包合物为电子媒介体纳米金葡萄糖氧化酶传感器制备方法

摘要

本发明涉及一种包合物为电子媒介体的纳米金葡萄糖氧化酶传感器制备方法。本发明将二茂铁与巯基环糊精在有机溶剂中搅拌反应，加入乙醇使反应物沉淀分离，无水乙醇清洗沉淀，干燥，得黄色包合物电子媒介体固体；将HAuCl

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物传感器，特别涉及一种包合物为电子媒介体的纳米金葡萄糖氧化酶传感器。

背景技术

生物酶的种类繁多，把酶固定在电极上可以制成各种各样的酶生物传感器来检测底物，如：葡萄糖、半乳糖、尿酸、肌氨酸、抗坏血酸、胆固醇等。目前达到实用水平已有200种以上，广泛用于生物、医药、化工等领域。

生物传感器由于具有操作简单、速度快、灵敏度高等特点显示出突出的优势。葡萄糖传感器是目前应用最广泛的生物传感器之一。葡萄糖是许多催化反应的中间或最终产物，因而葡萄糖浓度的在线检测对于控制反应进度非常重要，这在食品化学、生物化学、临床化学和环境化学等领域具有重要意义。电流型酶传感器是生物传感器领域中较灵敏的一种类型，其中尤以对葡萄糖测定的葡萄糖生物传感器研究得最为广泛。

在本发明之前，第一代酶传感器是采用酶的天然介体，以葡萄糖氧化酶为例，这种方法有局限性，响应信号与氧的分压或溶氧关系很大，而且通常利用的是生成的H₂O₂在电极上的电氧化的输出信号来指示底物浓度的，较大的工作电位会使其他活性物质氧化而造成干扰信号。因此根据这类电催化原理所制作的生物传感器具有背景电流大，响应特性差，易受环境中氧浓度的影响，干扰大等缺陷。

因而产生了第二代酶传感器。第二代酶传感器就是利用人为加入电子媒介来解决传递电子的问题，对于葡萄糖氧化酶修饰电极而言，电子传递介体(Med)的作用就是，把还原态葡萄糖氧化酶GOD(FADH₂)氧化，使之再生后循环使用，而Med本身被还原，还原态Med又在电极上被氧化。从上述原理可知，利用电子传递介体后，既不涉及O₂，也不涉及H₂O₂，而是利用具有较低氧化电位的Med_red在电极上产生的氧化电流对葡萄糖进行测定，从而避免了其它电活性物质的干扰，提高了测定的灵敏度和准确性。

对于第二代酶传感器存在的主要缺陷：

1.一般将电子转移媒介体直接与酶混合，滴涂在电极表面形成生物传感器。这种方法在使用过程中，电子转移媒介体很容易从电极表面流失，使得测定数据不稳定，使用寿命缩短，严重影响了传感器的实际应用。

2.通常采用高分子聚合物的方法将电子转移媒介体与酶直接聚合到电极表面，形成生物传感器。这种方法对酶的活性损伤较大，高分子聚合物自身的生物相容性差，导致电极使用寿命缩短，严重影响了传感器的实际应用。

3.还经常采用化学键合的方法将电子转移媒介体修饰到电极表面，此中方法需对电子转移媒介体进行进一步功能化，以获得功能性基团，实验过程往往比较复杂。

4.还有一种常用技术就是将电子转移媒介体直接放入待测溶液中，其主要缺陷是对生物样品有毒害，每次测定待测样品均需要加入一定量电子转移媒介体，它不能循环使用，且不适于特殊环境下特别是对活体检测的操作，不利于传感器的实际应用。

发明内容

本发明的目的就在于克服上述缺陷，设计、研制一种新的包合物为电子媒介体纳米金葡萄糖氧化酶传感器制备方法。

本发明的技术方案是：

包合物为电子媒介体纳米金葡萄糖氧化酶传感器制备方法，其主要技术步骤包括：

(1)包合物电子媒介体的合成：

将二茂铁与巯基环糊精在有机溶剂中反应，强力搅拌并在室温下反应；反应结束后，在反应液中加入乙醇，使反应物沉淀分离，用无水乙醇反复清洗沉淀，在真空烘箱中干燥，得黄色包合物电子媒介体固体；

(2)包合物电子媒介体修饰的纳米金的合成：

将HAuCl₄·4H₂O溶于DMF中，与另一溶有NaBH₄和步骤(1)中制备的包合物电子媒介体的DMF溶液迅速混合，出现大量黑色沉淀，然后在搅拌条件下继续反应，离心沉降，沉淀用DMF清洗以除去残留的超分子包合物；固体产物再用乙醇:水混合溶剂洗涤，60℃下真空干燥；

(3)包合物为电子媒介体纳米金葡萄糖氧化酶传感器的制备：

将步骤(2)中制备的包合物电子媒介体固体修饰的纳米金溶于二次水中，取葡萄糖氧化酶溶于二次水中形成酶溶液；将两溶液按照体积比为1:2-1:4进行混合，将混合液滴在铂圆盘电极表面，室温下干燥至快要干时，放在戊二醛的饱和蒸气中，即可得到包合物为电子媒介体的纳米金葡萄糖氧化酶传感器。

本发明的优点和效果在于采用超分子包合物的方法将电子媒介体固定在金纳米粒子表面，形成稳定的生物膜，提高电极的稳定性，从而可以应用于实际样品的检测。

用超分子包合物电子媒介体修饰纳米金复合材料制备的新型葡萄糖传感器具有响应快(5s)、灵敏度好(18.2mA·M^-1·cm^-2)、线性范围广(0.08-4mM)、检测下限低(15μM，S/N＝3)等特点。生物传感器显示了较高的抗干扰能力，归因于二茂铁降低了测量电位(0.25V)，减少了其他电活性物质的干扰。尤其是超分子电子媒介体在氧化还原态时在电极上具有高度的稳定性，连续使用50次后，响应电流无明显下降；电极保存在4℃左右冰箱中并间歇测量，30天后响应电流为初始电流的82％，显示其良好的工作寿命。该电极可直接应用于食品化学，生物化学、临床医学和环境化学等领域中葡萄糖的检测。

本发明的优越之处在下面将进一步进行阐述。

具体实施方式

以环糊精或杯芳烃等超分子主体化合物为基本材料，设计合成可在金属或非金属载体上修饰的超分子主体化合物的衍生物，并使其与具有非极性基团且可发生氧化还原反应的小分子客体相互作用，制备超分子包合物作为电子媒介体，再将其修饰到金属或非金属纳米载体上，与葡萄糖氧化酶一起组装到电极表面，制备具有较高稳定性的葡萄糖传感器。

具体步骤：

超分子包合物电子媒介体的合成：

将二茂铁与巯基环糊精在合适的有机溶剂如DMF中反应，强力搅拌并在室温下反应12至40小时；反应结束后，在反应液中加入50-100mL乙醇，使包合物电子媒介体沉淀，离心分离，用无水乙醇反复清洗沉淀，在真空烘箱中50℃干燥24h，得黄色超分子包合物固体。

二茂铁是带有非极性集团的电子媒介体，除了二茂铁，还可以用四硫富瓦烯、锇配合物；巯基环糊精是超分子主体化合物的衍生物，除此之外还可以是氨基环糊精，巯基杯芳烃，氨基杯芳烃等。

硼氢化钠法制备纳米金：

将50mgHAuCl₄·4H₂O溶于20mLDMF中，与另一20mL溶有75.5mg NaBH₄和100mg超分子包合物电子媒介体的DMF溶液迅速混合，随着反应时间的进行，体系颜色由浅红色转变为酒红色，最终呈现紫黑色，有大量黑色固体产生，然后在搅拌条件下继续反应12至40h，离心沉降，沉淀用DMF(4×50mL)清洗以除去残留的超分子包合物；固体产物再用50mL乙醇:水(9:1V/V)洗涤4次，60℃下真空干燥24h，备用。

将包合物电子媒介体修饰的纳米金溶于二次水中，浓度为10-100mg·mL^-1；取适量的葡萄糖氧化酶(GOD)溶于二次水中形成浓度为1.0-10.0mg·mL^-1的酶溶液；将两溶液按照体积比为(1:2-1:4)进行混合，将混合液滴在直径为0.5-2mm的铂圆盘电极表面，室温下自然干燥至快要干时，放在戊二醛的饱和蒸气中5-30分钟，得到包合物为电子媒介体的纳米金葡萄糖氧化酶传感器。制得的电极在磷酸缓冲溶液中浸泡5-20分钟并置于4℃的冰箱中保存备用。

本发明要解决的技术问题就是采用超分子包合物的方法将电子媒介体如二茂铁等固定在金纳米粒子表面，形成稳定的生物膜，提高电极的稳定性，可以应用中于实际样品的检测。