取，操作过程如下：①取6个500ml分液漏斗，分别编号1、2、3、4、5、6；②向1号分液漏斗中加入250ml浓缩液和萃取剂乙酸乙酯，摇匀，萃取5min后分相。收集乙酸乙酯层，水层移至2号分液漏斗中。③向2号分液漏斗中加入新的乙酸乙酯，萃取5min后分相。乙酸乙酯相移至4号分液漏斗中，水层移至3号分液漏斗中。④再向3号分液漏斗中加入新的乙酸乙酯和4号分液漏斗中加入新浓缩液250ml，萃取5min后分相。3号分液漏斗中乙酸乙酯层移至5号分液漏斗中，水层为三级逆流萃取的萃余液，待检。4号分液漏斗中乙酸乙酯层收集，水层移至5号分液漏斗中。⑤5号分液漏斗中萃取5min分相后，收集乙酸乙酯层，水层移至6号分液漏斗中。再向6号分液漏斗中加入新的萃取液进行萃取，5min分相后，收集乙酸乙酯层，水层为三级逆流萃余液，待检。

合并上述收集的乙酸乙酯层，用无水硫酸钠脱水干燥，回收乙酸乙酯，得六味地黄丸有效部位1.15g。水层浓缩、烘干，得水层提取物148g。

2、有效部位的药效学实验

2.1、材料与方法

2.1.1 实验动物健康Wistar系雄性大鼠，21月龄，体重480～620g，随机分为5组，每组10只；6月龄组大鼠10只，体重220～280g，均由哈尔滨医科大学实验动物中心提供。

2.1.2 实验药物六味地黄丸的有效部位，经由上述实例1制得。临用时按动物与人体的每公斤体重剂量折算系数表配成适当的浓度，溶于5％吐温80中。水层提取物，同上。

2.1.3 实验方法

2.1.3.1 给药方法大鼠按体重灌胃给药，六味地黄丸有效部位高、低剂量组分别给予药物1.92mg/kg、0.48mg/kg(分别相当于成人临床丸剂日用量的2.0、0.5倍)，水层提取物组给予药物123.3mg/kg(与成人临床丸剂日用量相当)，对照组分别给予等量的生理盐水和5％吐温80溶液，每天1次。第8天在给药后1h后，用戊巴比妥麻醉，颈动脉取血，肝素20IU/ml抗凝，离心，进行红细胞制备。

2.1.3.2 红细胞悬浮液的配制取抗凝血1.5ml，3000r/min离心10min，吸出血浆和白细胞，用pH 7.35的PBS缓冲液洗涤3次，均离心去除上层液体。以上述缓冲液制备10％红细胞悬浊液。

2.1.3.3 红细胞变形能力测定用DXC-400核孔滤膜红细胞变形能力测定仪(上海医科大学仪器厂)测定红细胞变形能力。

2.1.3.4 滤过时间的测定红细胞悬浮液在37℃孵育条件下，取1ml红细胞悬浮液和PBS缓冲液分别置入红细胞变性能力测定仪中，测定滤过膜的时间t_B，t_S。

2.1.3.5 计算红细胞滤过指数红细胞滤过指数(IF)定义为，$\mathrm{IF}=\frac{t_B-\mathrm{ts}}{\mathrm{ts}}\times \frac{1}{\mathrm{Hct}},$红细胞变形性越差，通过滤孔越困难，其悬浮液滤过时间t_B越长，故滤过指数IF越大，表示红细胞变形能力越差。

3、实验结果

21月龄盐水组大鼠红细胞变性指数明显高于6月龄盐水组大鼠，经统计学处理，两者具有显著差异(P<0.01)。六味地黄丸有效部位高、低剂量组红细胞变性指数与21月龄盐水组大鼠比较具有显著性差异(P<0.01)。水层提取物组和21月龄吐温组红细胞变形指数与21月龄盐水组比较没有统计学差异(见表1)。

表1 六味地黄丸有效部位对大鼠红细胞变性指数的影响

注：与21月龄盐水组比较，^*P<0.05，^**P<0.01；与6月龄盐水组比较，^△P<0.05，^△△P<0.01；

4、结论

21月龄大鼠与6月龄大鼠比较红细胞变形能力显著下降。六味地黄丸有效部位高低剂量组对21月龄大鼠能够显著提高红细胞的变形能力。